Microfabricated Post-Dizi-Dedektörleri (mPADs): Mekanik Kuvvetleri yalıtın bir Yaklaşım

Summary

Bu video, hücresel kontraktilite modülasyon değerlendirmek için microfabricated sonrası dizi dedektörleri (mPADs) imal ve nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Abstract

Bu video, mesaj microfabricated bir dizi kullanarak hücresel çekiş kuvvetleri ölçmek için bir yaklaşım sunacak. Çekiş güçleri miyozin aktin etkileşimleri ile üretilen ve bizim fizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Gelişimi sırasında, hücrelerin doku erken yapıları oluşturmak için bir yerden amacıyla önümüzdeki geçmek için olanak sağlar. Çekiş güçleri iyileşme süreçlerine yardımcı olur. Bunlar doğru yaraların kapatılması ya da vücuda göç ve lökositlerin sürünerek için gerekli. Bu aynı güçler kanser metastazı ya da vasküler bir tümör doğru büyüme durumda sağlığımız için zararlı olabilir. Hücreleri in vitro olarak incelemek için en yaygın yöntem, bir cam veya polistiren çanak kullanmak olmuştur. Ancak, yüzeylerde katılık imkansız fiziksel hücre çekiş kuvvetleri ölçmek için yapar, ve çekiş güçleri çalışma nispeten birkaç yöntem vardır. Bizim laboratuvar, bu sınırlamaları aşmak için bir teknik geliştirdi. Bu yöntem, tek tek hücrelerin birçok konsol yayılmış ve bu süreç içinde onları saptırmak gibi esnek olan konsol, sertlik ve büyüklük ölçeği dikey bir dizi dayanmaktadır. Biz kullanmak sütunlar, çapı 3 mm, 10 mm boyunda, ve 9 mm merkez-merkez aralığı ile düzenli bir dizi yapılandırılır. Ama bu fiziksel boyutları çeşitli çalışmalarda kolayca uyum sağlamak için çeşitli olabilir. Biz bir silikon ana ile başlar, ancak son mesaj silikon kauçuk poli (dimetil siloksan) veya PDMS adlı yapılmış. Biz mikroskop altında deplasmanlar ölçmek ve gözlemlenen deplasmanlar üretmek için gerekli çekiş güçleri büyüklüğünü ve yönünü hesaplayabilirsiniz. Biz bu yüzeylerin post-dizi-dedektörleri, ya da mPADs microfabricated diyoruz. Burada, biz mPADs imal ve hücresel kontraktilite modülasyon değerlendirmek için nasıl kullandıklarını size gösterecektir.

Protocol

Silikon Usta Kalıp İmalat

Litografi

Malzemeler:

• 75 mm Silikon gofret
• SU-8 2 Negatif rezist (Microchem Boston, MA)
• N2

Yöntem:

1. 2 saat boyunca 120 ° C'de Si levhası dehydrate.
2. 7 dakika UV ozon tedavi yüzeyi organik kaldırın.
3. N2 darbe yüzey parçacık kaldırmak için.
4. Uygula SU-8 yüzeyinin% 70 (75 mm gofret ~ 10 ml) kapsayacak şekilde 2.
5. 300 dev / s hızlanma ile 20 saniye boyunca 2000 rpm'de Spin.
6. 95 ° C'ye kadar oda sıcaklığında bir ocak ve rampa gofret yerleştirin
7. Fotorezist Softbake 15 dakika boyunca 95 ° C
8. Sel gofret maruz 20 - 25 mJ/cm2 doz 365 nm (I-line) alt tabaka oluşturur.
9. Uygula SU-8 ikinci fotorezist katman için 2.
10. 300 dev / s hızlanma yaklaşık 11 mikron kalınlık film için 20 saniye boyunca 550 rpm'de Spin.
11. 65 ° C'ye kadar oda sıcaklığında bir ocak ve rampa gofret yerleştirin
12. 65 ° C'de 5 dakika gofret Softbake.
13. 65 ocak Rampa ° C - 95 ° C
14. Gofret Softbake 55 dakika için 95 ° C
15. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında serin gofret.
16. Gofret mPAD maske aynı hizaya getirin ve 95 için maruz - 365 nm (I-line) 100 mJ/cm2 doz.
17. 95 ° C'ye kadar oda sıcaklığında bir ocak ve rampa gofret yerleştirin
18. Maruziyet sonrası 95 ° C fotorezist fırında 25 dakika

Geliştirmek

Malzemeler:

• 100mm cam yemekleri (5)
• Propilen glikol, metil eter asetat (PGMEA)
• Isopropanol (IPA)
• N2

Yöntem:

1. Kimyasal bir kaput, PGMEA (2), IPA ve Hekzan (2) beş yemekleri ile doldurun.
2. 10 saniye süreyle 1. PGMEA gofret tutun
3. 50 saniye için gofret çalkalayın
4. PGMEA, menisküs 2. PGMEA gofret aktarın.
5. 5 saniye çalkalayın.
6. PGMEA, menisküs IPA gofret aktarın.
7. 20 saniye çalkalayın.
8. 1. IPA gofret aktarın.
9. 5 saniye çalkalayın.
10. 2. IPA gofret aktarın.
11. 5 saniye çalkalayın.
12. IPA menisküs ile hızla 2. IPA gofret kaldırmak ve kuru N2
13. Desen kontrol edin.
14. 120 ° C 14-20 saat süreyle çapraz bağ SU-8 Hardbake gofret.
15. Elmas kesici ile gofret Zar
16. Epoksi kullanarak bir cam slayt Mount gofret
17. Gofret Fluorosilanize (çoğaltma kalıplama talimatlara bakın)

MPADS, Çoğaltma kalıplama

Negatif Kalıp

Malzemeler:

• Tek kullanımlık alüminyum ağırlığındaki tekne
• Polidimetilsiloksan (PDMS) kaide ve sertleştirici (Dow, Midland, MI)
• Razorblade
• Silan: (tridecafluoro-1 ,1,2,2 tetrahyrooctyl)-1-trichlorosilane
• Cam slayt
• Cam Pasteur Pipet

Yöntem:

1. Kabarcıklarını çıkarmak için 1 saat süreyle vakum altında ağırlık ve gazını PDMS 10:01 karıştırın.
2. Place silikon ana kalıp alüminyum tekne.
3. 50 - 60 gr alüminyum tekne ana kalıp üzerinde PDMS dökün.
4. Degas, vakum altında kabarcıklarını çıkarmak için 30 dakika boyunca.
5. N2 hızlı patlama ile PDMS yüzey hava kabarcığı üfleyin.
6. 110 konveksiyon fırın Yeri tekne ° C 15 dakika boyunca PDMS firmadır kadar.
7. Alüminyum tekne kesip.
8. Jilet, silikon ana altında PDMS uzak trim.
9. Peel PDMS silikon ana uzak ana yavaş ve sabit bir yönde hareketi ile yok önlemek için.
10. Silikon ana hasar olmadığını kontrol edin.
11. 4 adet negatif kalıp kesin.
12. 1-10 negatif kalıp büyük bir parti için adımları tekrarlayın.
13. Oksijen plazma yüzey aktif hale getirmek için 1,5 dakika boyunca negatif kalıp tedavi ya da
14. Ozon yüzey aktif hale getirmek için 10 dakika boyunca negatif kalıp tedavi.
15. Maruz mPAD özellikleri ile Desikatörde negatif kalıplara yerleştirin.
16. Desikatöre merkezi cam slayt silan 250-500 mcL yayıldı
17. Desikatöre içindeki ucu silan 150-200 mcL Yeri cam mera pipet.
18. > 14 saat süreyle vakum odasına silan ve kat olumsuz kalıp buharlaşması için.

mPADS

Malzemeler:

• Polidimetilsiloksan (PDMS) kaide ve sertleştirici (Dow, Midland, MI)
• Geniş ağız tek transfer pipetler
• 2 "x 3" Cam slaytlar
• Cam Scribe
• N2

Yöntem:

1. Kabarcıklarını çıkarmak için 1 saat süreyle vakum altında ağırlık ve gazını PDMS 10:01 karıştırın.
2. 'çapraz' Silanlanmış negatif kalıpları dantel
3. Pipet PDMS özellikleri negatif kalıplar içine 1mm kalınlık için tam bir kaplıdır böylece.
4. Yüzeye yükselmeye PDMS herhangi bir hava kabarcığı için 30 dakika bekleyin. </ P>
5. 30 'kesinti N2 akışı, toz 22x22mm (2) sayılı cam lamelleri.
6. Oksijen plazma tedavi cam slaytlar camını temizlemek ve etkinleştirmek için 1,5 dakika boyunca yarı yarıya
7. N2 hızlı patlama ile PDMS yüzey hava kabarcığı üfleyin.
8. Ile PDMS PDMS bakan plazma temizlenir yan cam lamel kenarına hafifçe yatıyordu. Yavaşça cam slayt düşük PDMS tamamen rehber tüm cam yüzey ve cam slayt altında hapsolmuş hava kabarcıklarını önlemek.
9. Yeri 110 ° C 20 saat boyunca tam olarak tedavi etmek konveksiyon fırın kalıpları toplandı.
10. Kalıpları fırından çıkarın ve RT soğumasını bekleyin.
11. Bir üst el ve yavaş yavaş olumsuz kabuğu mPAD serbest bırakmak için alttan olumsuz kalıp ile cam slayt tutun.
12. MPAD çökmüş mesajları için bir mikroskop altında inceleyin.
13. Plazma ve silan her dört döküm ile yeniden silanize kalıp. Iyi çoğaltma için negatif kalıp ömrü yaklaşık 6-20 atmalarını.

MPADS üzerine Seeding Hücreler

Presleme

Malzemeler:

• UCP PDMS pulları (Doku Mühendisliği Yöntemleri Tien, J & Chen, CS, 2001, s. 113-120.)
• Etanol (% 100 ve% 70)
• Steril Deiyonize su
• Steril deiyonize su 50 ug / ml İnsan Fibronektin (BD Biosciences)
• 5 ug / ml DII Çözüm 0.2 mikron membran (D-3886, Moleküler Probları, OO) ile filtre
• % 2 Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, NJ)
• 1X Fosfat Tampon Çözüm.
• 100 mm x 25 mm petri (4)
• 150 mm x 25 mm petri (2)
• Alüminyum folyo
• N2
• Cımbız
• Steril Hood

Yöntem:

1. MPADs gelen Trim aşırı PDMS
2. PDMS damgası daha önce kullanılmış ise% 100 etanol içinde 5 dakika boyunca kontaminasyona yol açan protein uzak fırçalayın pulları sonikasyon.
3. Taze% 100 etanol ve steril su pul daldırma sonra cımbız ve N2 kuru steril kaput, onların yüzüne pulları tutun
4. Yüzü yukarı 150 mm petri yerleştirin.
5. Kısım, her damga fibronektin çözüm düşer. Sonra her pullarının köşeler, kenarlar ve son olarak da iç bölgeler ile başlayın. Başlangıçta damga PDMS yüzeyi hidrofobik, fakat protein adsorbe olarak hidrofilik olur. Çalışma, "içinde" değişiklik dışında damga tam kat daha düşük bir hacim fibronektin çözüm için gereklidir, böylece PDMS temas açısı.
6. Protein adsorpsiyonu için başlığa 1 saat bekletin.
7. Çanak dökme ve pulları üzerinde su seviyesi yükselmeye izin pulları DI suyla yıkayın.
8. DI su ile dolu 100 mm petri pulları yıkayın.
9. Çıkarın ve N2 ile kurulayın.
10. Ozon tedavisi mPADS 7 dakika damgalama için yüzey aktif hale getirmek için.
11. Kaputun altında, mPAD damga kenarına yerleştirerek ve yavaşça tam temas kurmaya düşürücü mPADS damgası. Tüm alanlarda iyi bir temas sağlamak için cımbız ile pulu üst hafifçe dokunun ama Mesajları çöküşü değil dikkatli olun.
12. Cımbız ile dikkatlice pulları çıkarın.
13. Batmak mPADS ~ 15 saniye için% 100 Etanol ile 100 mm petri. Yemekler arasında hızla transfer ederek, transferi sırasında dewetting gelen microneedles tutun.
14. Batmak mPADS ~ 15 saniye için% 70 Etanol ile 100 mm petri.
15. Batmak mPADS ~ 15 saniye DI su ile 100 mm petri.
16. DI su ~ 15 saniye ile ikinci, 100 mm petri Batmak mPADS.
17. DI su ile 150 mm petri Batmak mPADS.
18. DII çözüm 100 ml ile 150 mm petri Batmak mPADS.
19. Alüminyum folyo ile örtün ve 1 saat bekletin.
20. Batmak mPADS ~ 15 saniye DI su ile 100 mm petri.
21. Batmak mPADS, 10 ml ve 90 ml% 0.2 Pluronics toplam konsantrasyonu PBS ile 2% Pluronics 150 mm petri.
22. Kapak ve 1 saat bekletin.
23. Batmak mPADS ~ 15 saniye DI su ile 100 mm petri.
24. DI su ~ 15 saniye ile ikinci, 100 mm petri Batmak mPADS.
25. Batmak mPADS ~ 15 saniye ile üçüncü PBS 100 mm petri.

Yayımlamak

Malzemeler:

• Seçilen hücre hattı
• Tripsin-EDTA (EDTA • 4NA, Gibco Kedi ile% 0.25 'lik tripsin No 25.200-056.)
• Büyüme Orta
• 1X Fosfat Tampon Çözüm.

Yöntem:

1. Steril kaput, 100 mm petri mPADS ve 17 ml medium ile doldurun.
2. Inkübatör yerleştirin petri 37 sıcak ° C
3. Tripsin yoluyla hücreler Askıya Alma
4. Hücre kümeleri kırmak için art arda aspire edin.
5. MPADS petri içine pipetleyin hücre süspansiyonu. Analiz anda tek hücre (hücre-hücre temas olmadan) kalacak gibi hücreleri ekleyin. Eklemek için hücre tam miktarı hücre türüne özgü vehücre yayılmasını alan ve büyüme hızı bağlıdır.
6. Yavaş pippetting petri hücreler yavaşça dağılırlar.
7. Inkübatör yerleştirin 2 saat hücreleri microneedles üzerine yerleşmek ve bağlı izin vermek.
8. MPADS hücrelerinin yayılmasını olup olmadığını görmek için inceleyin. Hücrelerin basık bakmak ve altı veya daha fazla mesaj yayılan.
9. Hücrelerinin yayılmasını ise, 21 ml taze orta yeni 100 mm petri mPADS aktarmak.
10. MPADS denemeniz için hazır.

MPADS Boyama ve Montaj

Sabitleme

Malzemeler:

• Deiyonize su
• Paraformeldahyde (% 16) flakon
• 10X Fosfat Tampon Çözüm.
• 1X Fosfat Tampon Çözüm.

Yöntem:

1. 50ml santrifüj tüpüne, DI 30 ml, 10 ml paraformeldahyde (tüm flakon), 4.5 ml ve sabitleme çözümü için 10X PBS ekleyin.
2. 100 mm petri çözüm sabitleme ~ 25 ml ekleyin.
3. Yavaşça batığın sabitleme çanak içine hücreleri ile mPAD ve 20 dakika boyunca inkübe sağlar.
4. 1X PBS ile 100 mm çanak üç kez Submerge mPADS.
5. Immün ve montaj için hazır.

MPADS üzerinde Hücresel Kuvvetleri Analizi

Konfokal Görüntüleme

Malzemeler:

• Konfokal Mikroskop
• 63X Amaç
• Filtre küpler sekonder antikorlar
• Microneedles, DII görüntüleme için yeşil ışık filtresi küp (rodamin).

Yöntem:

1. Place sahnede mPADs ve 300 ms maruz kalma, hiçbir binning tek hücreleri bulmak.
2. TOP IMAGE için microneedles Image başında yer alıyor.
3. Z-kontrol grubu kullanarak, ALT GÖRÜNTÜ için microneedles görüntü yakalamak.
4. Image leke (Hoechst, Phalloidin vb.) Herhangi bir diğer kanallar

Görüntü Analizi

Malzemeler:

• MATLAB ile Görüntü İşleme Toolbox

Yöntem:

1. Üst ve alt görüntüleri çevirin ve kayıt
2. Ölçü alt sentroidler (undeflected) ve üst (bükülmesi) konumlarına
3. Deplasman hesaplayın
4. Bahar ileti (bilinen, yazılan geometri bağlıdır) için sürekli kullanarak, her yazılan kuvvet vektörü hesaplamak
5. Hata analizi güçleri çözme yeteneği üzerine kuruludur ve görüntü çözünürlüğü ve ağırlık algılama çözünürlüğü bağlıdır.
6. Farklı koşullar vb genelinde örneğin, kuvvet büyüklükleri ve / veya yön, bir süre ders olarak, birçok ölçümler özelleştirilmiş ihtiyaçlarına göre verileri düzenleyin