Summary
La córnea es la única que carece de los tejidos vasculares. Sin embargo, el fuerte crecimiento de los vasos sanguíneos y la supervivencia puede ser inducida en la córnea por potentes factores angiogénicos. Por lo tanto, la córnea puede dar con nosotros en una herramienta valiosa para los estudios de angiogénesis. Este protocolo muestra cómo realizar el modelo de ratón de ensayo de córnea bolsillo y la forma de evaluar la angiogénesis inducida por factores angiogénicos utilizando este modelo.
Abstract
Una córnea normal es clara de los tejidos vasculares. Sin embargo, los vasos sanguíneos pueden ser inducidas a crecer y sobrevivir en la córnea cuando potentes factores angiogénicos son administrados 1. Esta singularidad ha hecho el ensayo de bolsillo córnea uno de los modelos más utilizados para los estudios de la angiogénesis. La córnea compone de múltiples capas de células. Por tanto, es posible incluir una pastilla que contiene el factor angiogénico de interés en la córnea para investigar su efecto angiogénico 2,3. Aquí, le ofrecemos una demostración paso a paso de cómo (I) producir el factor angiogénico que contienen gránulos (II) incorporar la pastilla en la córnea (III) analizar la angiogénesis inducida por el factor angiogénico de interés. Ya que el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) es conocido como uno de los factores angiogénicos más potentes 4, aquí se utiliza para inducir la angiogénesis en la córnea.
Protocol
Todos los equipos y los reactivos utilizados son estériles. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión (ACUC) en el NEI / NIH (protocolo de estudio en animales NEI-553), y se realizó de acuerdo a las directrices del NIH y los reglamentos.
1. La producción de la angiogénesis que contiene el factor de pellets
En esta parte, las pastillas que contienen el factor angiogénico de interés están preparados.
- Hacer el 10% (w / v) sucralfato con PBS. Almacenar a temperatura ambiente.
- Hacer el 12% (w / v) de poli-HEMA con etanol absoluto. Almacenar a temperatura ambiente.
- Hacer 1 mg / l solución de bFGF. Tienda de -80 ° C.
- Para hacer 50 bolitas, mezclar 5 l de poli-HEMA, 1μl de sucralfato y 4 l de solución madre bFGF, vórtice a fondo.
- Coloque un trozo de parafina limpia en una placa Petri, se exponen a la luz ultravioleta durante 15 minutos en una campana de cultivo de tejidos. Caída de 0,2 l de la mezcla de solución en la parafina de una pastilla. Por lo tanto, 10 l de la mezcla de solución debe producir 50 pastillas. Deje que las pastillas seco a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Los gránulos secos se pueden almacenar en 4 ° C durante varios días, o -80 º C durante varios meses.
- Al uso, palanca y recoger las bolitas con la punta de un par de pinzas. Tenga mucho cuidado de no romper o hacer que la primavera de distancia.
2. Realización de la córnea del ratón ensayo de bolsillo
En esta parte, vamos a demostrar cómo hacer un bolsillo en la córnea del ratón, y cómo insertar una pastilla en el bolsillo. El factor angiogénico contenidas en el sedimento se dará a conocer poco a poco a los alrededores de la córnea (Fig. 1). En esta demostración, el uso de 8 semanas hembras C57/Bl6 ratones.
- El ratón está profundamente anestesiados de forma sistemática con la mezcla de ketamina (75 mg / kg) y xilazina (5 miligramos por kilogramo, la inyección ip). Esto evitará que el ratón en un estado de anestesia durante 30-60 min. Anestesia tópica (0,5% proparacaína HCl) se aplica a la córnea. Después de 5 minutos, fijar un ojo con un microscopio de disección.
- Un corte muy suave se hace en el centro de la córnea 1,2 -1,4 mm del limbo corneal (como se ilustra en la Figura 1) con un cuchillo de von Graefe cataratas. Tenga mucho cuidado de no cortar a través de la córnea.
- Un bolsillo se hace bajo la capa del epitelio de la córnea horizontal insertando el cuchillo en el centro de la córnea y la ampliación del cuchillo hacia el cuidado del limbo (Fig. 1). El tamaño de la bolsa tiene que ser lo suficientemente grande para dar cabida a uno de los factores angiogénicos que contienen pellets. Tenga mucho cuidado de no perforar a través de la córnea.
- Introduzca una pastilla con un par de pinzas en el bolsillo poco a poco. Trate de hacer que la pastilla lo más plana posible.
- Después de la implantación de la pastilla, un ungüento oftálmico antibiótico tópico se aplica en los ojos. Los instrumentos se limpian con algodón con alcohol al 70% entre los animales.
- Mueve el ratón a un lugar caliente y seco y el monitor, hasta que es capaz de mantener una postura erguida y luego devolverlo a su jaula. Los analgésicos sistémicos (por ejemplo, la buprenorfina, 2 mg / kg, la inyección ip) y una pomada tópica con antibióticos (por ejemplo, gentamicina) se dan dos veces al día durante 2 días después de la cirugía y el ratón es de cerca de 3 días. Se espera que la curación completa dentro de las primeras 48 horas después de la cirugía. El ojo con el bolsillo se examina con un alcance con lámpara de hendidura biomicro entre los días 4-10 después de la implantación de pellets.
3. Los resultados representativos
- Siete días después de la implantación de pellets, el ratón se anestesia sistémica y tópica como se describe en 2.1.
- Observar los vasos sanguíneos en la córnea inducidos por el factor angiogénico bajo un microscopio de disección. En la córnea tratados con vehículo, no el crecimiento de los vasos sanguíneos se puede observar (Fig. 2A, tratadas con vehículo córnea). En la córnea tratados con bFGF, la angiogénesis robusta se puede ver (Fig. 2B). El crecimiento de vasos sanguíneos pueden ser evaluados utilizando la longitud máxima de los vasos sanguíneos (de los vasos normales del limbo a la parte superior de los nuevos vasos), y las áreas de vaso sanguíneo total (Fig. 2B, delineado con una línea discontinua de color rojo en el bFGF tratados con la córnea). Otros métodos de cuantificación también se han descrito 2,5.
Figura 1. Una córnea. Normales con tinción H & E. No existe en los vasos sanguíneos de una córnea normal. B. Hacer un bolsillo debajo de la capa del epitelio de la córnea. C. Insertar una bolita en el bolsillo. D. El factor angiogénico se libera de la pastilla, y forman nuevos vasos sanguíneos de los vasos límbicos normal.
Figura 2. Resultado Representante cinco días después de implantación de la pastilla. A. Córnea con una pastilla que contiene el único vehículo. No hay sangre nueva formación de vasos en la córnea. Sólo los vasos preexistentes limbal normales son visibles. B. Córnea con una pastilla que contiene bFGF. Robusta nuevos vasos sanguíneos (punto-alineados) creció desde el pre-existentes vasos límbicos normal.
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Discussion
La córnea del ratón de bolsillo modelo de ensayo fue descrito por primera vez en 1979 por Muthukkaruppan VR y Auerbach R 6. Protocolos detallados han sido publicados por diferentes laboratorios 2,3,7,8. Nuestro laboratorio ha modificado y utilizado este método en nuestros estudios durante muchos años 4. La córnea del ratón ensayo de bolsillo es un modelo relativamente simple, con una gran reproducibilidad. Otra ventaja de este modelo es que ya que la córnea normalmente no tiene vasos sanguíneos, hay cantidad mínima de fondo en este ensayo. Por lo tanto, este modelo es comúnmente utilizada por el campo para estudiar el efecto angiogénico de los diferentes factores y moléculas. En comparación con los ojos de algunos animales más grandes, como las ratas y los conejos, los ojos del ratón son más pequeñas y difíciles de manejar. Especial cuidado se requiere por lo tanto, al realizar este modelo, especialmente durante los procesos de toma de la bolsa en la córnea y la inserción de la pastilla. El cuchillo debe ser manejado de una manera controlada con precisión para que no se perfore la córnea.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nuestra investigación es apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIH, el Instituto Nacional del Ojo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
