Summary
Kornea vasküler dokularda yoksun olduğunu eşsizdir. Ancak, güçlü bir anjiyojenik faktörler tarafından güçlü bir kan damarı büyümesi ve hayatta kalma kornea uyarılabilir. Bu nedenle, kornea bizimle anjiyogenik çalışmalar için değerli bir araç sağlayabilir. Bu protokol, kornea cep tahlil ve nasıl anjiyogenik faktörleri kullanarak bu model ile indüklenen anjiyogenez değerlendirmek için fare modeli gerçekleştirmek için nasıl kullanılacağını gösterir.
Abstract
Normal kornea vasküler dokuların açıktır. Ancak, kan damarları, büyümek ve hayatta kalmak için güçlü anjiogenik faktörler 1 yönetilmektedir kornea uyarılabilir . Bu teklik kornea cep tahlil anjiyogenez çalışmalar için en çok kullanılan modeller biri yaptı. Kornea hücrelerinin çoklu katmanlar oluşturur. Bu nedenle, anjiyogenik etkisi 2,3 araştırmak için kornea ilgi anjiogenik faktör içeren bir pelet gömmek mümkündür. Burada, (I) anjiogenik faktör içeren pelet (II) (III) ilgi anjiogenik faktör tarafından tetiklenen anjiyogenez analiz pelet kornea içine gömün üretmek için nasıl bir adım adım gösteri sağlar. Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), en güçlü anjiogenik faktörler 4 biri olarak bilindiğinden, korneada anjiyogenez ikna etmek için kullanılır .
Protocol
Kullanılan tüm ekipmanların ve reaktifler sterildir. Hayvan Bakım protokol tarafından onaylanmış ve NEI / NIH Komitesi (ACUC) kullanın (hayvan çalışması protokol NEI-553), ve Ulusal Sağlık Enstitüsü, kurallar ve düzenlemelere göre yapıldı.
1. Anjiogenik faktör içeren pelet üretimi
Bu bölümde, faiz anjiogenik faktör içeren pelet hazırlanmıştır.
- % 10 (w / v) PBS ile sukralfat çözümü olun. Oda sıcaklığında saklayın.
- % 12 (w / v) mutlak etanol ile poli-HEMA olun. Oda sıcaklığında saklayın.
- 1 mcg / ml bFGF çözüm olun. -80 ° C saklayın
- 50 pelet yapmak için, poli-HEMA sukralfat ve bFGF stok solüsyonu 4 ul 1μl 5 ul, vorteks iyice karıştırın.
- Petri kabı temiz parafilm bir parçası koyun, bir doku kültürü kaputu 15 dakika UV ışık altında bırakmayın. 0.2 ul çözüm karışımı bir pelet parafilm bırakın. Böylece, çözüm karışımı 10 ul 50 pelet verim gerekir. Oda sıcaklığında 1-2 saat pelet kurumasını bekleyin. Kuru pelet ° C'de birkaç ay, birkaç gün ya da -80 4 oC saklanabilir.
- Kullanımı üzerine, kaldıraç ve forseps bir çift ipuçları pelet pick up. Onları kırmak ya da onları uzakta bahar yapmak için son derece dikkatli olun.
2. Fare kornea cebine tahlil yapılması
Bu bölümde, cebine bir pelet eklemek için nasıl bir cep fare kornea nasıl göstermek ve olacaktır. Pelet bulunan anjiogenik faktör kornea çevresindeki alanlarda (Şekil 1) yavaş yavaş piyasaya sürülecek. Bu gösteri, biz 8 haftalık dişi C57/Bl6 fareler kullanın.
- Fare derin sistematik ketamin (75 mg / kg) ve xylazine (5mg/kg, ip enjeksiyon) karışımı ile anestezi. Bu 30-60 dakika süreyle fare anestezi bir devlet çatısı altında devam edecek. Topikal anestezik (% 0.5 proparacaine HCl) kornea uygulanır. 5 dakika sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında bir göz düzeltme.
- Von Graefe katarakt bıçakla kornea limbus (Şekil 1'de gösterildiği gibi) kornea 1.2 -1.4 mm ortasında çok nazik bir kesim yapılır. Kornea kesmek için son derece dikkatli olun.
- Bir cep korneanın ortasına bıçağı yatay olarak takılması ve limbus dikkatli bir şekilde (Şekil 1) doğru uzanan bıçak kornea epitel tabakası altında yapılır. Cep boyutu bir anjiogenik faktör içeren pelet karşılamak için yeterince büyük olması gerekir. Ponksiyon yoluyla kornea değil son derece dikkatli olun.
- Forseps yavaşça cebine bir çift ile bir pelet yerleştirin. Mümkün olduğunca düz olarak pelet yapmaya çalışın.
- Pellet implantasyonu sonra, topikal oftalmik antibiyotikli merhem göze uygulanır. Cihazlar hayvanlar arasında% 70 alkol pedleri ile silinir.
- Dik bir duruş korumak ve daha sonra kendi ev kafesine geri kadar sıcak ve kuru bir alana taşıyın ve izlemek. Sistemik analjezikler (örneğin, buprenorfin, 2 mg / kg, ip enjeksiyon) ve topikal antibiyotikli merhem (ör: gentamisin), ameliyat sonrası 2 gün boyunca günde iki defa verilir ve fare 3 gün boyunca yakından takip edilmektedir. Şifa-cerrahi sonrası ilk 48 saat içinde tamamlanması bekleniyor. Cepli göz pelet implantasyon sonra 4-10 gün arasında bir yarık lamba biomicro kapsamında ele alınacaktır.
3. Temsilcisi sonuçları
- Pelet implantasyon Yedi gün sonra, fare, sistemik ve topikal olarak 2.1 'de açıklandığı gibi anestezi.
- Diseksiyon mikroskop altında anjiogenik faktör tarafından indüklenen kornea kan damarları uyun. Araç ile tedavi kornea, kan damarı büyümesi (Şekil 2A, araç-tedavi kornea) görülebilir. BFGF ile tedavi kornea, sağlam anjiyogenez (Şekil 2B) görülebilir. Kan damarı büyümesi, kan damarları (yeni gemiler üst normal limbal damarları), ve toplam kan damarı alanları (Şekil 2B, bFGF kırmızı bir kesik çizgi ile tasvir maksimum uzunluğu kullanılarak değerlendirildi. ) kornea tedavi. Diğer kantifikasyon yöntemleri de 2,5 tarif edilmiştir.
Şekil 1. H & E boyama ile Normal kornea. Kan damarı yok, normal bir kornea bulunan B . , Kornea C epitel tabakası altında bir cep olun . Cebine bir pelet Embed D. Anjiogenik faktör pelet yayımlanan ve yeni kan damarlarının normal limbal damarlar büyür.
Şekil 2 im beş gün sonra Temsilcisi sonucupelet plantasyon. Sadece araç içeren bir pelet Kornea. Kornea yok yeni kan damarları oluşumu. Sadece önceden varolan normal limbal damarları görünür. B. Kornea bir pelet içeren bFGF. Sağlam yeni kan damarlarının (nokta çizgili) önceden varolan normal limbal damarlarından büyüdü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare kornea cep tahlil modeli, ilk olarak Muthukkaruppan VR ve Auerbach R 6 1979 yılında tarif edilmiştir. Detaylı protokolleri farklı laboratuvarlar 2,3,7,8 tarafından yayınlanmıştır. Laboratuvarımız, uzun yıllar 4 için modifiye edilmiş ve çalışmalarımız bu yöntem kullanılır . Fare kornea cep testi büyük tekrarlanabilirlik ile nispeten basit bir model. Bu modelin bir diğer avantajı, kornea, kan damarlarının normal yoksun olması nedeniyle, bu testte arka plan en az miktarda olduğunu. Bu nedenle, bu model farklı faktörleri ve moleküller anjiyogenik etkisi çalışma alanında yaygın olarak kullanılır. , Sıçan ve tavşan gibi bazı büyük hayvanlar, gözleri ile karşılaştırıldığında, fare gözleri küçük ve kullanımı zor. Özel bakım, özellikle kornea cebi ve pelet ekleyerek süreçleri sırasında, bu model yaparken bu nedenle gereklidir. Bıçak tam kontrollü bir şekilde ele alınması gereken delinme kornea olmaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bizim araştırma NIH, Ulusal Göz Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
