Microfabricated Post-Array-Detectoren (mPADs): een benadering van mechanische krachten Isoleer

Summary

In deze video laten we zien hoe om te fabriceren en gebruiken microfabricated na reeks detectoren (mPADs) om modulaties van cellulaire contractiliteit te beoordelen.

Abstract

In deze video, zal presenteren we onze benadering van de cellulaire trekkrachten met behulp van een microfabricated scala aan functies te meten. Traction krachten ontstaan ​​door myosine-actine interacties en spelen een belangrijke rol in onze fysiologie. Tijdens de ontwikkeling, zij stellen cellen te verplaatsen van de ene locatie naar de volgende om het begin van de structuren van het weefsel te vormen. Tractie krachten helpen bij het genezingsproces. Ze zijn noodzakelijk voor een goede afsluiting van wonden of de migratie en kruipen van leukocyten door ons lichaam. Deze zelfde krachten kunnen schadelijk zijn voor onze gezondheid in het geval van kanker metastase of vasculaire groei naar een tumor. De meest voorkomende methode om cellen te bestuderen in vitro is geweest om een ​​glas of polystyreen schotel te gebruiken. Echter, de stijfheid van de ondergrond maakt het onmogelijk om lichamelijk te meten cel trekkrachten, en er zijn relatief weinig methoden om de trekkrachten te bestuderen. Ons laboratorium heeft een techniek ontwikkeld om deze beperkingen te overwinnen. De methode is gebaseerd op een verticale reeks van flexibele uitkragingen, de stijfheid en de grootte schaal van die dien aard zijn dat individuele cellen verspreid over tal van overstekken en buigen ze in het proces. De pijlers die we gebruiken zijn drie micrometer in diameter, 10 urn groot, en zijn geconfigureerd in een regelmatige array met 9 micrometer hart-op-hart afstand. Maar deze afmetingen kan gemakkelijk worden gevarieerd om een ​​verscheidenheid van studies tegemoet te komen. We beginnen met een silicium meester, maar de laatste berichten zijn gemaakt van siliconen rubber genaamd poly (dimethyl siloxaan), of PDMS. Kunnen we meten de doorbuiging onder een microscoop en bereken de grootte en de richting van de trekkrachten nodig zijn om de waargenomen vervormingen te produceren. We noemen deze substraten microfabricated post-array-detectoren, of mPADs. Hier zullen we u laten zien hoe wij fabriceren en gebruik de mPADs om modulaties van cellulaire contractiliteit te beoordelen.

Protocol

Silicon Master Mold Fabrication

Lithografie

Materialen:

• 75 mm Silicon wafers
• SU-8 2 Negatieve fotolak (Microchem, Boston, MA)
• N2

Methode:

1. Uitdrogen Si wafer bij 120 ° C gedurende 2 uur.
2. UV-ozon te behandelen oppervlak voor zeven minuten aan organische stoffen te verwijderen.
3. N2 klap oppervlak om deeltjes te verwijderen.
4. Van toepassing zijn SU-8 2 tot 70% van de oppervlakte (~ 10 ml voor 75 mm wafer) te dekken.
5. Draaien op 2000 tpm gedurende 20 seconden met 300 rpm / s acceleratie.
6. Plaats de wafer op een kookplaat en oprit van kamertemperatuur tot 95 ° C.
7. Softbake de fotolak gedurende 15 minuten bij 95 ° C.
8. Flood bloot wafer voor 20 tot 25 mJ/cm2 dosis bij 365 nm (I-line) om de onderste laag te vormen.
9. Van toepassing zijn SU-8 2 voor de tweede fotolak laag.
10. Draaien op 550 rpm gedurende 20 seconden met 300 rpm / s voor een versnelling van ongeveer 11 micrometer dik film.
11. Plaats de wafer op een kookplaat en oprit van kamertemperatuur tot 65 ° C.
12. Softbake de wafer bij 65 ° C gedurende 5 minuten.
13. Helling van de kookplaat van 65 ° C tot 95 ° C.
14. Softbake de wafer voor 55 minuten bij 95 ° C.
15. Cool wafer tot kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
16. Lijn mPAD masker op wafer en bloot voor 95 tot 100 mJ/cm2 dosis op 365 nm (I-lijn).
17. Plaats de wafer op een kookplaat en oprit van kamertemperatuur tot 95 ° C.
18. Post-exposure bak de fotolak voor 25 minuten bij 95 ° C.

Ontwikkelen

Materialen:

• 100mm glazen schalen (5)
• Propyleenglycol methylether acetaat (PGMEA)
• Isopropanol (IPA)
• N2

Methode:

1. In een chemische kap, vul vijf gerechten met PGMEA (2), IPA, en hexaan (2).
2. Houd de wafer in 1e PGMEA 10 seconden
3. Ageren wafer voor 50 seconden
4. Overdracht wafer naar 2e PGMEA met een meniscus van PGMEA.
5. Roeren gedurende 5 seconden.
6. Overdracht wafer te IPA met meniscus van PGMEA.
7. Schud gedurende 20 seconden.
8. Overdracht wafer tot 1 IPA.
9. Roeren gedurende 5 seconden.
10. Overdracht wafer naar 2de IPA.
11. Roeren gedurende 5 seconden.
12. Snel verwijderen wafer uit 2e IPA met een meniscus van IPA en droog met N2
13. Inspecteer patroon.
14. Hardbake wafer bij 120 ° C voor 14-20 uur om cross-link SU-8.
15. Snijd de wafer met een diamantslijper
16. Monteer de wafer op een glasplaatje met behulp van epoxy
17. Fluorosilanize de wafer (zie de instructies in de replicatie molding)

Replicatie gieten van mPADS

Negatieve Mold

Materialen:

• Wegwerp aluminium weegschuitje
• Polydimethylsiloxaan (PDMS) basis en verharder (Dow, Midland, MI)
• Scheermesje
• Silaan: (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-trichloorsilaan
• Glasplaatje
• Glas Pasteur pipet

Methode:

1. Meng PDMS 10:01 door gewicht en Degas in onder vacuüm gedurende 1 uur om luchtbellen te verwijderen.
2. Plaats silicium meester schimmel in aluminium boot.
3. Omzwenken 50 - 60 g van PDMS meer dan meester schimmel in aluminium boot.
4. Degas onder vacuüm gedurende 30 minuten om luchtbellen te verwijderen.
5. Blow off oppervlakte ingesloten luchtbellen in PDMS met een snelle stoot van de N2.
6. Plaats boot in convectie oven op 110 ° C gedurende 15 minuten tot PDMS is stevig.
7. Weggesneden aluminium boot.
8. Met scheermesje, trim weg PDMS onder silicium meester.
9. Schil PDMS uit de buurt van silicium meester langzaam en met een constante beweging in een richting om te voorkomen dat de vernietiging van de meester.
10. Inspecteer silicium master voor schade.
11. Snijd een negatieve mal in 4 stukken.
12. Herhaal de stappen 1-10 voor een grote partij van negatieve mallen.
13. Zuurstof plasma te behandelen negatieve mal voor 1,5 minuut naar de oppervlakte te activeren, of
14. Ozon behandelen negatieve mal voor 10 minuten naar de oppervlakte te activeren.
15. Plaats een negatieve schimmels in exsiccator met blootliggende mPAD functies.
16. Verspreid 250-500 pi van silaan op glasplaatje in het midden van exsiccator
17. Plaats glazen pipet weide met 150-200 pi van silaan in de opening in exsiccator.
18. Vacuümkamer om silaan en vacht negatieve mallen verdampen gedurende> 14 uur.

mPADS

Materialen:

• Polydimethylsiloxaan (PDMS) basis en verharder (Dow, Midland, MI)
• Wide-mond wegwerp overdracht pipetten
• 2 "x 3" Glas dia's
• Glas Scribe
• N2

Methode:

1. Meng PDMS 10:01 door gewicht en Degas in onder vacuüm gedurende 1 uur om luchtbellen te verwijderen.
2. kant gesilaniseerd negatieve mallen in de 'cross'
3. Pipetteer PDMS in negatieve mallen, zodat de functies zijn volledig bedekt met een 1mm dikte.
4. Wacht 30 minuten om eventuele luchtbellen in het PDMS te stijgen naar de oppervlakte. </ Li>
5. In de 30 'downtime, stof 22x22mm (nr. 2) glas dekglaasjes met een stroom van N2.
6. Zuurstof plasma te behandelen glaasjes helften gedurende 1,5 minuten schoon te maken en te activeren glas
7. Blow off oppervlakte ingesloten luchtbellen in PDMS met een snelle stoot van de N2.
8. Leg rand van het glas dekglaasje op de PDMS met plasma gereinigd zijde naar het PDMS. Langzaam de glazen schuif, zodat het PDMS volledig contact komt met het volledige glasoppervlak en vermijd luchtbellen vast komen te zitten onder het glaasje.
9. Plaats schimmels in convectieoven geassembleerd bij 110 ° C gedurende 20 uur om volledig te genezen.
10. Verwijder de mallen uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.
11. Houd glasplaatje met een hand op de top en langzaam schil negatief af van de negatieve mal van de bodem naar de mPAD vrij te geven.
12. Inspecteer de mPAD onder een microscoop voor ingestort berichten.
13. Re-silaniseren schimmel via het plasma en silaan om de vier gietstukken. De negatieve mal levensduur voor een goede replicatie is ongeveer 60-20 werpt.

Cellen zaaien op mPADS

Stempelen

Materialen:

• PDMS postzegels voor UCP (zie Tien, J & Chen, CS, in Methoden van Tissue Engineering, 2001, p. 113-120.)
• Ethanol (100% en 70%)
• Gesteriliseerd gedeïoniseerd water
• 50 ug / ml humaan fibronectine in steriel gedeïoniseerd water (BD Biosciences)
• 5 ug / ml DII oplossing gefilterd met 0,2 micrometer membraan (D-3886, Molecular Probes, OR)
• 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, New Jersey)
• 1X fosfaatbufferoplossing.
• 100 mm x 25 mm petrischaal (4)
• 150 mm x 25 mm petrischaal (2)
• Aluminiumfolie
• N2
• Pincet
• Steriel Hood

Methode:

1. Trim overtollige PDMS van mPADs
2. Als het PDMS stempel is eerder gebruikt, ultrasone trillingen postzegels in 100% ethanol gedurende 5 minuten te schrobben weg verontreinigende eiwitten.
3. In steriele kap, houdt stempels op hun zij met een pincet en droog met N2 na het dompelen postzegels in verse 100% ethanol en steriel water
4. Plaats in de 150 mm petrischaal met werkende kant naar boven.
5. Aliquot druppels van fibronectine oplossing op de postzegel. Begin met de hoeken op elk van de zegels, dan de randen, en ten slotte de binnenlandse gebieden. Aanvankelijk was de PDMS oppervlak van de stempel is hydrofoob, maar wordt hydrofiele als het eiwit is geadsorbeerd. Werken 'buiten naar binnen' verandert de contacthoek van de PDMS, zodat een lager volume van fibronectine oplossing nodig om volledig de vacht van de stempel.
6. Laat zitten voor een uur in de kap voor eiwitadsorptie.
7. Was postzegels met DI-water gieten in de schaal en laat het waterpeil stijgen over de postzegels.
8. Was de stempels in 100 mm petrischaal gevuld met DI-water.
9. Te verwijderen en droog met N2.
10. Ozon behandelen mPADS 7 minuten naar de oppervlakte te activeren voor het stempelen.
11. Onder de motorkap, stempel mPADS door het plaatsen van stempel voorsprong op mPAD en voorzichtig te verlagen om full contact te maken. Zachtjes tik op de bovenkant van de stempel met een pincet om te zorgen dat alle gebieden hebben een goed contact, maar wees voorzichtig niet instorten van de berichten.
12. Verwijder voorzichtig postzegels met een pincet.
13. Dompel mPADS in 100 mm petrischaal met 100% ethanol voor ~ 15 seconden. Houden micronaalden van dewetting tijdens overdracht door de overdracht snel tussen gerechten.
14. Dompel mPADS in 100 mm petrischaal met 70% ethanol voor ~ 15 seconden.
15. Dompel mPADS in 100 mm petrischaal met DI water voor ~ 15 seconden.
16. Dompel mPADS in de tweede 100 mm petrischaal met DI water voor ~ 15 seconden.
17. Dompel mPADS in 150 mm petrischaal met DI-water.
18. Dompel mPADS in 150 mm petrischaal met 100 ml Dii oplossing.
19. Dek af met aluminiumfolie en genieten gedurende 1 uur.
20. Dompel mPADS in 100 mm petrischaal met DI water voor ~ 15 seconden.
21. Dompel mPADS in 150 mm petrischaal met 10 ml van 2% Pluronics en 90 ml PBS voor de totale concentratie van 0,2% Pluronics.
22. Cover en geniet voor 1 uur.
23. Dompel mPADS in 100 mm petrischaal met DI water voor ~ 15 seconden.
24. Dompel mPADS in de tweede 100 mm petrischaal met DI water voor ~ 15 seconden.
25. Dompel mPADS in de derde 100 mm petrischaal met PBS voor ~ 15 seconden.

Zaaien

Materialen:

• Gekozen cellijn
• Trypsine-EDTA (0,25% trypsine met EDTA • 4NA, Gibco Cat Neen. 25200-056)
• Groeimedium
• 1X fosfaatbufferoplossing.

Methode:

1. In steriele kap, plaats mPADS in 100 mm petrischaal en vul deze met 17 ml medium.
2. Plaats petrischaal in incubator op te warmen tot 37 ° C
3. Schorten cellen via trypsine
4. Aspireren herhaaldelijk te breken cel clusters.
5. Pipet celsuspensie in de petrischaal met de mPADS. Voeg cellen zodanig zullen zij blijven enkele cellen (zonder cel-cel contacten) op het moment van de analyse. Het exacte bedrag van de cellen toe te voegen is het cel-type specifieke enafhankelijk van de cel verspreid gebied en groei.
6. Voorzichtig verspreiden cellen in petrischaal met langzame pippetting.
7. Plaats in de incubator gedurende 2 uur, zodat cellen om zich te vestigen en zich op micronaaldjes.
8. Inspecteer mPADS om te zien of zich hebben verspreid. De cellen zullen kijken afgeplat en span zes of meer berichten.
9. Als cellen worden verspreid, transfer mPADS nieuwe 100 mm petrischaal met 21 ml vers medium.
10. De mPADS zijn klaar voor uw experiment.

Vlekken en montage mPADS

Bevestiging

Materialen:

• Gedeïoniseerd water
• Paraformeldahyde (16%) flacon
• 10X fosfaatbufferoplossing.
• 1X fosfaatbufferoplossing.

Methode:

1. In een 50 ml centrifugebuis, voeg 30 ml van DI, 10 ml paraformeldahyde (gehele flacon), en 4,5 ml van 10X PBS voor de vaststelling oplossing.
2. Voeg ~ 25 ml van de vaststelling van oplossing voor een 100 mm petrischaal.
3. Voorzichtig onderdompelen mPAD met cellen in de vaststelling schaal en laat incubeer gedurende 20 minuten.
4. Dompel mPADS in 100 mm schotel met 1X PBS drie keer.
5. Klaar voor immunokleuring en montage.

Het analyseren van Cellular Krachten op mPADS

Confocale Imaging

Materialen:

• Confocale microscoop
• 63x Doel
• Filter blokjes voor secundaire antilichamen
• Groen filter kubus (Rhodamine) voor DII beeldvorming van micronaaldjes.

Methode:

1. Plaats mPADs op het podium en vinden enkele cellen met 300 ms blootstelling, geen binning.
2. Afbeelding toppen van micronaaldjes voor TOP IMAGE.
3. Met behulp van z-control uitlezen, vast te leggen beeld van micronaaldjes voor onderste afbeelding.
4. Afbeelding alle andere kanalen heb je vlekken in (Hoechst, phalloidin etc.)

Beeldanalyse

Materialen:

• MATLAB met Image Processing Toolbox

Methode:

1. Draaien en registreren boven-en onderkant beelden
2. Maat hartlijnen van de bodem (undeflected) en top (afgebogen) posities
3. Bereken de verplaatsing
4. Met behulp van de veerconstante voor de posten (bekend, afhankelijk van de plaatsen geometrie), berekenen van kracht vector op elke post
5. Fout analyse is gebaseerd op het vermogen om de krachten op te lossen, en is afhankelijk van de beeldresolutie en het zwaartepunt detectie van resolutie
6. Schik de gegevens als per uw specifieke wensen tegemoetkomt - bijvoorbeeld, kracht grootheden en / of richting, als een tijdsverloop, veel metingen over de verschillende voorwaarden, etc.