Mikrofabricerade Post-Array-detektorer (mPADs): en metod att isolera mekaniska krafter

Summary

I denna video visar vi hur du kan tillverka och använda mikrofabricerade efter rad detektorer (mPADs) att bedöma modulationer av cellulära kontraktilitet.

Abstract

I den här videon kommer vi att presentera vårt tillvägagångssätt för att mäta cellulär dragkrafter med hjälp av en mikrofabricerade utbud av tjänster. Traction krafterna alstras genom myosin-aktin interaktion och spelar en viktig roll i vår fysiologi. Under utvecklingen, ger de celler att flytta från en plats till nästa för att bilda den tidiga strukturer av vävnad. Traction krafter hjälpa till i läkningsprocessen. De är nödvändiga för en korrekt stängning av sår eller migration och genomsökning av leukocyter genom vår kropp. Samma krafter kan vara skadliga för vår hälsa i samband med cancer metastaser eller vaskulär tillväxt mot en tumör. Den vanligaste metoden genom att studera celler in vitro har varit att använda ett glas eller polystyren maträtt. Gör dock den stela substrat det omöjligt att fysiskt mäta cell dragkrafter, och det finns relativt få metoder för att studera dragkrafter. Vårt lab har utvecklat en teknik för att övervinna dessa begränsningar. Metoden är baserad på ett lodrätt system av flexibla utliggare, styvhet och storlek skala är sådana att enskilda celler spridda över många utliggare och avleda dem i processen. Pelarna vi använder är 3 mikrometer i diameter, 10 mikrometer lång, och är konfigurerade i en vanlig array med 9 ìm centrum till närmaste håls centrum. Men dessa fysiska mått kan lätt varieras för att rymma ett flertal studier. Vi börjar med en kisel mästare, men den slutliga inlägg är gjorda av silikon gummi som kallas poly (dimetyl siloxan), eller PDMS. Vi kan mäta deformationen under ett mikroskop och beräkna omfattningen och riktningen för drag krafter krävs för att producera den observerade deformationen. Vi kallar dessa substrat mikrofabricerade post-array-detektorer, eller mPADs. Här kommer vi att visa dig hur vi tillverka och använda mPADs att bedöma modulationer av cellulära kontraktilitet.

Protocol

Silicon Mästare Mögel Fabrication

Litografi

Material:

• 75 mm kiselskivor
• SU-8 2 Negativ fotoresist (Microchem, Boston, MA)
• N2

Metod:

1. Torka Si wafer vid 120 ° C i 2 timmar.
2. UV-ozon behandla ytan i 7 minuter för att ta bort organiska ämnen.
3. N2 blåsa ytan för att ta bort partiklar.
4. Applicera SU-8 2 för att täcka 70% av ytan (~ 10 ml för 75 mm wafer).
5. Spin vid 2000 rpm i 20 sekunder med 300 varv / s acceleration.
6. Placera rånet på en värmeplatta och ramp från rumstemperatur till 95 ° C.
7. Softbake den fotoresist i 15 minuter vid 95 ° C.
8. Flood utsätta wafer för 20 till 25 mJ/cm2 dos vid 365 nm (I-line) för att bilda bottenskiktet.
9. Applicera SU-8 2 för andra fotoresist skikt.
10. Spin vid 550 rpm i 20 sekunder med 300 varv / s acceleration för en ca 11 ìm tjocklek film.
11. Placera rånet på en värmeplatta och ramp från rumstemperatur till 65 ° C.
12. Softbake rånet vid 65 ° C i 5 minuter.
13. Ramp kokplattan från 65 ° C till 95 ° C.
14. Softbake rånet i 55 minuter vid 95 ° C.
15. Cool wafer till rumstemperatur i 20 minuter.
16. Passa mPAD mask på wafer och utsätta för 95 till 100 mJ/cm2 dos vid 365 nm (I-linjen).
17. Placera rånet på en värmeplatta och ramp från rumstemperatur till 95 ° C.
18. Efter exponering baka fotoresist i 25 minuter vid 95 ° C.

Utveckla

Material:

• 100mm glas rätter (5)
• Propylenglykol metyleter acetat (PGMEA)
• Isopropanol (IPA)
• N2

Metod:

1. I en kemisk huva, fyller fem rätter med PGMEA (2), IPA, och hexan (2).
2. Håll oblat i 1 PGMEA i 10 sekunder
3. Skaka rån i 50 sekunder
4. Överföring wafer till 2: a PGMEA med menisk i PGMEA.
5. Agitera för 5 sekunder.
6. Överföring kisel till IPA med menisk i PGMEA.
7. Agitera i 20 sekunder.
8. Överföring wafer till 1 IPA.
9. Agitera för 5 sekunder.
10. Överföring wafer till 2 IPA.
11. Agitera för 5 sekunder.
12. Snabbt bort rånet från 2 IPA med menisk av IPA och torka med N2
13. Inspektera mönster.
14. MANDELKNÄCK rån vid 120 ° C i 14-20 timmar att länka SU-8.
15. Tärna rånet med en diamant fräs
16. Montera rånet på en glasplatta med epoxi
17. Fluorosilanize rånet (se instruktioner i replikering gjutning)

Replikering gjutning av mPADS

Negativa Mögel

Material:

• Disponibel aluminium väger båten
• Polydimetylsiloxan (PDMS) bas och härdare (Dow, Midland, MI)
• Rakblad
• Silan: (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-Trichlorosilane
• Glasskiva
• Glas pasteurpipett

Metod:

1. Blanda PDMS 10:01 i vikt och lufta på under vakuum i 1 timme för att ta bort bubblor.
2. Placera kisel mästare mögel i aluminium båt.
3. Häll 50 till 60 g PDMS över mästare mögel i aluminium båt.
4. Degas under vakuum i 30 minuter för att ta bort bubblor.
5. Blås bort surface-luftbubblor i PDMS med snabb tryckvåg av N2.
6. Placera båten i varmluftsugn på 110 ° C i 15 minuter tills PDMS är fast.
7. Klipp bort aluminium båt.
8. Med rakblad, klippa bort PDMS under kisel mästare.
9. Skala PDMS bort från kisel mästare långsamt och med ständig rörelse i en riktning för att undvika att förstöra master.
10. Inspektera kisel master för skador.
11. Skär negativa mögel i 4 bitar.
12. Upprepa steg 1-10 för en stor sats av negativa formar.
13. Syre plasma behandla negativa formen för 1,5 minuter för att aktivera ytan, eller
14. Ozon behandla negativa formen i 10 minuter för att aktivera ytan.
15. Placera negativa formar i exsickator med mPAD utsatta funktioner.
16. Sprid 250-500 mikroliter av silan på glas bilden i mitten av exsickator
17. Placera glas bete pipett med 150-200 mikroliter av silan i spetsen insidan exsickatorn.
18. Vakuumkammare att avdunsta silan och päls negativa formar för> 14 timmar.

mPADS

Material:

• Polydimetylsiloxan (PDMS) bas och härdare (Dow, Midland, MI)
• Wide-mun disponibel överföringspipetter
• 2 "x 3" Glass diabilder
• Glas Scribe
• N2

Metod:

1. Blanda PDMS 10:01 i vikt och lufta på under vakuum i 1 timme för att ta bort bubblor.
2. spetsar silaniseras negativa formar till "cross"
3. Pipettera PDMS i negativa formar så att funktioner är helt täckta med en 1mm tjocklek.
4. Vänta 30 minuter för eventuella luftbubblor i PDMS att stiga till ytan. </ Li>
5. I 30 'driftstopp, damm 22x22mm (nr 2) glas täckglas med en ström av N2.
6. Syre plasma behandla glasskivor halvor för 1,5 minuter att rengöra och aktivera glas
7. Blås bort surface-luftbubblor i PDMS med snabb tryckvåg av N2.
8. Försiktigt lägga kanten av glaset täckglas på PDMS med plasma rengöras vänd mot PDMS. Sakta sänker glasskiva så att PDMS fullt kontakter hela glasytan och undvik luftbubblor fastnar under glasskiva.
9. Sätt ihop formar i varmluftsugn på 110 ° C i 20 timmar att bota.
10. Ta ut formarna ur ugnen och låt dem svalna till RT.
11. Håll glasskiva med en hand på toppen och dra långsamt negativ bort den negativa formen från botten för att frigöra mPAD.
12. Inspektera mPAD under ett mikroskop för kollapsade inlägg.
13. Re-silaniseras mögel via plasma och silan vart fjärde gjutgods. Den negativa formen livstid för bra replikering är cirka 60-20 kast.

Seedning Celler på mPADS

Stämpling

Material:

• PDMS frimärken för UCP (se Tien, J & Chen, CS, i Metoder för Tissue Engineering, 2001, pp 113-120.)
• Etanol (100% och 70%)
• Steriliserade Avjoniserat vatten
• 50 ug / ml Human Fibronectin i sterilt avjoniserat vatten (BD Biosciences)
• 5 mg / ml DII lösning filtreras med 0,2 ìm membran (D-3886, molekylära sonder, OR)
• 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, NJ)
• 1X fosfatbuffertlösning.
• 100 mm x 25 mm petriskål (4)
• 150 mm x 25 mm petriskål (2)
• Aluminiumfolie
• N2
• Pincett
• Sterila Hood

Metod:

1. Trimma överskott PDMS från mPADs
2. Om PDMS stämpeln har använts tidigare, Sonikera frimärken i 100% etanol 5 minuter för att skrubba bort kontaminerande proteiner.
3. I sterila huva, hålla frimärken på sina sidor med pincett och torka med N2 efter doppning frimärken i färska 100% etanol och sterilt vatten
4. Placera i 150 mm petriskål med att arbeta uppåt.
5. Alikvotera droppar fibronektin lösning på varje stämpel. Börja med hörnen på varje frimärken, då kanterna, och slutligen det inre regionerna. Ursprungligen PDMS yta stämpeln är hydrofoba, men blir hydrofila som proteinet absorberas. Att arbeta "utsidan till insidan" ändrar kontakt vinkeln på PDMS så att en lägre volym fibronektin lösning behövs för att fullt päls stämpeln.
6. Låt sitta i 1 timme i huven för protein adsorption.
7. Tvätta frimärken med DI-vatten genom att hälla i skålen och låta vattennivån stiga under frimärken.
8. Tvätta frimärken i 100 mm petriskål fylld med DI-vatten.
9. Ta bort och torka med N2.
10. Ozon behandla mPADS i 7 minuter för att aktivera ytan för stämpling.
11. Under huven, stämpel mPADS genom att stämpla kanten på mPAD och försiktigt sänka för att göra full kontakt. Knacka lätt på toppen av stämpeln med pincett så att alla områden har bra kontakt men var noga med att inte dölja inlägg.
12. Ta försiktigt bort frimärken med pincett.
13. Sänk mPADS i 100 mm petriskål med 100% Etanol för ~ 15 sekunder. Håll mikronålar från dewetting under överföringen genom att överföra snabbt mellan rätter.
14. Sänk mPADS i 100 mm petriskål med 70% etanol för ~ 15 sekunder.
15. Sänk mPADS i 100 mm petriskål med DI-vatten för ~ 15 sekunder.
16. Sänk mPADS på andra 100 mm petriskål med DI-vatten för ~ 15 sekunder.
17. Sänk mPADS på 150 mm petriskål med DI-vatten.
18. Sänk mPADS på 150 mm petriskål med 100 ml DII lösning.
19. Täck med aluminiumfolie och dra i 1 timme.
20. Sänk mPADS i 100 mm petriskål med DI-vatten för ~ 15 sekunder.
21. Sänk mPADS på 150 mm petriskål med 10 ml 2% Pluronics och 90 mL PBS för total koncentration av 0,2% Pluronics.
22. Täck över och dra i 1 timme.
23. Sänk mPADS i 100 mm petriskål med DI-vatten för ~ 15 sekunder.
24. Sänk mPADS på andra 100 mm petriskål med DI-vatten för ~ 15 sekunder.
25. Sänk mPADS i tredje 100 mm petriskål med PBS för ~ 15 sekunder.

Seedning

Material:

• Valda cellinje
• Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin med EDTA • 4NA, Gibco Kat. Nr 25.200-056)
• Tillväxt Medium
• 1X fosfatbuffertlösning.

Metod:

1. I sterila huva, mPADS plats i 100 mm petriskål och fyll med 17 ml medium.
2. Placera petriskål i kuvös för att värma till 37 ° C
3. Häng cellerna via trypsin
4. Aspirera upprepade gånger för att bryta upp cellen kluster.
5. Pipettera cellsuspensionen i petriskål med mPADS. Lägg till cellerna så att de förblir enskilda celler (utan cell-cell kontakter) vid tidpunkten för analysen. Den exakta mängd celler för att lägga till är celltyp specifika ochberor på cell sprids område och tillväxttakten.
6. Försiktigt sprider celler i petriskål med långsamma pippetting.
7. Placera i kuvös i 2 timmar så att celler att bosätta sig och hålla sig på mikronålar.
8. Inspektera mPADS för att se om cellerna har spridit sig. Cellerna kommer att se tillplattat och spänn sex eller fler inlägg.
9. Om celler sprids, överföring mPADS till nya 100 mm petriskål med 21 ml rent medium.
10. Den mPADS är redo för experimentet.

Färgning och Montering mPADS

Fastställande

Material:

• Avjoniserat vatten
• Paraformeldahyde (16%) injektionsflaska
• 10X fosfatbuffertlösning.
• 1X fosfatbuffertlösning.

Metod:

1. I ett 50mL centrifugrör, tillsätt 30 ml av DI, 10 ml paraformeldahyde (hela flaskan) och 4,5 ml 10X PBS för att fastställa lösningen.
2. Lägg till ~ 25 ml fastställande lösning till en 100 mm petriskål.
3. Försiktigt doppa mPAD med celler till fastställande skål och låt inkubera i 20 minuter.
4. Sänk mPADS i 100 mm skålen med 1X PBS tre gånger.
5. Redo för immunfärgning och montering.

Analysera Cellular krafter på mPADS

Konfokala Imaging

Material:

• Konfokalmikroskop
• 63x mål
• Filter kuber för sekundära antikroppar
• Grönt filter kub (Rhodamine) för DII avbildning av mikronålar.

Metod:

1. Placera mPADs på scenen och hitta enskilda celler med 300 ms exponering, ingen binning.
2. Bild toppar mikronålar för TOP IMAGE.
3. Använda Z-kontroll avläsning, fånga bilden av mikronålar för botten IMAGE.
4. Bild eventuella andra kanaler du har fläckar på (Hoechst, phalloidin etc.)

Bildanalys

Material:

• MATLAB med Image Processing Toolbox

Metod:

1. Rotera och registrera övre och nedre bilder
2. Mät centroids i botten (undeflected) och toppen (utbuktande) positioner
3. Beräkna förskjutningen
4. Använda fjäderkonstanten för de tjänster (kända, beror på post geometri), beräkna kraft vektor vid varje inlägg
5. Fel analys bygger på förmågan att lösa krafter, och beror på bildupplösning och centroiden upptäckt upplösning
6. Ordna informationen enligt dina anpassade behov - t.ex. kraft magnituder och / eller riktning, som en tid naturligtvis många mätningar på olika villkor etc.