Summary
我们目前为农杆菌介导的病毒诱导的基因沉默（VIGS）棉花检测的详细协议。烟草脆裂病毒（TRV）派生的VIGS载体部署GrCLA1棉花，Cloroplastos alterados 1基因诱导RNA沉默。白化沉默GrCLA1引起的表型观察接种后2个星期内，在苗期。
Abstract
棉花（ 陆地棉 ）是全球最重要的农作物之一。分子育种新品种已相当大的努力。大规模基因功能分析棉花已经落后于最现代的植物物种，可能是由于其基因组，基因复制和多倍体，生长周期长和遗传转化 1顽抗的大尺寸。为了方便的高通量功能基因/基因棉花的研究，我们尝试发展快速，高效的瞬态分析评估棉花基因的功能。
病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一个强大的技术开发基于主机的转录后基因沉默（PTGS）抑制病毒增殖2,3。农杆菌介导的VIGS已被成功地应用在双子叶植物， 如茄科，拟南芥和豆科植物物种的广泛，单子叶植物物种，其中包括大麦，小麦和玉米， 各种功能基因组研究3,4。由于这种快速和有效的方法避免了厂房改造和克服的功能冗余，这是特别有吸引力，适合在作物品种，如棉花不适合转型功能基因组学研究。
在这项研究中，我们报告VIGS在棉花农杆菌介导的系统的详细协议。其中几种病毒的VIGS载体，烟草脆裂病毒（TRV）侵入的主机范围广，能够传遍整个工厂的大力尚未产生症状轻微的hosts5。要监视的沉默效率，GrCLA1 alterados 1基因棉花（AtCLA1），已被克隆，并插入到VIGS二进制向量pYL156。CLA1基因参与叶绿体发展 6，和以往的研究表明，拟南芥 Cloroplastos的同源基因， AtCLA1损失的功能，导致7片真叶白化病的表型，沉默效率提供了一个良好的视觉标记。 农杆菌浸润在大约两个星期后，白化病的表型开始出现片真叶，与100％，在所有实验复制的沉默效率。内源性基因表达的沉默，也证实了RT - PCR分析。值得注意的是，沉默potently可能发生在我们测试的所有品种，包括各种商业化种植的品种在得克萨斯州。这种快速，高效的的农杆菌介导的VIGS检测，提供了一个快速大规模的棉花全基因组水平的基因功能分析非常强大的工具。
Protocol
1。种植棉花幼苗
- 母猪的棉花（陆地棉）各种Fibermax 832 Phytogen 425RF，Phytogen 480WR和Deltapine 90盆（直径7厘米）含地铁混合700（SunGR，Beavile，WA）的种子。
- 盆保持在一个托盘用塑料圆顶覆盖23℃，120μE米-2小号-1光，在增长室12个小时的light/12小时黑暗的光照。
- 删除时，有两个子叶出现圆顶。
- 大约两个星期后，使用两个子叶完全展开VIGS检测的植物。在这个阶段，真叶尚未出现（图1）。
2。构筑VIGS载体GrCLA1基因
- 从G 的 cDNA文库扩增PCR与引物GrCLA1 - F，5' - GCCCTTTGTGCATCTTC - 3'和GrCLA1 - R，5' - CTCTAGGGGCATTGAAG - 3“Cloroplastos alterados 1基因棉花（GrCLA1）雷蒙德叶组织。
- 精华GrCLA1 的PCR产物用EcoRI和KpnI和pYL156（pTRV - RNA2的）载体中插入结扎。
- 屏幕含50μg/ mL的卡那霉素的LB琼脂板的克隆。经酶切和测序验证的构造。
- 转换成农杆菌 GV3101中的质粒，电，恢复LB液体培养基在28 ° C。选择与LB平板转化+卡那霉素（50微克/毫升）+庆大霉素（25微克/毫升）。这种细菌可以存储在25％甘油于-80 ° C长期使用。
3。执行VIGS接种
- 3天前接种，连胜携带pYL192（TRV）的农杆菌农杆菌冰冻甘油股票：RNA1，pYL156（TRV）：RNA2（矢量单独）和pYL156（TRV）：含50μg/ mL的卡那霉素的LB琼脂板RNA2 - GrCLA1和25微克/毫升庆大霉素。在28 ° C培养24小时的板块。
- 每个构造前两天VIGS渗透，挑单菌落从上述板块，到5毫升50微克/ mL的卡那霉素和庆大霉素25微克/毫升为辅的LB培养基接种;细菌培养成长28 ° C在50转的速度滚鼓过夜。
- 以上文化转移到烧瓶中，用50毫升LB培养基中补充50微克/毫升，卡那霉素和25微克/毫升庆大霉素，加10毫米的MES（2 - （4啉）乙烷磺酸）和20微米的乙酰丁香酮。增长在28 ° C为50转的速度在摇床过夜的文化。
- 翌日，降速5分钟在4000转农细菌细胞，再暂停的文化渗透缓冲液含10毫米10毫米氯化镁 2，MES和200μM乙酰丁香酮。文化的OD 600调整为1.5。
- 在板凳上3个小时保留在室温下的文化。
- 在此之前Agrobacterial渗透，拳打棉花植株子叶底面没有通过子叶刺入地下25针。挥拳打向一个或两个孔（取决于组织的柔软度），每个子叶节（图2）。
- pYL192 Agrobacterial文化悬架（TRV）：以1:1的比例混合RNA2 - GrCLA1;手渗透从子叶下方的混合物通过使用1伤人网站：RNA1和pYL156（TRV）：RNA2或pYL156（TRV） mL的无针注射器（图3）。
- 用塑料圆顶盖的植物，在昏暗的光线条件下离开一夜之间在室温下渗入植物。
- 转让植物的生长房间温度为23℃，120μE米-2 S与12个小时的光/ 12小时黑暗周期-1光。
注：VIGS的作品，无论是23 ° C或温室（25-28℃）下的植物。当温度相对较低（23至25 ° C），它是为接种容易，表型是更均匀相比，具有较高（28-30℃）或忽高忽低的温度。植物覆盖的圆顶，也使得VIGS更有效率。
- 检查在7〜8天的渗透沉默的表型。沉默植株片真叶pYL156（TRV）：RNA2 GrCLA1 开始显示白化病的表型（图4 ）。 Agrobacteria携带pYL156（TRV）：RNA2的渗入植物作为一个控制。
- 验证通过检查使用控制和沉默的棉花植株中分离出的RNA逆转录聚合酶链反应（RT - PCR检测）的内源性基因表达水平的基因沉默的效率。
注：应根据所载的检疫条件和植物保持VIGS - ED植物应妥善蒸压和后处理的实验，作为TRV具有广泛的宿主范围，是一项须予公布的病原体。
4。代表性的成果：
手渗透Agrobacterial混合后大约两个星期，GrCLA1 沉默所造成的白化的表现型上清楚地观察到真叶。沉默效率达到几乎100％在多个实验与超过50家工厂。沉默的植物显示上的新发展与镶嵌上的老叶子（图4）叶白化表型均匀分布和很强的。
图1与两个完全展开的子叶用于Agrobacterial渗透在棉花苗期约两个星期的老戏台。
图2。冲孔的棉花，用25 G针，以方便Agrobacterial渗透植物子叶下方的小孔。
图3。手伤人网站通过渗透到棉花子叶Agrobacterial混合使用无针注射器
图4。白化表型上出现了VIGS沉默棉花植株。四个品种。一）Fibermax 832;二）Phytogen 480WR，C）Phytogen 425RF，D）90 Deltapine。
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Discussion
VIGS已被证明是一个瞬时击倒内源性基因的表达，在功能基因组学分析的有力工具。在这项研究中，我们开发利用TRV -基于二进制向量农杆菌介导的VIGS。棉花CLA1（GrCLA1）基因作为一种视觉标记，监察沉默效率。我们一直得到100％的基因沉默的效率，表现出白化病的表型出现在所有品种的片真叶测试，大约两个星期后渗透开始。然而，CLA1沉默的棉花植株难以发展成纤维或种子阶段，这可能是由于叶绿体发展的强大的缺陷。棉花VIGS的成功发展提供了另一种随时利益丧失功能检测基因沉默，并规定对棉花功能基因/基因组学在快到后基因组时代8的基础。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢博士。 SP的Dinesh Kumar和尤尔刘TRV - VIGS载体，和Drs。查Kenerley，特里轮车，吉姆斯塔尔提供棉花种子和拜耳作物科学。这项工作是由NSF资助LS和NIH的PH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
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