Summary
हम प्राकृतिक मौखिक biofilm के orthodontic उपकरणों से संरचनात्मक और compositional विश्लेषण के साथ के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान
Protocol
1. नमूना संग्रह
- Intraoral सेवा के 4 महीने बाद तय तालु विस्तारक निकालें. उन्हें (आंकड़े 1 और 2) को हटाने से पहले उपकरणों को अलग Nola ड्राई फील्ड सिस्टम का प्रयोग करें.
- संदूषण (3 आंकड़े और 4) को जोड़ने के बिना विस्तारक हटायें निष्फल चिमटा, दस्ताने और ट्रे का उपयोग करें.
- Sarstedt 120 मिलीलीटर की शीशियों में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर वस्तुओं 24 घंटे के भीतर बर्फ और प्रक्रिया पर प्रयोगशाला के लिए ले लो.
2. Biofilm निर्धारण
- बंद एक बाँझ स्केलपेल के साथ biofilm गुच्छे परिमार्जन, या बाँझ संदंश के साथ टुकड़े इकट्ठा.
- ठंडा 4% पीएफए समाधान जोड़ें जब तक नमूना अच्छी तरह से कवर किया जाता है.
- 4 में मिश्रण सेते डिग्री सेल्सियस (3 से 12 घंटे के लिए स्थिर नहीं है). अब निर्धारण बार या उच्चतर निर्धारण तापमान ग्राम नकारात्मक कम oligonucleotide जांच करने के लिए पारगम्य कोशिकाओं के सेल लिफाफे प्रस्तुत करना सकता है.
- पीएफए समाधान निकालें और ठंडा 1X पीबीएस से धो. इस कदम के अनुसंधान के लिए 2-3 बार दोहराएँअवशिष्ट पीएफए emove.
- 1 Vol में नमूना Resuspend. बर्फ ठंड 1X पीबीएस और ऐड खंड 1. बर्फ ठंड 96% इथेनॉल (v / v).
- -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर इस प्रोटोकॉल के अनुसार तय नमूने साल के लिए कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
3. तय नमूने के निर्जलीकरण
- एक खुर्दबीन स्लाइड के लिए पीएफए तय नमूना सामग्री के 5-30 μl लागू करें.
- 46 में सूखी डिग्री सेल्सियस के बारे में 15 मिनट के लिए या अब के लिए कमरे के तापमान पर. Lysozyme और formamide पहले गला लें.
- 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर lysozyme (1mg/ml) के 250 μl जोड़ें, इस प्रकार की कोशिकाओं में सेल दीवारों का आंशिक विनाश द्वारा जांच के प्रवेश की सुविधा.
- 50%, 80% और 96% (v / v) 3 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल में डुबकी स्लाइड. इथेनॉल एकाग्रता श्रृंखला के dehydrating प्रभाव कोशिका झिल्ली बिखर जाएगा.
- 46 पर डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए स्लाइड्स सूखी.
4. स्वस्थानी संकरण में
- 1 मिलीलीटर तैयारताजा संकरण बफर (सांद्रता के लिए एक टेबल देखें). Formamide इस अध्ययन में इस्तेमाल सांद्रता: 10 (EUBmix)%, 20% (Bac303, POGI, MUT590) या 45% (LGCmix).
- Oligonucleotide जांच समाधान पहले गला लें. Thawed जांच बर्फ पर रखा जाना चाहिए और प्रकाश से रक्षा की.
- संकरण बफर के 200 μl प्रत्येक जांच के 2 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और निर्जलित नमूना एक खुर्दबीन स्लाइड पर मिश्रण लागू है.
- एक वर्ग पेट्री डिश में टिशू पेपर का एक टुकड़ा प्लेस और टिशू पेपर पर संकरण शेष बफर डालना.
- तुरंत स्लाइड क्षैतिज और पकवान में जगह पकवान बंद. एक ओवन में 46 डिग्री 1-5 घंटे (90 मिनट ज्यादातर मामलों में पर्याप्त होगा) के लिए सी सेते हैं. एक नमी चैम्बर के रूप में पकवान कार्यों स्लाइड से संकरण समाधान के वाष्पीकरण को रोकने. विशेष रूप से, formamide के वाष्पीकरण गैर विशिष्ट जांच गैर लक्ष्य की कोशिकाओं के लिए बाध्य हो सकता है.
- वाशिंग बफर के 50 मिलीलीटर की तैयारी (conce के लिए 2 टेबल देखें) ntrations. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और पहले से गरम में बफर धोने तैयार डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में 48. धोने कदम 48 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन
- पकवान स्लाइड के साथ संकरण ओवन से निकालें. तुरंत बंद पूर्व गर्म धोने बफर की एक छोटी मात्रा के साथ संकरण बफर धोने, और शेष धोने बफर में स्लाइड हस्तांतरण.
- बफर धोने और स्लाइड वापस पानी स्नान और सेते में 10-15 मिनट के लिए 48 ° सी में युक्त ट्यूब रखें.
- ट्यूब से स्लाइड निकालें और 2-3 अवशिष्ट बफर धोने खत्म करने के सेकंड के लिए बर्फ ठंड DDH 2 हे में डुबकी .
- एयर शुष्क रूप में जल्दी संभव स्लाइड (संपीड़ित हवा का उपयोग की सिफारिश की है). फास्ट सुखाने जांच हदबंदी कम हो जाएगा.
- सूखे स्लाइड्स अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है महत्वपूर्ण नुकसान बिना जांच - प्रदत्त प्रतिदीप्ति संकेत के कई हफ्तों के लिए.
5. माइक्रोस्कोपी
- के बाद मछली और कपड़े धोने, apply एक स्लाइड के बाएँ और दाएँ समाप्त होता है (जमे हुए स्लाइस कमरे के तापमान को गर्म किया जाना चाहिए इस कदम से पहले) antifadent पास के दो बूँदें.
- एक खुर्दबीन के कवर निकालें. शीर्ष पर पर्ची और इंतजार जब तक antifadent पूरे स्लाइड पर फैल गया है. ध्यान दें कि antifadent का एक अत्यधिक राशि माइक्रोस्कोप छवि धुंधला कर सकते हैं.
- एक लेजर confocal स्कैनिंग उपयुक्त फिल्टर या लेज़रों के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के तहत नमूने को देखो. हम एक Leica टीसीएस इकाई (; NA 1.2 HCX पीएल APO/63x) का इस्तेमाल किया. डेटा IMARIS या Amira जैसे सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया जा सकता है.
- Antifadent में एम्बेडेड स्लाइड चार पर संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस (फ्रीज) नहीं करने के लिए 7 दिनों के लिए पहले जांच - प्रदत्त प्रतिदीप्ति में गिरावट शुरू होता है. वैकल्पिक रूप से, antifadent DDH 2 हे के साथ हटाया जा सकता है, और सूखे स्लाइड्स -20 डिग्री सेल्सियस पर समय की एक विस्तारित अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
तय orthodontic उपकरणों बंद scraping biofilm (चित्रा 5) पैदावार उपयुक्त गुच्छे (चित्रा 6) है कि माइक्रोस्कोपी के लिए लेपित गिलास स्लाइड पर सीधे संकरित कर सकते हैं. इस तरह, orobiome बैक्टीरिया के विभिन्न समूहों को अलग विशिष्ट जांच लेबल (आंकड़े 7 और 8) के साथ टैगिंग बैक्टीरियल rRNA द्वारा उनके प्राकृतिक तीन आयामी वातावरण में पहचाना जा सकता है. 7 चित्रा में, biofilm (हरे, सभी बैक्टीरिया) EUBmix और LGCmix (पीला, Firmicutes) के साथ दाग था. Firmicutes हरे रंग में दिखाई देते हैं, के रूप में वे पीले और नीले रंग के साथ दाग थे. चित्रा 8 में, biofilm EUBmix (लाल, सभी बैक्टीरिया), Bac303 (नीले, Bacteroidetes) और POGI (पीला, Porphyromonas gingivalis) के साथ दाग Porphyromonas gingivalis पीले रंग सफेद में दिखाया गया है, के रूप में सभी तीन जांच अपने डीएनए और ओवरलैप करने के लिए बाध्य. एक सफेद संकेत में रंग परिणामों की. बैक्टीरिया के समूहों के बीच morphological अंतर को भी पहचाना जा सकता है (9 और 10 के आंकड़े). गोलाणुवत् बैक्टीरिया के बड़े समूहों 9 चित्रा, जहां धुंधला EUBmix के साथ प्रदर्शन किया गया था में दिखाए जाते हैं (हरे, सभी बाcteria). मौखिक जीवाणुओं की विभिन्न आकृतियों 10 चित्रा, जहां गोलाणुवत् और filamentous बैक्टीरिया EUBmix (लाल) के साथ धुंधला हो जाना द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है है में visualized थे. इसके अलावा, biofilm की एक विशिष्ट मशरूम की तरह संरचना CLSM डेटा के 3D मॉडलिंग (11 और 12 के आंकड़े) के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है है यहाँ 3 डी मॉडलिंग की एक फिल्म देखने के लिए क्लिक करें.
चित्रा 1 बगल में निश्चित तालु विस्तारक.
चित्रा 2 Nola ड्राई फील्ड सिस्टम.
Figure 3. सरौता, दस्ताने, और ट्रे निष्फल .
चित्रा 4 विस्तारक हटाया.
5 चित्रा एक बाँझ स्केलपेल के साथ biofilm scraping .
चित्रा 6 राल गुच्छे लेपित गिलास स्लाइड पर संकरित हैं .
7 चित्रा CLSM छवि: एक विशिष्ट जीवाणु समूह के भेदभाव. 3D CLSM ढेर डेटा की 2D उपरिशायी. Biofilm (हरे, सभी बैक्टीरिया) EUBmix और LGCmix (पीला, Firmicutes) के साथ दाग.
8 चित्रा CLSM छवि: एक विशिष्ट जीवाणु समूह के भेदभाव. 3D CLSM ढेर डेटा की 2D उपरिशायी. EUBmix (लाल, सभी बैक्टीरिया), Bac303 (नीले, Bacteroi के साथ biofilm दाग) detes और POGI (पीला, Porphyromonas gingivalis).
9 चित्रा CLSM छवि: विशिष्ट morphologies के भेदभाव. 3D CLSM ढेर डेटा की 2D उपरिशायी. Biofilm EUBmix (हरे, सभी बैक्टीरिया) के साथ दाग. गोलाणुवत् बैक्टीरिया के बड़े समूहों (तीर).
विशिष्ट morphologies के भेदभाव: 10 चित्रा CLSM छवियों. 3D CLSM ढेर डेटा की 2D उपरिशायी. Biofilm EUBmix (लाल, सभी बैक्टीरिया) के साथ दाग. गोलाणुवत् (नीचे तीर) और filamentous बैक्टीरिया (ऊपर तीर) प्रतिष्ठित किया जा सकता है.
11 चित्रा. मशरूम संरचना, नीचे से 3 डी दृश्य . Biofilm (एक orthodontic उपकरण के सतह बंद scraped) के गुच्छे, EUBmix और प्रक्रिया के साथ दाग के ढेरIMARIS (CLSM छवि) के साथ ssed.
12 चित्रा. मशरूम संरचना, 3 डी की ओर देखने . Biofilm (एक orthodontic उपकरण के सतह बंद scraped) गुच्छे IMARIS (CLSM छवि) के साथ कार्रवाई के ढेर.
| संकरण बफर (200 μl) | |||
| Formamide एकाग्रता | 10% | 20% | 45% |
| 5 एम NaCl | 36 | 36 | 36 |
| 1 Tris - एचसीएल एम | 4 | 4 | 4 |
| 2% एसडीएस | 1 | 1 | 1 |
| एफए | 20 | 40 | 90 |
| 138 | 118 | 68 | |
| किसी भी मछली जांच | 2 | 2 | 2 |
तालिका 1. संकरण बफर के संघटक (μl में सांद्रता).
| वॉशिंग बफर (50 मिलीलीटर) | |||
| Formamide एकाग्रता | 10% | 20% | 45% |
| 5 एम NaCl | 4500 | 2150 | 300 |
| 1 Tris - एचसीएल एम | 1000 | 1000 | 1000 |
| 0.5 एम EDTA | 0 | 500 | 500 |
| DDH 2 हे | 44 500 | 46 350 48 200 | |
तालिका 2 वाशिंग बफर के संघटक (μl में सांद्रता).
मूवी 1. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
Discussion
प्रोटोकॉल में वर्णित इस के साथ साथ धुंधला हो जाना मुश्किल सामग्री से एकत्र biofilms के लिए एक अत्यधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण है. नमूनाकरण और संकरण सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. नमूने के दौरान ख्याल रखा जा सकता है कि पर्याप्त मोटाई के स्लाइस करने के लिए सुनिश्चित करें कि biofilm संरचना बरकरार एकत्र कर रहे हैं. संकरण के दौरान, यह तापमान में अत्यधिक उतार - चढ़ाव से बचने के लिए आवश्यक है, इस प्रकार गैर विशिष्ट बंधन, या fluorescently लेबल जांच के बंधन के नुकसान से बचने. यह मछली एक सुरुचिपूर्ण विधि गिलास स्लाइड पर सीधे इसकी संरचना में खलल न डालें बिना सामान्य विषम biofilm दाग प्रोटोकॉल है. स्लाइड्स तुरंत एक नमूना एक बार फिर से आगे की जरूरत के बिना माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तरह, ट्यूबों में धुंधला पर एक सुधार biofilm के लिए लागू किया जा रहा है कम कतरनी बल द्वारा हासिल की है. > 50 सुक्ष्ममापी मोटी स्लाइसें और तैयार किया जा सकता है इस फैशन में जांच की.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम चिकित्सा विश्वविद्यालय ग्राज़ स्वच्छता Fonds द्वारा समर्थित किया गया. सभी विषयों में उनकी सूचित सहमति दे दी है. अध्ययन प्रोटोकॉल के संस्थागत अनुमोदन चिकित्सा विश्वविद्यालय ग्राज़ से प्राप्त हुई थी.
References
- Sunde, P. T. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth. Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).
- Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi. Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).
- Kolenbrander, P. E.
- Zijnge, V. Oral biofilm architecture on natural teeth. PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).
- Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque. J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).
- Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. Bacterial interactions in dental biofilm development. J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).
- Jung, D. J. Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ. J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).
- Al-Ahmad, A. Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization. J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).
- Bryers, J. D.
- Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber. Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).
- Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).
- Diaz, P. I. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).
- Kolenbrander, P. E. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology. 42, 47-79 (2000).
- Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).
- Chalmers, N. I. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Wecke, J. A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets. FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).
- Moter, A., Gobel, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).
