Summary
我々は、と矯正装置から自然口腔バイオフィルムの構造と組成分析のためのプロトコルを提示
Abstract
自然の異種バイオフィルムの共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）は本日、そのうちの一つは、in situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光であること、染色技術の包括的な範囲によって促進される。1,2は、我々は、口腔バイオフィルムのサンプルは、固定から収集したパイロットスタディを実施矯正装置（口蓋パンダは）自然なバイオフィルムとプラークの蓄積の三次元組織を評価するという目的、FISHによって染色した。3,4 FISHが蛍光標識16Sを使用することにより、ネイティブのバイオフィルム環境で細胞を染色するための機会を作成するrRNAを標的とするプローブを。4-7,19は、免疫蛍光ラベルのような代替技術と比較すると、これは、混合バイオフィルムのコンソーシアムに異なる細菌のグループを調査するために安価な、正確でわかりやすい標識法である。18,20一般的なプローブが使用されていたその真正細菌に結合する（ EUB338 + EUB338II + EUB338III、以下EUBmix）、80〜10 Firmicutes（LGC354 AC;以下LGCmix）、9,10およびBacteroidetes（Bac303）さらに11、 ストレプトコッカスミュータンス （MUT590）12,13と病菌歯周への結合を特異的プローブ（POGI）13,14が使用された。関与する表面物質の極端な硬さは（ステンレスとアクリル樹脂）フィルムを準備する新しい方法を見つけるために私たちを強要。これらの表面の材料が容易にcryotomeで切断することができなかったとして、様々なサンプリング方法がそのまま口腔バイオフィルムを得るために検討された。これらのアプローチの最も有効なのは、この通信で表示されます。バイオフィルムを運ぶアクリル樹脂の小さなフレークは、バイオフィルムの構造を傷つけないように注意しながら、滅菌メスでこすり取った。鉗子は、鋼表面からバイオフィルムを収集するために使用された。が収集されると、サンプルは固定されており、polysineコーティングされたガラススライド上に直接配置されました。 FISHは、プローブのmで、これらのスライド上で直接実行され上記entioned。様々な魚のプロトコルは扱いやすくなった新しいプロトコルを作成するために結合し、変更されました。5,10,14,15その後試料は共焦点レーザー走査顕微鏡によって分析した。よく知られている構成は3,4,16,17は、チャネルによって浸透し球状の細菌のマッシュルームスタイルの形成およびクラスタなど、可視化することができます。さらに、これらの典型的なバイオフィルムの構造の細菌の組成を分析し、2Dと3D画像が作成されました。
Protocol
1。検体収集
- 口腔内のサービスの4ヶ月後に固定口蓋パンダを取り外します。 （図1および図2）、それらを削除する前にアプライアンスを分離するためにNOLAドライフィールドのシステムを使用してください。
- 汚染（図3と図4）を追加することなく、パンダを除去する滅菌ペンチ、手袋、トレーを使用してください。
- -20℃でザルスタット120ミリリットル瓶で保管してオブジェクト24時間以内に氷やプロセス上の実験室に連れて行く。
2。バイオフィルムの固定
- 滅菌メスでバイオフィルムフレークを削り取る、または滅菌ピンセットで作品を収集。
- サンプルが十分に覆われるまで氷冷4％PFA溶液を加える。
- 3〜12時間のために4 ° C（凍結しない）で混合物をインキュベートする。長い固定時間以上固定温度は、オリゴヌクレオチドプローブへの透過性が低いグラム陰性細胞の細胞エンベロープをレンダリングしてもよい。
- PFA溶液を除去し、氷冷した1 × PBSで洗浄する。 rにこの手順を2〜3回繰り返す残留PFAを残したまま削除する。
- 1巻のサンプルを再懸濁します。氷冷した1 × PBSと1容量を加える。氷冷96％（v / v）エタノール。
- -20℃でサンプルを保存するこのプロトコルに従って固定サンプルは、年に数ヶ月間保存することができます。
3。固定試料の脱水
- 顕微鏡スライドにPFA固定試料物質5〜30μlを適用します。
- 46で乾燥℃で約15分間以上室温で。リゾチームとホルムアミドを解凍。
- したがって、細胞壁の部分的な破壊によって細胞内へのプローブの浸透を促進する、10分間室温でリゾチーム（1mg/ml）250μlを添加する。
- 50％、3分ごとに80％、96％（v / v）エタノールに浸漬スライド。エタノールの濃度系列の脱水効果は、細胞膜を崩壊されます。
- ℃で10分間、46でスライドを乾燥させる。
（4） のin - situハイブリダイゼーション
- 1 mlの準備新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液（濃度は表1を参照）。本研究で使用したホルムアミド濃度：10％（EUBmix）、20％（Bac303、POGI、MUT590）または45％（LGCmix）。
- オリゴヌクレオチドプローブ溶液を融解。解凍したプローブは氷上で保存し、光から保護する必要があります。
- ハイブリダイゼーション緩衝液200μlに各プローブ2μl加え、よく混ぜ、顕微鏡スライド上に脱水試料に混合物を適用する。
- 正方形のペトリ皿にティッシュを一枚の紙を置き、ティッシュペーパーの上に残っているハイブリダイゼーション緩衝液を注ぐ。
- すぐに皿に水平にスライドを置き、皿を閉じます。 46℃で1〜5時間（90分、ほとんどのケースで十分です）のためにオーブンでインキュベートする。スライドからハイブリダイゼーション溶液の蒸発を防止する水分室など、料理機能。特に、ホルムアミドの蒸発は、非標的細胞への非特異的プローブを引き起こす可能性があります。
- （conceは表2を参照の洗浄バッファー50 mlを調製ntrations）。 48に50 mlチューブおよび予熱の洗浄バッファーを準備℃の水浴中。洗浄工程は48℃で行われ
- ハイブリダイゼーションオーブンからスライドして皿を取り外します。すぐに予め温めておいた洗浄液は少量でハイブリダイゼーション緩衝液を洗い流し、そして残りの洗浄バッファにスライドを移す。
- 10〜15分間48℃で水浴し、インキュベートに戻し、洗浄バッファとスライドを含むチューブを置きます。
- チューブからスライドを削除し、残留洗浄バッファーを除去するために2〜3秒間氷冷のddH 2 Oに手をつける。
- （圧縮空気の使用を推奨）可能な限り迅速にスライドを風乾する。速乾性は、プローブ解離が削減されます。
- 乾燥スライドはプローブ与え蛍光シグナルをあまり失うことなく、数週間のために-20℃で暗所に保存することができます。
5。顕微鏡検査
- FISHと洗浄後に、APPLスライドの左右の端（凍結切片を前にこのステップに室温に温める必要があります）にantifadent近いのy 2滴。
- 上に顕微鏡のカバーガラスを置き、antifadentはスライド全体に広がるまで待ちます。 antifadent量が過剰となり、顕微鏡の画像をぼかすことができることに注意してください。
- 適切なフィルターまたはレーザーを搭載した共焦点レーザー走査型顕微鏡で試料を観察。私たちは、ライカTCSユニット（; NA 1.2 HCX PL APO/63x）を使用。データは、IMARISやアミラなどのソフトウェアで解析することができます。
- プローブ与え蛍光が減少し始める前にantifadentに埋め込まれているスライドは、° C（凍結しない）までの7日間まで4で保存することができます。また、antifadentはのddH 2 Oを用いて削除することができます、そして乾燥させたスライドは、長時間にわたって-20℃で保存することができます。
6。代表的な結果：
（固定矯正装置からバイオフィルムを掻き図5）顕微鏡用コーティングガラススライド上に直接ハイブリダイズすることができる適切なフレーク（図6）が得られます。このように、orobiome細菌の異なるグループに異なる名前が付けられ、特定のプローブ（図7及び図8）とタギング細菌のリボソームRNAによって彼らの自然な三次元環境で識別することができます。図7においては、バイオフィルムはEUBmix（緑、すべての細菌）とLGCmix（黄色、Firmicutes）で染色した。彼らは、黄色とブルーで染色したとしてFirmicutesは、緑色で表示されます。図8では、バイオフィルムはEUBmix（赤、すべての細菌）、Bac303（青、Bacteroidetes）とPOGI（黄色、 ポルフィロ歯周 ）で染色した。すべての3つのプローブは、そのDNAと重複するバインドとしてポルフィロ歯周が 、黄白色で表示されます白信号での色の結果。細菌のグループとの間の形態的な違いは、（図9と図10）を同定することができます。球状の細菌の大規模なクラスタは、染色がEUBmix（緑、すべてのBAで実施された図9に示されていますcteria）。口腔内細菌の異なる形状は球状と糸状菌がEUBmix（赤）で染色することによって区別することができます図10に可視化した。また、バイオフィルムの典型的なキノコ状の構造がCLSMのデータの3Dモデリング（図11および12）を介して処理することができると、 3Dモデリングの映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。
図1は、。 場で口蓋エキスパンダーを修正しました。
図2。Nolaのドライフィールドシステム。
図3は、。ペンチ、手袋とトレイを滅菌。
図4削除パンダ。
図5。滅菌メスでバイオフィルムを掻き。
図6。樹脂フレークに直接コーティングされたガラススライド上にハイブリダイズさせた。
図7 CLSM像：特定の細菌群の分化。 3D CLSMのスタックデータの2Dオーバーレイ。バイオフィルムはEUBmix（緑、すべての細菌）とLGCmix（黄色、Firmicutes）で染色。
図8 CLSM像：特定の細菌群の分化。 3D CLSMのスタックデータの2Dオーバーレイ。 EUBmix（赤、すべての細菌）、Bac303（青、Bacteroiで染色したバイオフィルムdetes）とPOGI（黄色、 ポルフィロ歯周 ）。
図9 CLSM像：特定の形態の分化。 3D CLSMのスタックデータの2Dオーバーレイ。バイオフィルムはEUBmix（緑、すべての細菌）で染色。球状の細菌の大規模なクラスタ（矢印）。
図10 CLSM画像：特定の形態の分化。 3D CLSMのスタックデータの2Dオーバーレイ。バイオフィルムはEUBmix（赤、すべての細菌）で染色。球状（下矢印）と糸状菌（上記の矢印）を区別することができます。
図11。キノコの構造、下から3Dビュー。 EUBmixと手順で染色したバイオフィルムフレークのスタック（矯正装置の表面掻き）、IMARIS（CLSM像）とssed。
図12。キノコの構造、3D側面図。 IMARIS（CLSM像）で処理したバイオフィルムフレークのスタック（矯正装置の表面掻き）。
| ハイブリダイゼーション緩衝液（200μl） | |||
| ホルムアミド濃度 | 10パーセント | 20パーセント | 45パーセント |
| 5 M NaClを | 36 | 36 | 36 |
| 1 Mトリス塩酸 | 4 | 4 | 4 |
| 2％SDS | 1 | 1 | 1 |
| FA | 20 | 40 | 90 |
| 138 | 118 | 68 | |
| 任意のFISHプローブ | 2 | 2 | 2 |
表1。ハイブリダイゼーションバッファーの成分（μlの濃度）。
| 洗浄バッファー（50 ml）を | |||
| ホルムアミド濃度 | 10パーセント | 20パーセント | 45パーセント |
| 5 M NaClを | 4500 | 2150 | 300 |
| 1 Mトリス塩酸 | 1000年 | 1000年 | 1000年 |
| 0.5 M EDTA | 0 | 500 | 500 |
| のddH 2 O | 44 500 | 46 350 48 200 | |
表2。洗浄バッファーの成分（μlの濃度）。
Discussion
ここに記述されたプロトコルは、硬い材料から採取した染色のバイオフィルムへの高加工性アプローチです。サンプリングとハイブリダイゼーションは、最も重要なステップです。サンプリング時には、注意は十分な厚さのスライスがバイオフィルムの構造が損なわれないということを確実に収集されることを注意する必要があります。ハイブリダイゼーションの間に、それはこのように蛍光標識プローブの非特異的結合、または結合の損失を、避け、温度の過度の変動を避けるために不可欠です。このFISHプロトコルは、その組成を中断することなく、直接スライドガラス上に正常異種のバイオフィルムを染色するエレガントな方法です。スライドはすぐに再度サンプルを移動することなく、顕微鏡に使用することができます。このように、チューブ内の染色以上の改善がバイオフィルムに適用される以下のせん断力によって達成されます。 >50μm厚のスライスは、この方法で調製し、調べることができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、医科大学グラーツの衛生フォンによってサポートされていました。すべての被験者は、彼らのインフォームドコンセントを与えた。治験実施計画書の制度的承認は、医科大学グラーツから入手したものです。
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