Summary
We presenteren een protocol voor structurele en analyse van de samenstelling van natuurlijke orale biofilm van orthodontische apparatuur met
Abstract
Confocale laser scanning microscopie (CLSM) van natuurlijke heterogene biofilm wordt vergemakkelijkt vandaag door een uitgebreide reeks kleuren van technieken, een van hen is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). 1,2 We hebben een pilot-studie waarin orale biofilm monsters van vaste uitgevoerd orthodontische apparatuur (palatinale expanders) werden gekleurd door FISH, de doelstelling om de drie-dimensionale organisatie van de natuurlijke biofilm en plaque accumulatie te beoordelen. 3,4 FISH creëert een mogelijkheid om cellen vlek in hun eigen biofilm milieu door het gebruik van fluorescent gelabelde 16S rRNA-targeting sondes. 4-7,19 Vergeleken met alternatieve technieken, zoals immunofluorescentie etikettering, dit is een goedkope, nauwkeurige en eenvoudig etikettering techniek om verschillende bacteriële groepen te onderzoeken in gemengde biofilm consortia. 18,20 General probes werden gebruikt die binden aan Eubacteria ( EUB338 + + EUB338II EUB338III; hierna EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. Waren hierna LGCmix), 9,10 en Bacteroidetes (Bac303) 11 Daarnaast zijn specifieke probes binding aan Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 en Porphyromonas gingivalis (POGI) 13,14 gebruikt . De extreme hardheid van de betrokken oppervlakte materialen (roestvrij staal en acryl hars) dwong ons om nieuwe manieren van voorbereiding van de biofilm te vinden. Omdat deze oppervlakte-materialen kunnen niet gemakkelijk worden gesneden met een cryotome, werden verschillende bemonsteringsmethoden onderzocht om intact mondeling biofilm te verkrijgen. De meest werkbare van deze aanpak wordt gepresenteerd in deze mededeling. Kleine vlokken van de biofilm-dragende acrylhars werden afgeschraapt met een steriele scalpel, zorg ervoor dat u de biofilm-structuur beschadigen. Tang werden gebruikt om biofilm te verzamelen van de stalen oppervlakken. Eenmaal verzameld, werden de monsters vast en direct geplaatst op polysine gecoat glas dia's. FISH werd direct uitgevoerd op deze dia's met de sondes mentioned hierboven. Verschillende FISH protocollen werden gecombineerd en aangepast aan een nieuw protocol, dat was gemakkelijk te hanteren maken. 5,10,14,15 Vervolgens worden de monsters werden geanalyseerd door confocale laser scanning microscopie. Bekende configuraties 3,4,16,17 kan worden gevisualiseerd, waaronder champignon-achtige formaties en clusters van coccoid bacteriën doordrongen door kanalen. Daarnaast werden de bacteriële samenstelling van deze typische biofilm structuren geanalyseerd en 2D-en 3D-beelden gemaakt.
Protocol
1. Specimen collectie
- Verwijder de vaste palatinale expanders na 4 maanden van intraorale service. Gebruik NOLA Droog veld Systeem om de toestellen te isoleren voordat u ze (figuren 1 en 2).
- Gebruik gesteriliseerde tangen, handschoenen en trays te expanders te verwijderen zonder toevoeging van verontreiniging (figuren 3 en 4).
- Bewaar objecten in Sarstedt 120 ml flacons bij -20 ° C. Nemen om het laboratorium op het ijs en het proces binnen 24 uur.
2. Biofilm fixatie
- Schraap biofilm schilfers met een steriele scalpel, of het verzamelen stukken met steriel pincet.
- Voeg ijskoude 4% PFA-oplossing tot monster wordt goed gedekt.
- Incubeer dit mengsel bij +4 ° C (niet invriezen) gedurende 3 tot 12 uur. Langere fixatietijden of hogere temperaturen kunnen fixatie maken de cel enveloppen van gram-negatieve cellen minder doorlaatbaar voor oligonucleotideprobes.
- Verwijder de PFA oplossing en wassen met ijskoud 1X PBS. Herhaal deze stap 2-3 keer aan rerwijderen resterende PFA.
- Resuspendeer het monster in 1 vol. ijskoud 1X PBS en voeg 1 vol. ijskoude 96% (v / v) ethanol.
- Bewaar het monster bij -20 ° C. Monsters vastgesteld op basis van dit protocol kan worden opgeslagen voor enkele maanden tot jaren.
3. Uitdroging van vaste monsters
- Toe te passen 5-30 ul van PFA-vaste monstermateriaal op een objectglaasje.
- Droog bij 46 ° C voor ongeveer 15 minuten of bij kamertemperatuur langer. Ontdooi de lysozym en de formamide.
- Voeg 250 ul van lysozym (1mg/ml) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, waardoor het gemakkelijker penetratie van de sondes in de cellen door de gedeeltelijke vernietiging van de celwanden.
- Dip glijden in 50%, 80% en 96% (v / v) ethanol gedurende 3 minuten elk. Het uitdrogend effect van de concentratie ethanol serie zal desintegreren van de celmembranen.
- Droog de glaasjes op 46 ° C gedurende 10 minuten.
4. In-situ hybridisatie
- Bereid 1 mlverse hybridisatie buffer (zie tabel 1 voor de concentraties). Formamide concentraties die in deze studie: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) of 45% (LGCmix).
- Ontdooi de oligonucleotide probe-oplossingen. Ontdooide sondes worden bewaard op ijs en beschermd tegen licht.
- Voeg 2 pi van elke probe tot 200 ul van hybridisatie buffer, goed mengen en breng het mengsel op de gedroogde monster op een microscoopglaasje.
- Leg een stukje weefsel papier in een vierkant petrischaal en giet de rest van hybridisatie buffer op het weefsel papier.
- Onmiddellijk horizontaal plaatsen van de dia in de schotel en sluit de schotel. Incubeer in een oven op 46 ° C voor 1-5 uur (90 min volstaan in de meeste gevallen). De schotel fungeert als een vocht kamer het voorkomen van verdamping van hybridisatie-oplossing uit de dia. In het bijzonder kan de verdamping van formamide oorzaak niet-specifieke probe binding aan non-target cellen.
- Bereid 50 ml wasbuffer (zie tabel 2 voor concentrations). Bereid de wasbuffer in een 50 ml buis en verwarm tot 48 ° C in een waterbad. De wasstap wordt uitgevoerd bij 48 ° C.
- Haal de schotel met de dia in de hybridisatie oven. Onmiddellijk wassen uit de hybridisatie buffer met een klein volume van de voorverwarmde wasbuffer, en breng de dia in de resterende wasbuffer.
- Plaats de buis met het wassen buffer en de schuif terug in het waterbad en incubeer bij 48 ° C gedurende 10-15 minuten.
- Verwijder dia uit de tube en dip in de ijskoude DDH 2 O voor 2-3 seconden om de resterende wasbuffer te elimineren.
- De lucht drogen de schuif zo snel mogelijk (het gebruik van perslucht wordt aanbevolen). Sneldrogende zal verminderen sonde dissociatie.
- Gedroogde dia's kunnen worden opgeslagen in het donker bij -20 ° C gedurende enkele weken zonder een significant verlies van de probe-verleende fluorescentie-signaal.
5. Microscopie
- Na het FISH en wassen, apply twee druppels antifadent de buurt van de linker-en rechterzijde van een dia (bevroren plakjes moet worden opgewarmd tot kamertemperatuur voorafgaand aan deze stap).
- Plaats een microscoop dekglas op de top en wacht tot de antifadent heeft verspreid over de hele dia. Merk op dat een overmatige hoeveelheid antifadent kan de microscoop beeld vervagen.
- Let op de monsters onder een confocale laser scanning microscoop uitgerust met geschikte filters of lasers. We gebruikten een Leica TCS unit (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Gegevens kunnen worden geanalyseerd met software zoals IMARIS of AMIRA.
- Dia's zijn ingebed in antifadent kan worden opgeslagen bij +4 ° C (niet invriezen) tot 7 dagen voor de probe-verleende fluorescentie begint te dalen. Als alternatief kan de antifadent worden verwijderd met DDH 2 O, en de gedroogde dia's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C voor een langere periode van tijd.
6. Representatieve resultaten:
Schrapen biofilm off vaste orthodontische apparatuur (Figuur 5) geeft geschikt vlokken (Figuur 6), die direct kan worden gehybridiseerd op gecoat glas dia's voor microscopie. Op deze manier kunnen verschillende groepen orobiome bacteriën geïdentificeerd worden in hun natuurlijke driedimensionale omgeving door tagging bacteriële rRNA met verschillend gelabelde specifieke probes (figuren 7 en 8). In figuur 7 is biofilm gekleurd met EUBmix (groen, alle bacteriën) en LGCmix (geel, Firmicutes). Firmicutes in het groen, als ze waren gekleurd met geel en blauw. In Figuur 8, werd biofilm gekleurd met EUBmix (rood, alle bacteriën), Bac303 (blauw, Bacteroidetes) en POGI (geel, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis wordt weergegeven in geelachtig wit, omdat alle drie probes binden aan het DNA en de overlap van kleuren resulteert in een wit signaal. Morfologische verschillen tussen groepen van bacteriën kunnen ook worden geïdentificeerd (figuren 9 en 10). Grote clusters van coccoid bacteriën zijn weergegeven in Figuur 9, waar de kleuring werd uitgevoerd met EUBmix (groen, alle bacteria). Verschillende vormen van orale bacteriën werden gevisualiseerd in figuur 10, waar coccoid en filamenteuze bacteriën kunnen worden onderscheiden door kleuring met EUBmix (rood). Ook een typische paddestoel-achtige structuur van de biofilm kan worden verwerkt via de 3D-modellering van de CLSM gegevens (figuren 11 en 12) Klik hier voor een filmpje van de 3D-modellering te kijken.
Figuur 1. Fixed palatinale expander in situ.
Figuur 2. Nola Droog Field System.
Figuur 3. Gesteriliseerde tangen, handschoenen en een lade.
Figuur 4. Verwijderde expander.
Figuur 5. Afschrapen biofilm met een steriel scalpel.
Figuur 6. Resin vlokken direct gehybridiseerd op gecoat glas dia's.
Figuur 7 CLSM afbeelding:. Differentiatie van een specifieke bacteriële groep. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (groen, alle bacteriën) en LGCmix (geel, Firmicutes).
Figuur 8 CLSM afbeelding:. Differentiatie van een specifieke bacteriële groep. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (rood, alle bacteriën), Bac303 (blauw, Bacteroidetes) en POGI (geel, Porphyromonas gingivalis).
Figuur 9 CLSM afbeelding:. Differentiatie van specifieke morfologiën. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (groen, alle bacteriën). Grote clusters van coccoid bacteriën (pijlen).
. Figuur 10 CLSM foto's: differentiatie van specifieke morfologiën. 2D-overlay van 3D CLSM stack gegevens. Biofilm gekleurd met EUBmix (rood, alle bacteriën). Coccoid (pijl hieronder) en filamenteuze bacteriën (pijl boven) kan worden onderscheiden.
Figuur 11. Mushroom structuur, 3D-weergave van onderen. Stapels van biofilm vlokken (afgeschraapt het oppervlak van een orthodontische toestel), gekleurd met EUBmix en proceduresssed met IMARIS (CLSM beeld).
Figuur 12. Mushroom structuur, 3D-zijaanzicht. Stapels van biofilm vlokken (afgeschraapt het oppervlak van een orthodontische toestel) verwerkt met IMARIS (CLSM beeld).
| Hybridisatiebuffer (200 pi) | |||
| Formamide concentratie | 10% | 20% | 45% |
| 5 M NaCl | 36 | 36 | 36 |
| 1 M Tris-HCl | 4 | 4 | 4 |
| 2% SDS | 1 | 1 | 1 |
| FA | 20 | 40 | 90 |
| 138 | 118 | 68 | |
| Elke FISH probe | 2 | 2 | 2 |
Tabel 1. Bestanddelen van hybridisatie buffer (concentraties in pi).
| Wassen buffer (50 ml) | |||
| Formamide concentratie | 10% | 20% | 45% |
| 5 M NaCl | 4500 | 2150 | 300 |
| 1 M Tris-HCl | 1000 | 1000 | 1000 |
| 0,5 M EDTA | 0 | 500 | 500 |
| DDH 2 O | 44 500 | 46 350 48 200 | |
Tabel 2. Bestanddelen van wasbuffer (concentraties in pi).
Discussion
De beschreven protocol hierin is een zeer bruikbare benadering voor vlekken biofilms verzameld uit harde materialen. Bemonstering en hybridisatie zijn de meest kritische stappen. Tijdens de bemonstering, moet erop worden gelet dat de schijfjes van voldoende dikte worden verzameld om ervoor te zorgen dat de biofilm-structuur intact blijft. Tijdens de hybridisatie, is het essentieel om te grote temperatuurschommelingen te vermijden, zo te voorkomen niet-specifieke binding, of verlies van binding, van de fluorescent gelabelde probes. Deze vis protocol is een elegante methode om de normale heterogene biofilm vlek direct op glasplaatjes zonder verstoring van de samenstelling ervan. De dia's kunnen direct worden gebruikt voor microscopie, zonder de noodzaak om het monster te verplaatsen opnieuw. Op deze manier is een verbetering ten opzichte van kleuring in buizen bereikt met minder dwarskracht wordt toegepast op de biofilm. Slices> 50 urn dik kan worden voorbereid en onderzocht op deze manier.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Hygiene Fonds van de Medische Universiteit Graz. Alle proefpersonen gaven hun informed consent. Institutionele goedkeuring van de studie protocol werd verkregen van de Medische Universiteit Graz.
References
- Sunde, P. T. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth. Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).
- Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi. Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).
- Kolenbrander, P. E. Communication among oral bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).
- Zijnge, V. Oral biofilm architecture on natural teeth. PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).
- Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque. J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).
- Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. Bacterial interactions in dental biofilm development. J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).
- Jung, D. J. Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ. J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).
- Al-Ahmad, A. Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization. J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber. Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).
- Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).
- Diaz, P. I. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).
- Kolenbrander, P. E. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology. 42, 47-79 (2000).
- Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).
- Chalmers, N. I. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Wecke, J. A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets. FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).
- Moter, A., Gobel, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).
