Summary
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تصنيع واستخدام أجهزة الكشف عن مجموعة microfabricated آخر (mPADs) لتقييم التحويرات من انقباض الخلوية.
Abstract
في هذا الفيديو ، وسوف نقدم نهجنا لقياس قوى الشد الخلوية باستخدام مجموعة microfabricated الوظائف. يتم إنشاؤها من خلال جر القوات الميوسين أكتين - التفاعلات وتلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء لدينا. خلال التنمية ، فإنها تمكن الخلايا للانتقال من مكان واحد لآخر من أجل تشكيل الهياكل في وقت مبكر من الأنسجة. قوات الجر مساعدة في عمليات الشفاء. كانت ضرورية لإقفال السليم للجروح أو الهجرة والزحف من الكريات البيضاء من خلال جسمنا. يمكن لهذه القوى نفسها أن تكون ضارة على صحتنا في حالة ورم خبيث أو نمو الأوعية الدموية السرطانية نحو الورم. كانت الطريقة الأكثر شيوعا التي يمكن من خلالها دراسة الخلايا في المختبر لاستخدام الزجاج أو صحن البوليسترين. ومع ذلك ، فإن صلابة من ركائز يجعل من المستحيل فعليا على قياس قوى الجر الخلية ، وهناك طرق قليلة نسبيا لدراسة قوى الجر. وقد وضعت مختبرنا تقنية للتغلب على هذه القيود. يستند هذا الأسلوب على مجموعة العمودي للالكابولي مرنة ، وصلابة ومقياس حجم وهي ان هذه الخلايا الفردية موزعة على العديد من الكابولي وصرف لهم في هذه العملية. الركائز التي نستخدمها هي 3 ميكرومتر في القطر ، و 10 ميكرون طويل القامة ، ويتم تكوينها في مجموعة منتظمة مع تباعد 9 الوسط إلى مركز ميكرون. ولكن يمكن أن تكون هذه الأبعاد المادية المتنوعة بسهولة لاستيعاب مجموعة متنوعة من الدراسات. نبدأ مع رئيسي السيليكون ، ولكن يتم إجراء الوظائف النهائي من المطاط والسيليكون يسمى بولي (ميثيل siloxane) ، أو PDMS. يمكننا قياس الانحرافات تحت المجهر وحساب حجم واتجاه قوى الجر اللازمة لإنتاج الانحرافات الملاحظة. نحن ندعو هذه ركائز microfabricated بعد الصفيف كاشفات ، أو mPADs. هنا ، سوف نظهر لكم كيف نبتدع واستخدام mPADs لتقييم التحويرات من انقباض الخلوية.
Protocol
تصنيع السيليكون ماجستير مقلب
طباعة الحجرية
المواد :
- 75 ملم رقائق السيليكون
- SU - 8 2 الواقي الضوئي السلبية (Microchem ، بوسطن ، ماساتشوستس)
- N2
الطريقة :
- يذوى سي رقاقة في 120 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- الأشعة فوق البنفسجية علاج الأوزون السطحي لمدة 7 دقائق لإزالة المواد العضوية.
- N2 سطح ضربة لإزالة الجسيمات.
- تطبيق SU - 8 2 لتغطية 70 ٪ من سطح (~ 10 مل لرقاقة 75 ملم).
- تدور في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية مع تسارع دورة في الدقيقة / ق 300.
- وضع رقاقة على موقد والمنحدر من درجة حرارة الغرفة إلى 95 درجة مئوية.
- Softbake مقاومة للضوء لمدة 15 دقيقة في 95 درجة مئوية.
- الفيضانات فضح رقاقة لمدة 20 -- 365 نانومتر في (I - خط) 25 mJ/cm2 جرعة لتشكيل الطبقة السفلى.
- تطبيق SU - 8 2 للطبقة مقاومة للضوء الثاني.
- تدور بسرعة 550 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية مع تسارع دورة في الدقيقة / 300 ق لفيلم سمك حوالي 11 ميكرون.
- وضع رقاقة على موقد والمنحدر من درجة حرارة الغرفة إلى 65 درجة مئوية.
- Softbake الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- المنحدر من موقد من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية.
- Softbake الرقاقة لمدة 55 دقيقة في 95 درجة مئوية.
- رقاقة بارد لدرجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- قناع محاذاة mPAD على رقاقة وفضح ل95-100 mJ/cm2 جرعة في 365 نانومتر (I - خط).
- وضع رقاقة على موقد والمنحدر من درجة حرارة الغرفة إلى 95 درجة مئوية.
- بعد التعرض لضوء أخبز لمدة 25 دقيقة في 95 درجة مئوية.
تطوير
المواد :
- أطباق زجاجية 100mm (5)
- البروبيلين غليكول اسيتات الميثيل الأثير (PGMEA)
- الأيزوبروبانول (IPA)
- N2
الطريقة :
- في هود الكيميائية ، وملء خمسة أطباق مع PGMEA (2) ، معهد الإدارة العامة ، والهكسين (2).
- عقد في رقاقة PGMEA 1 لمدة 10 ثانية
- رقاقة تستنهض الهمم لمدة 50 ثانية
- رقاقة لنقل PGMEA 2 مع هلالة PGMEA.
- تستنهض الهمم لمدة 5 ثوان.
- رقاقة لنقل IPA مع هلالة PGMEA.
- تستنهض الهمم لمدة 20 ثانية.
- رقاقة لنقل IPA 1.
- تستنهض الهمم لمدة 5 ثوان.
- رقاقة لنقل IPA 2.
- تستنهض الهمم لمدة 5 ثوان.
- إزالة الرقاقة بسرعة من IPA 2 مع هلالة IPA والجافة مع N2
- تفقد النقش.
- رقاقة Hardbake عند 120 درجة مئوية لمدة 14-20 ساعة لعبور الارتباط SU - 8.
- النرد الرقاقة مع قطع الماس
- جبل الرقاقة على شريحة زجاجية باستخدام الايبوكسي
- Fluorosilanize الرقاقة (انظر الإرشادات في صب النسخ المتماثل)
صب تكرار mPADS
السلبية مقلب
المواد :
- الالومنيوم المتاح قارب وزنها
- Polydimethylsiloxane (PDMS) قاعدة وعلاج وكيل (داو ، ميدلاند ، MI)
- Razorblade
- سيلاني : (tridecafluoro - 1 - ،1،2،2 tetrahyrooctyl) - 1 - trichlorosilane
- الشريحة الزجاجية
- الزجاج باستور الماصة
الطريقة :
- مزيج PDMS 10:01 من حيث الوزن وديغا في ظل فراغ لمدة 1 ساعة لإزالة الفقاعات.
- قالب السيليكون مكان رئيسي في زورق من الألومنيوم.
- صب 50-60 غرام من العفن على PDMS الماجستير في القارب الألمنيوم.
- ديغا تحت الفراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة الفقاعات.
- ينفخون فقاعات هواء السطح مع المحاصرين في PDMS الانفجار السريع للN2.
- قارب مكان في الفرن الحراري بنحو 110 درجة مئوية لمدة 15 دقائق حتى PDMS ثابتة.
- قطع بعيدا القارب الألمنيوم.
- مع razorblade ، وتقليم بعيدا PDMS تحت الرئيسي السيليكون.
- قشر PDMS بعيدا عن السيليكون الرئيسية ببطء ومع حركة مستمرة في اتجاه واحد لتجنب تدمير الرئيسي.
- تفتيش رئيسية السيليكون عن الضرر.
- قطع قالب السلبية إلى 4 قطع.
- كرر الخطوات من 1-10 لدفعة كبيرة من قوالب سلبية.
- بلازما الأوكسجين علاج العفن سلبية على 1.5 دقيقة لتنشيط السطح ، أو
- الأوزون علاج العفن سلبية لمدة 10 دقيقة لتنشيط السطح.
- مكان قوالب سلبية في dessicator مع ميزات mPAD المكشوفة.
- انتشار 250-500 ميكرولتر من سيلاني على شريحة زجاجية في وسط dessicator
- ماصة مكان المراعي الزجاج مع 150-200 ميكرولتر من سيلاني في الطرف داخل dessicator.
- فراغ الغرفة لتتبخر القوالب السلبية سيلاني ومعطف لل14 ساعة>.
mPADS
المواد :
- Polydimethylsiloxane (PDMS) قاعدة وعلاج وكيل (داو ، ميدلاند ، MI)
- واسع الفم ماصات نقل المتاح
- 2 "س 3" الشرائح الزجاجية
- كاتب الزجاج
- N2
الطريقة :
- مزيج PDMS 10:01 من حيث الوزن وديغا في ظل فراغ لمدة 1 ساعة لإزالة الفقاعات.
- الدانتيل القوالب السلبية silanized في 'عبر'
- ماصة PDMS في قوالب سلبية بحيث يتم تغطية كاملة الميزات لسمك 1MM.
- انتظر 30 دقيقة عن أي فقاعات هواء في PDMS لتطفو على السطح </ لى>
- في الوقت الضائع 30 '، والغبار coverslips 22x22mm الزجاج (رقم 2) مع تيار من N2.
- الأكسجين الشرائح الزجاجية البلازما علاج نصفين مقابل 1.5 دقائق لتنظيف الزجاج وتفعيل
- ينفخون فقاعات هواء السطح مع المحاصرين في PDMS الانفجار السريع للN2.
- وضع بلطف حافة زجاج ساترة PDMS مع الجانب تنظيف البلازما التي تواجه PDMS. انخفاض ببطء الشريحة الزجاجية بحيث تماما PDMS اتصالات سطح الزجاج بالكامل وتجنب الحصول على فقاعات الهواء المحاصرين تحت الشريحة الزجاجية.
- تجميعها في مكان قوالب الفرن الحراري بنحو 110 درجة مئوية لمدة 20 ساعة للشفاء تماما.
- إزالة القوالب من الفرن والسماح لهم باردة لRT.
- عقد شريحة زجاجية مع يد واحدة على رأس وقشر السلبية ببطء بعيدا قالب سلبي من أسفل لاطلاق سراح mPAD.
- تفقد mPAD تحت المجهر للوظائف انهارت.
- إعادة silanize العفن عبر البلازما والمسبوكات سيلاني كل أربعة. عمر القوالب السلبية لتكرار الجيد هو حوالي 6-20 يلقي.
بذر خلايا على mPADS
ختم
المواد :
- PDMS الطوابع لUCP (انظر تيان ، J & تشن ، CS ، في أساليب هندسة الأنسجة ، 2001 ، ص 113-120).
- الإيثانول (100 ٪ و 70 ٪)
- منزوع الأيونات المياه المعقمة
- 50 ميكروغرام / مل [فيبرونكتين] الإنسان في الماء منزوع الأيونات معقمة دينار بحريني (العلوم البيولوجية)
- 5 الحل الجاذبة ميكروغرام / مل تصفيتها مع غشاء 0.2 ميكرومتر (D - 3886 ، المسابر الجزيئية ، OR)
- 2 ٪ Pluronics F127 (BASF ، جبل الزيتون ، ونيو جيرسي)
- 1X الحل الفوسفات العازلة.
- 100 ملم × 25 ملم طبق بيتري (4)
- 150 ملم × 25 ملم طبق بتري (2)
- رقائق الالومنيوم
- N2
- ملاقيط
- معقمة هود
الطريقة :
- PDMS تقليم فائض من mPADs
- إذا تم استخدام الطوابع PDMS سابقا ، طوابع يصوتن في الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 5 دقائق لتنظيف بعيدا تلويث البروتينات.
- هود في العقيمة ، وعقد الطوابع على جنوبهم مع ملاقط والجافة مع N2 بعد غمس طوابع جديدة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ والمياه المعقمة
- مكان في صحن بتري 150 ملم مع العمل جنبا تصل.
- قسامة قطرات من محلول فبرونيكتين على كل الطوابع. تبدأ الزوايا على كل من الطوابع ، ثم الحواف ، وأخيرا في المناطق الداخلية. في البداية سطح PDMS من الطوابع هي مسعور ، ولكنه يصبح ماء كما كثف من البروتين. تعمل "الخارج إلى الداخل" تغييرات زاوية الاتصال من PDMS بحيث هناك حاجة لخفض حجم حل فبرونيكتين إلى معطف تماما الطابع.
- اسمحوا الجلوس لمدة 1 ساعة في غطاء محرك السيارة لامتصاص البروتين.
- يغسل بالماء الطوابع DI بصب في صحن وترك يرتفع منسوب المياه خلال الطوابع.
- غسل الطوابع في 100 طبق بتري مم مملوءة بالماء DI.
- إزالة والجافة مع N2.
- mPADS علاج الأوزون لمدة 7 دقائق لتنشيط السطح لدمغ.
- تحت غطاء المحرك ، عن طريق وضع ختم mPADS الدمغة على حافة mPAD وخفض بلطف لاجراء اتصالات كاملة. بخفة أعلى الطابع مع ملاقط لضمان حصول جميع المناطق على اتصال جيد ، ولكن يجب الحرص على عدم انهيار هذه الوظائف.
- إزالة بعناية الطوابع مع ملاقط.
- mPADS يغرق في 100 طبق بتري ملم مع الإيثانول بنسبة 100 ٪ عن 15 ثانية ~. إبقاء microneedles من خلال نقل dewetting عن طريق نقل بسرعة بين الأطباق.
- mPADS يغرق في طبق بتري 100 ملم مع 70 ٪ الايثانول 15 ثانية ~.
- mPADS يغرق في طبق بتري 100 ملم مع الماء DI 15 ثانية ~.
- mPADS يغرق في المرتبة الثانية طبق بتري 100 ملم مع الماء DI 15 ثانية ~.
- mPADS يغرق في 150 طبق بتري ملم مع الماء دي.
- mPADS يغرق في 150 طبق بتري ملم مع 100 مل من محلول الجاذبة.
- تغطي بورق الألمنيوم وينقع لمدة 1 ساعة.
- mPADS يغرق في طبق بتري 100 ملم مع الماء DI 15 ثانية ~.
- mPADS يغرق في 150 طبق بتري ملم مع 10 مل من Pluronics 2 ٪ و 90 مل من برنامج تلفزيوني لتركيز مجموع Pluronics 0.2 ٪.
- تغطية وينقع لمدة 1 ساعة.
- mPADS يغرق في طبق بتري 100 ملم مع الماء DI 15 ثانية ~.
- mPADS يغرق في المرتبة الثانية طبق بتري 100 ملم مع الماء DI 15 ثانية ~.
- mPADS يغرق في المركز الثالث طبق بتري 100 ملم مع 15 ثانية PBS ~.
زراعة
المواد :
- اختيار خط خلوي
- التربسين - EDTA (0.25 ٪ التربسين مع EDTA • 4NA ، Gibco القط رقم 25200-056)
- نمو متوسطة
- 1X الحل الفوسفات العازلة.
الطريقة :
- في هود عقيمة ، mPADS مكان في طبق بتري 100 ملم وملء مع 17 مل من المتوسط.
- مكان طبق بتري في حاضنة دافئة لإلى 37 درجة مئوية
- تعليق الخلايا عبر التربسين
- نضح مرارا لتفريق مجموعات الخلايا.
- الماصة تعليق خلية في طبق بتري مع mPADS. إضافة مثل هذه الخلايا خلايا أنها ستظل واحدة (بدون خلية خلية اتصالات) في وقت التحليل. المبلغ المحدد من الخلايا لإضافة نوع من خلايا محددة ويعتمد على مساحة انتشار الخلايا ومعدل النمو.
- تفريق بلطف خلايا في طبق بتري مع pippetting بطيئة.
- مكان في الحاضنة لمدة 2 ساعة للسماح للخلايا لتسوية والالتزام على microneedles.
- mPADS تفتيش لمعرفة ما إذا انتشرت الخلايا. سوف ننظر بالارض الخلايا وتمتد ستة أو أكثر وظيفة.
- إذا تنتشر الخلايا ، ونقل إلى 100 mPADS جديدة طبق بتري ملم مع 21 مل من متوسطة جديدة.
- وmPADS مستعدون لتجربتك.
تلوين وتركيب mPADS
تحديد
المواد :
- منزوع الأيونات الماء
- Paraformeldahyde (16 ٪) فيال
- 10X الحل الفوسفات العازلة.
- 1X الحل الفوسفات العازلة.
الطريقة :
- في أنبوب الطرد المركزي 50mL ، إضافة 30 مل من DI ، 10 مل من paraformeldahyde (فيال بأكمله) ، و 4.5 مل من برنامج تلفزيوني 10X لتحديد الحل.
- إضافة ~ 25 مل من حل لتثبيت صحن بتري مم 100.
- بلطف يغرق mPAD مع تحديد الخلايا في الطبق والسماح احتضان لمدة 20 دقيقة.
- mPADS يغرق في 100 ملم مع طبق 1X PBS ثلاث مرات.
- جاهزة للimmunostaining والتركيب.
تحليل قوات الخلوية على mPADS
مبائر التصوير
المواد :
- مبائر مجهر
- الهدف 63X
- تصفية مكعبات عن الأجسام المضادة الثانوية
- الأخضر تصفية مكعب (رودامين) للتصوير الجاذبة للmicroneedles.
الطريقة :
- mPADs مكان على المسرح والعثور على الخلايا وحيدة مع التعرض MS 300 ، أي binning.
- قمم صورة لصورة microneedles TOP.
- ض به لمراقبة الاقمار الصناعية ، والتقاط صورة لصورة microneedles القاع.
- صورة أي قنوات أخرى لديك بقع في (هويشت ، phalloidin الخ.)
تحليل الصور
المواد :
- MATLAB مع أدوات معالجة الصور
الطريقة :
- تدوير الصور وتسجيل أعلى وأسفل
- centroids قدر من القاع (undeflected) والمناصب العليا (تنحرف)
- حساب تشريد
- باستخدام الربيع المستمر للوظائف (المعروف ، ويعتمد على هندسة آخر) ، وحساب قوة ناقلات في كل آخر
- ويستند تحليل الخطأ على القدرة على حل القوات ، ويعتمد على دقة وضوح الصورة وكشف قرار النقطه الوسطى
- ترتيب البيانات حسب احتياجاتك المخصصة -- على سبيل المثال مقادير القوة ، و / أو اتجاه ، ودورة الزمن ، والقياسات كثيرة في ظروف مختلفة الخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).
- Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells. Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. Wang, Y. L., Discher, D. E. 83, Elsevier. New York. 313-328 (2007).
- Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors. Mechanics & Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).
