Summary
각막은 혈관 조직이 부족한다는 점에서 고유합니다. 그러나, 강력한 혈관의 성장과 생존은 강력한 angiogenic 요인에 의해 각막에 유도된 수 있습니다. 따라서 각막이 우리와 함께 angiogenic 연구 가치있는 도구를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 각막 포켓 분석 방법과이 모델을 사용 angiogenic 요인에 의해 유발 angiogenesis을 평가의 마우스 모델을 수행하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
정상 각막은 혈관 조직이 분명하다. 그러나 혈관이 강력한 angiogenic 요인이 1을 투여하는 각막의 성장과 생존을 유도하실 수 있습니다. 이 독특한는 각막 포켓 분석 angiogenesis 연구에 대해 가장 많이 사용되는 모델 중 하나가되었다. 각막은 세포의 여러 레이어를 작곡. 그것은 angiogenic 효과 2,3를 조사하기 위해 각막에 대한 관심의 angiogenic 요인을 포함한 펠렛를 포함하는 것이 가능합니다. 여기, 우리는 (I)는 angiogenic 요인 함유 펠렛 (II)을 (III)의 관심 angiogenic 요인에 의해 유발 angiogenesis를 분석 각막에 펠렛을 포함을 생산하는 방법의 단계 시범에 의해 단계를 제공합니다. 기본 fibroblast의 성장 인자 (bFGF)가 가장 강력한 angiogenic 요인 4의 하나로 알려져 있기 때문에, 그것은 각막에 angiogenesis를 유도 여기에 사용됩니다.
Protocol
사용된 모든 장비와 시약이 멸균됩니다. 프로토콜은 동물 케어 승인 및 (동물 연구 프로토콜 네이 - 553) 네이 / NIH에서위원회 (ACUC)를 사용하고, NIH의 지침과 규정에 따라 수행였습니다.
1. angiogenic 요인 함유 알약을 생산
이 부분에 관심 angiogenic 요인을 포함하고있는 알약을 준비하고 있습니다.
- 10 % (W / V) PBS로 sucralfate 솔루션을 확인하십시오. 실온 하에서 보관하십시오.
- 12% (W / V) 절대 에탄올과 쓰임새 HEMA하십시오. 실온 하에서 보관하십시오.
- 1 μg / μl bFGF 솔루션을 확인하십시오. -80에 저장 ° C.
- 50 알약을 만들기 위해 sucralfate와 bFGF 주식 솔루션 4 μl의 1μl 폴리 - HEMA 5 μl, 철저하게 소용돌이를 섞는다.
- 배양 접시에있는 깨끗한 parafilm 조각을 장소, 조직 문화 후드에서 15 분 자외선 아래로 노출. 한 펠렛에 대한 parafilm에 솔루션 혼합물의 0.2 μl를 버려라. 따라서 솔루션 혼합물의 10 μl 50 알약을 얻을 것입니다. 1-2시간 위해 상온에서 산탄이 건조하자. 마른 쥐똥은 ° C 몇 달 동안 몇 일, 또는 -80 4 OC에 저장할 수 있습니다.
- 사용시, 캐내다와 포셉 한 켤레의 도움말로 알약을 픽업. 그들을 아프게하거나 멀리 봄하게하지 않도록 각별히주의하십시오.
2. 마우스 각막 포켓 분석을 수행
이 부분에서, 우리는 주머니에 펠렛를 삽입하는 방법을 마우스 각막에 주머니 만드는 방법을 보여, 그리고 것입니다. 펠렛에 포함된 angiogenic 요인은 각막의 주변 지역 (그림 1) 점진적으로 공개됩니다. 이 예제에서, 우리는 8 주 여성 C57/Bl6 마우스를 사용합니다.
- 마우스 마취제 (75 MG / kg)과 xylazine (5mg/kg, IP 사출)의 혼합물과 함께 체계적으로 깊이 anesthetized입니다. 이것은 30-60 분 마취 상태에서 마우스를 계속합니다. 국소 마취 (0.5 % proparacaine HCL)은 각막에 적용됩니다. 5 분 후, 해부 현미경으로 눈 하나 수정.
- 매우 부드러운 상처는 본 Graefe 백내장의 칼로 각막 limbus (그림 1 그림)에서 각막 1.2 -1.4 mm의 중간에 이루어집니다. 각막을 건드리지 않게 매우주의하십시오.
- 포켓은 수평 각막의 중간에 칼을 삽입하고 limbus 신중 (Fig.1)쪽으로 칼을 확장하여 각막의 상피 층 아래에 이루어집니다. 주머니의 크기는 한 angiogenic 요인 함유 펠렛을 수용할 정도로 큰 수 있습니다. 아니라 각막을 통해 펑크 매우주의하십시오.
- 천천히 주머니에 포셉 한 쌍의와 펠렛을 넣습니다. 가능한 한 평면으로 펠렛을 만들어보십시오.
- 펠렛의 주입 후 국소 안과 항생제 연고가 눈에에 적용됩니다. 악기 동물 사이에 70 % 알코올 패드로 닦아 있습니다.
- 그것이 똑바로 자세를 유지하고 다음의 홈 케이지로 돌아갈 수 때까지 따뜻하고 건조한 지역에 마우스를 이동하고 모니터링합니다. 체계적 진통제 (예, buprenorphine, 2 MG / kg, IP 주입) 및 국소 항생 연고 (예 : gentamicin) 수술 후 2 일 회 제공되며 마우스가 밀접하게 3 일간 모니터링합니다. 힐링은 처음 48 시간 이내에 수술 완료 예정입니다. 주머니에있는 안과는 펠렛 주입 후 4~10일 사이에 슬릿 램프 biomicro 범위에 따라 검사한다.
3. 대표 결과
- 펠렛 주입 후 이레는 마우스 systemically과 몸에 붙이기로 2.1에 설명된 anesthetized 있습니다.
- 해부 현미경 angiogenic 요인에 의해 유도된 각막에 혈관을 관찰. 차량 대우 각막에는 아무런 혈관의 성장은 (그림 2A, 차량 취급 각막) 관찰 수 없습니다. bFGF 대우 각막에서 강력한 angiogenesis는 (그림 2B) 볼 수 있습니다. 혈관의 성장은 혈관 (새로운 혈관의 맨 정상 limbal 혈관에서), 그리고 전체 혈관 영역 (그림 2B, bFGF에 빨간색 점선과 delineated의 최대 길이를 사용하여 평가 수 ) 각막 - 처리. 기타 부량 방법도 2,5 설명하고 있습니다.
그림 1. H & E의 얼룩과 함께. 정상 각막. 대한 혈관은 정상 각막에 존재하지 않습니다. B는. 각막의. C 상피 층 아래에 주머니하십시오. 주머니에 펠렛을 삽입할 수 있습니다. D. angiogenic 요인은 펠렛에서 풀려나, 새로운 혈관은 정상 혈관 limbal에서 성장합니다.
그림 2. 오일 메신저 후 대표 결과펠렛의 농장.. 전용 차량을 포함한 펠렛과 함께 각막. 각막에 새로운 혈관 형성하지 않습니다. 단지 기존 일반 limbal 선박 볼 수 있습니다. B는. 펠렛 함유 bFGF와 각막. 강력한 새로운 혈관 (도트 늘어선) 기존의 일반 limbal 선박에서 자랐습니다.
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Discussion
마우스 각막 포켓 분석 모델을 먼저 Muthukkaruppan VR 및 아우어 바흐 R 6 1979 년에 설명했다. 자세한 프로토콜은 다른 실험실 2,3,7,8에 의해 공개되었습니다. 저희 연구실은 몇 년 4 수정 및 우리의 연구에이 방법을 사용하고 있습니다. 마우스 각막 포켓 검정 좋은 재현성있는 비교적 간단한 모델입니다. 이 모델의 또 다른 장점은 각막이 정상적으로 혈관 부족 때문에,이 분석의 배경 최소 금액이있다는 것입니다. 따라서,이 모델은 일반적으로 다른 요소와 분자의 angiogenic 효과를 연구하기 위해 필드로 사용됩니다. 이러한 쥐 및 토끼 같은 큰 동물의 눈으로 비교, 마우스 눈은 작고 다루기 어렵습니다. 특히 각막의 주머니를 만들고 펠렛을 삽입의 과정 동안,이 모델을 수행할 때 특별한주의가 따라서 필요합니다. 나이프는 정확하게 제어 방식으로 처리되어야 그것이 소중히 각막을되지 않습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리의 연구는 NIH, 국립 안과 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
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