Сообщение Microfabricated-Array-детекторы (ПЗРК): Подход к изолят механических сил

Summary

В этом видео показано, как изготовить и использовать microfabricated сообщение детекторов массива (ПЗРК) с целью оценки модуляции клеточного сократимость.

Abstract

В этом видео мы представим наш подход для измерения силы тяги сотовой использованием microfabricated массив сообщений. Тяговые силы возникают через миозина-актина взаимодействия и играют важную роль в нашей физиологии. Во время разработки, они позволяют клеткам перемещаться из одного места к другому в целях формирования ранней структуры ткани. Тяговые силы помогают в исцелении процессов. Они необходимы для надлежащего закрытия раны или миграции и ползающих лейкоцитов через наше тело. Те же самые силы могут быть вредными для нашего здоровья и в случае метастазов рака или сосудистых рост по отношению к опухоли. Наиболее распространенным методом для изучения клеток в пробирке в том, чтобы использовать стеклянную или полистирола блюдо. Тем не менее, жесткость подложки делает невозможным физически мера ячейки силы тяги, и Есть относительно немного методов исследования тяговых усилий. Наша лаборатория разработала технику, чтобы преодолеть эти ограничения. Метод основан на вертикальный ряд гибких консолей, жесткость и размер масштаб которых таковы, что отдельные клетки распространяются во многих консолей и отразить их в процесс. Столбы которые мы используем, 3 мкм в диаметре, 10 мкм в высоту и настраиваются в обычный массив с 9 мкм от центра до центра интервала. Но эти физические размеры можно легко изменить для учета различных исследований. Начнем с мастером кремния, но окончательные сообщения сделаны из силиконовой резины, которая называется поли (диметил силоксан), или PDMS. Мы можем измерить отклонения под микроскопом, и рассчитать величину и направление тяговых усилий, необходимых для производства наблюдается отклонений. Мы называем эти субстраты microfabricated пост-массива детекторов, или ПЗРК. Здесь мы покажем вам, как мы изготавливаем и использования ПЗРК для оценки модуляции клеточного сократимость.

Protocol

Кремний Мастер Mold Изготовление

Литография

Материалы по теме:

• 75 мм кремниевые пластины
• SU-8 2 Отрицательные фоторезиста (Microchem, Бостон, Массачусетс)
• N2

Метод:

1. Дегидрировать Si пластин при 120 ° С в течение 2 часов.
2. УФ поверхности лечения озоном в течение 7 минут, чтобы удалить органические вещества.
3. N2 удар поверхность, чтобы удалить твердые частицы.
4. Применить SU-8 2 для покрытия 70% поверхности (~ 10 мл на 75 мм пластины).
5. Спиновые при 2000 оборотов в минуту в течение 20 секунд с 300 оборотов в минуту ускорение / с.
6. Место пластины на плиту и рампы от комнатной температуры до 95 ° C.
7. Softbake фоторезиста в течение 15 минут при температуре 95 ° C.
8. Потоп подвергать пластине в течение 20 - 25 мДж/см2 доза при 365 нм (I-линии), чтобы сформировать нижний слой.
9. Применить SU-8 2 для второго слоя фоторезиста.
10. Спиновые при 550 оборотов в минуту в течение 20 секунд с 300 об / сек ускорение около 11 мкм толщины пленки.
11. Место пластины на плиту и рампы от комнатной температуры до 65 ° C.
12. Softbake пластин при 65 ° С в течение 5 минут.
13. Рампа плиту от 65 ° C до 95 ° C.
14. Softbake пластине в течение 55 минут при 95 ° C.
15. Прохладный пластины к комнатной температуре в течение 20 минут.
16. Совместите mPAD маски на пластине и выставить на 95 - 100 мДж/см2 доза при 365 нм (I-линии).
17. Место пластины на плиту и рампы от комнатной температуры до 95 ° C.
18. Постконтактная испечь фоторезиста в течение 25 минут при температуре 95 ° C.

Развивать

Материалы по теме:

• 100мм блюда стекла (5)
• Пропиленгликоль метиловый эфир уксусной кислоты (PGMEA)
• Изопропанол (IPA)
• N2

Метод:

1. В химической капот, заполнить пять блюд с PGMEA (2), ПНД и гексан (2).
2. Держите пластин в первом PGMEA в течение 10 секунд
3. Перемешивают пластине в течение 50 секунд
4. Передача пластины для второго PGMEA с мениском PGMEA.
5. Перемешивают в течение 5 секунд.
6. Передача пластины к МПА с мениском PGMEA.
7. Перемешивают в течение 20 секунд.
8. Передача пластины к первому АПИ.
9. Перемешивают в течение 5 секунд.
10. Передача пластины для второго АПИ.
11. Перемешивают в течение 5 секунд.
12. Быстро удалить пластину из второго МПА с мениском МПА и сухой с N2
13. Осмотрите картины.
14. Hardbake пластины при температуре 120 ° С в течение 14-20 часов сшивки SU-8.
15. Dice пластины с резаком алмаз
16. Горы пластины на предметное стекло использованием эпоксидных
17. Fluorosilanize пластины (см. инструкции в репликации литье)

Репликация формования ПЗРК

Отрицательные Mold

Материалы по теме:

• Одноразовые алюминия весом лодке
• Полидиметилсилоксан (PDMS) базы и отвердителя (Dow, Midland, MI)
• Razorblade
• Силан: (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-трихлорсилана
• Стекло
• Стекло Пастера Пипетки

Метод:

1. Смешайте PDMS 10:01 по весу и дегазации в условиях вакуума в течение 1 часа, чтобы удалить пузырьки.
2. Место кремния мастер форм в алюминиевой лодке.
3. Налейте 50 - 60 г PDMS над мастером форм в алюминиевой лодке.
4. Дега под вакуумом в течение 30 минут, чтобы удалить пузырьки.
5. Удар от поверхности-ловушки пузырьков воздуха в PDMS с быстрой взрыв N2.
6. Место лодке в конвекционной печи при температуре 110 ° С в течение 15 минут, пока PDMS является фирма.
7. Срежьте алюминиевой лодке.
8. С лезвие бритвы, вырезать PDMS под кремния мастера.
9. Пил PDMS от мастера кремния медленно и с постоянным движением в одном направлении, чтобы избежать уничтожения хозяина.
10. Осмотрите кремния мастером на предмет повреждений.
11. Сокращение отрицательного плесень на 4 части.
12. Повторите шаги 1-10 для крупной партии отрицательные формы.
13. Кислород плазмы лечения отрицательные формы для 1,5 минуты для активации поверхности, или
14. Озон лечения отрицательные формы в течение 10 минут, чтобы активировать поверхность.
15. Место отрицательных форм в эксикаторе с особенностями mPAD подвергается.
16. Распространение 250-500 мкл силана на предметное стекло в центре эксикаторе
17. Место стекла пастбище пипетки с 150-200 мкл силана на кончике внутри эксикаторе.
18. Вакуумная камера для испарения силана и пальто отрицательные формы для> 14 часов.

ПЗРК

Материалы по теме:

• Полидиметилсилоксан (PDMS) базы и отвердителя (Dow, Midland, MI)
• Широкий рот одноразовой пипетки передачи
• 2 "х 3" слайды стекло
• Стекло Scribe
• N2

Метод:

1. Смешайте PDMS 10:01 по весу и дегазации в условиях вакуума в течение 1 часа, чтобы удалить пузырьки.
2. кружева silanized отрицательные формы в "крест"
3. Внесите PDMS в отрицательную формы так, чтобы функции полностью покрыты толщиной 1 мм.
4. Подождите 30 минут для любых воздушных пузырей в PDMS подняться на поверхность. </ LI>
5. В 30 'простоя, пыли 22x22mm (№ 2) покровные стекла с потоком N2.
6. Кислород плазмы слайды лечения стекла половин за 1,5 минут, чтобы очистить и активировать стекла
7. Удар от поверхности-ловушки пузырьков воздуха в PDMS с быстрой взрыв N2.
8. Положите край стекло покровное на PDMS с плазмой очищены стороной PDMS. Медленно опустите стекло так, чтобы полностью PDMS контактов всей поверхности стекла и избежать воздушных пузырей застревать под стекло.
9. Место собраны форм в конвекционной печи при температуре 110 ° С в течение 20 часов, чтобы полностью вылечить.
10. Удалить формы из духовки и дайте им остыть до комнатной температуре.
11. Держите стекло с одной стороны, сверху и медленно корка отрицательные прочь отрицательные формы со дна, чтобы освободить mPAD.
12. Осмотрите mPAD под микроскопом на рухнул сообщений.
13. Re-silanize плесень через плазму и силана каждые четыре отливок. Отрицательные формы жизни для хорошего репликации составляет примерно 6-20 отливок.

Посев клеток на ПЗРК

Штамповка

Материалы по теме:

• PDMS штампы для UCP (см. Тянь-, J & Chen, CS, в методы тканевой инженерии, 2001, стр. 113-120.)
• Этанол (100% и 70%)
• Стерилизованное Деионизированная вода
• 50 мкг / мл правам Фибронектин в стерильной деионизованной воде (BD Biosciences)
• 5 мкг / мл DII Решение фильтруется с 0,2 мкм мембраны (D-3886, Molecular Probes, OR)
• 2% Pluronics F127 (BASF, Маунт Олив, Нью-Джерси)
• 1X фосфатного буфера решение.
• 100 мм х 25 мм чашки Петри (4)
• 150 мм х 25 мм чашки Петри (2)
• Алюминиевая фольга
• N2
• Пинцет
• Стерильные Худа

Метод:

1. Обрезать избыток PDMS от ПЗРК
2. Если штамп PDMS был использован ранее, разрушать ультразвуком марки в 100%-ным этанолом в течение 5 минут, чтобы вычистить от загрязняющих белков.
3. В стерильных капот, удерживая марки на боку с помощью пинцета и сухой с N2 после погружения в пресной марки 100% этанола и стерильной воды
4. Место в 150 мм чашки Петри с рабочей стороной вверх.
5. Алиготе капель фибронектина решение по каждой марке. Начните с угла на каждой из марок, то края, и, наконец, внутренние районы. Первоначально Поверхность PDMS штампа является гидрофобной, но становится гидрофильной как белка адсорбируется. Рабочие «снаружи внутрь» изменения краевого угла PDMS, так что меньший объем фибронектина решения, необходимые для полного пальто марки.
6. Дайте настояться в течение 1 часа в капюшоне для адсорбции белка.
7. Вымойте марок с водой Д. И., вливая в блюдо и дать уровень воды поднимается над марок.
8. Вымойте марок в 100 мм чашках Петри с водой DI.
9. Удалите и насухо N2.
10. ПЗРК Озон лечения в течение 7 минут, чтобы активировать поверхность для штамповки.
11. Под капотом, штамп ПЗРК поставив штамп на краю mPAD и мягко снижения, чтобы сделать полный контакт. Слегка нажмите на верхнюю часть штампа с помощью пинцета, чтобы обеспечить все районы хороший контакт, но будьте осторожны, чтобы не свернуть сообщения.
12. Осторожно снимите марки с помощью пинцета.
13. Погрузите ПЗРК в 100 мм чашки Петри со 100% этанола в течение ~ 15 секунд. Держите микроигл от осушки во время передачи путем перечисления быстро между блюдами.
14. Погрузите ПЗРК в 100 мм чашки Петри с 70% этанола в течение ~ 15 секунд.
15. Погрузите ПЗРК в 100 мм чашки Петри с DI воды в течение ~ 15 секунд.
16. Погрузите ПЗРК во второй 100 мм чашки Петри с DI воды в течение ~ 15 секунд.
17. Погрузите ПЗРК в 150 мм чашках Петри с водой DI.
18. Погрузите ПЗРК в 150 мм чашки Петри с 100 мл раствора DII.
19. Накрыть алюминиевой фольгой и выдержите в течение 1 часа.
20. Погрузите ПЗРК в 100 мм чашки Петри с DI воды в течение ~ 15 секунд.
21. Погрузите ПЗРК в 150 мм чашки Петри по 10 мл 2% Pluronics и 90 мл ФСБ по суммарной концентрации 0,2% Pluronics.
22. Накройте и выдержите в течение 1 часа.
23. Погрузите ПЗРК в 100 мм чашки Петри с DI воды в течение ~ 15 секунд.
24. Погрузите ПЗРК во второй 100 мм чашки Петри с DI воды в течение ~ 15 секунд.
25. Погрузите ПЗРК в третьи 100 мм чашки Петри с PBS в течение ~ 15 секунд.

Посев

Материалы по теме:

• Выбранный клеточной линии
• Трипсин-EDTA (0,25% трипсина с ЭДТА • 4Na, Gibco Кат. 25200-056)
• Рост среднего
• 1X фосфатного буфера решение.

Метод:

1. В стерильных капот, место ПЗРК в 100 мм Петри блюдо и залейте 17 мл среды.
2. Место Петри в инкубаторе, чтобы нагреть до 37 ° C
3. Приостановить клеток с помощью трипсина
4. Аспирируйте неоднократно разбить ячейки кластеров.
5. Внесите суспензии клеток в чашке Петри с ПЗРК. Добавить клетки, такие они останутся отдельные клетки (без межклеточных контактов) во время анализа. Точное количество клеток добавить, камерного типа и конкретныхзависит от ячейки области распространения и темпы роста.
6. Аккуратно разгона клеток в чашки Петри с медленным pippetting.
7. Место в инкубаторе в течение 2 часов, чтобы позволить клеткам для проведения расчетов и придерживаться на микроигл.
8. Осмотрите ПЗРК чтобы увидеть, если клетки распространились. Клетками будет выглядеть плоской и в шести или более сообщений.
9. Если ячейки распространение, передача ПЗРК к новым 100 мм блюдо Петри с 21 мл свежей среды.
10. ПЗРК готовы к эксперименту.

Окрашивание и монтажные ПЗРК

Фиксация

Материалы по теме:

• Дистиллированная вода
• Paraformeldahyde (16%) флаконе
• 10X буферного раствора фосфата.
• 1X фосфатного буфера решение.

Метод:

1. В 50 мл центрифужную пробирку, добавьте 30 мл Д.И., 10 мл paraformeldahyde (весь флакон) и 4,5 мл 10х PBS для фиксации решения.
2. Добавить ~ 25 мл фиксации решение 100 мм блюдо Петри.
3. Осторожно погрузите mPAD с ячейками в фиксации блюдо и пусть инкубировать в течение 20 минут.
4. Погрузите ПЗРК в 100 мм блюдо с 1X PBS три раза.
5. Готов к иммунной и монтаж.

Анализ Сотовая сил по ПЗРК

Конфокальной микроскопии

Материалы по теме:

• Конфокальной микроскопии
• Цель 63x
• Фильтры кубы для вторичными антителами
• Зеленый фильтр куб (родамин) для визуализации DII микроигл.

Метод:

1. Место ПЗРК на сцене, и найти отдельные клетки с 300 мс экспозиции, не биннинга.
2. Изображение вершины микроигл для TOP IMAGE.
3. Использование Z-контроль считывания, захват изображения микроигл для нижнее изображение.
4. Изображение любые другие каналы у вас есть пятна в (Hoechst, фаллоидином и т.д.)

Анализ изображений

Материалы по теме:

• MATLAB с Image Processing Toolbox

Метод:

1. Поворот и зарегистрировать верхней и нижней изображений
2. Мера центроиды снизу (неотклоненный) и сверху (отклоняется) позиции
3. Вычислить смещение
4. Использование пружины для сообщений (известно, зависит от должности геометрии), рассчитать вектор силы на каждый пост
5. Ошибка анализ основан на способности решить силами, а зависит от разрешения изображения и тяжести разрешение обнаружения
6. Упорядочить данные в соответствии с вашими индивидуальными потребностями - например, величины силы и / или направлении, как время, конечно, много измерений в различных условиях и т.д.