Summary
此视频提供了药理学研究，人类TRPA1使用FlexStation 3的渠道的详细协议。该协议包括细胞的准备，染料装载和酶标仪，FlexStation 3操作细节。
Abstract
“分子器件FlexStation 3是一个台式多模酶标仪能够自动在多孔板荧光测量。它是理想的学术环境中高通量屏幕。它集成了一个流体输送模块，配备了多渠道pipetter机读取一列，在一个时间来监视各种荧光试剂的荧光变化。例如，FlexStation 3已被用于研究的Ca 2 +渗透离子通道和G蛋白偶联受体胞内游离Ca 2 +浓度的变化，通过测量的功能。瞬时受体电位（TRP）通道是一个大家族的非选择性阳离子通道，在许多生理和病理的功能发挥的重要作用。 TRP通道是钙离子渗透性和诱导激活后钙离子内流。在这段视频中，我们展示FlexStation 3的应用药理学研究TRPA1通道，为许多有害刺激的分子传感器。 HEK293细胞中瞬时或稳定表达人类TRPA1通道，生长在96孔板，装入一个的Ca 2 +敏感的荧光染料，荧光4，并在这些细胞中实时荧光变化的测量之前和期间的应用一个TRPA1受体激动剂，使用弹性模式FlexStation 3。一个公认的TRPA1受体拮抗剂的作用进行了研究。 SoftMax Pro软件的数据传送构建TRPA1激活剂和抑制剂的浓度 - 反应关系。
Protocol
1。在96孔板细胞的准备
HEK293细胞与人类TRPA1基因瞬时trasfected
- HEK293细胞成长为一到两天贝科的最小必要中等含有4.5 mg / ml的葡萄糖（Thermo Scientific的，SH3002201）（DMEM），辅以10％热灭活胎牛血清（Invitrogen公司，16000-044），50个单位/ ml青霉素和50μg/ mL链霉素（Invitrogen公司，15140-163）。在一天的转染，细胞密度应达到70-90％。
- 大衣96孔板吹打，每孔50μL聚- L -鸟氨酸（Sigma公司P3655，20微克/毫升无菌蒸馏水）和孵化在37℃至少15分钟的彗星。每口井一次冲洗贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）无镁2 +和Ca 2 +（Thermo Scientific的，SH3002803）。该板块可能会留在细胞培养罩了几个小时。
- 对于每一个96孔板以及稀释的1.5 mL Eppendorf管0.2微克的cDNA 25μLOPTI - MEM（Invitrogen公司，31985-070）。扩大比例按井数相同的cDNA转。另外一个单独的1.5 ml Eppendorf管0.4μL脂质体在2000年25μLOPTI - MEM（Invitrogen公司，11668-019）以及每个要转稀。扩大根据的染井总数。
- 简要涡稀释后的cDNA和脂质体2000，并让他们坐了约5分钟，在室温下。
- 转让等体积稀释的脂质体2000包含稀释后的cDNA，涡管，让混合物在室温下坐了15分钟至2小时。在这段时间内，转让的cDNA /脂质体2000的混合物在49μL/聚- L -鸟氨酸的涂层板。
- Trypsinize HEK293细胞（步骤1.1），使用血球或伯爵夫人自动细胞计数器（Invitrogen公司，C10227）计数细胞密度，转移所需的细胞量（一般约〜125,000-150,000细胞/孔）15 ml无菌锥底离心管。在1000 × 5分钟的转速的离心机。 〜1,250,00-1,500,000细胞/毫升在10％热灭活胎牛血清的DMEM培养液补充，但不含抗生素的悬浮细胞。
- 点样98μL细胞悬液，每孔含有脂质体的cDNA - 2000混合使用多pipetter或MicroFill微孔板饮水机（BIO - TEK）。让坐在板至少30分钟在引擎盖之前，加湿细胞培养孵化器。孵育于37℃，5％的CO 2为20-44小时。
对于HEK293细胞中稳定表达TRPA1
- 按照步骤1.2大衣96孔板。
- A. Patapoutian（斯克里普斯研究所）博士，并慷慨地提供诱导的HEK293 - hTRPA1细胞株保持在同一介质为野生型的HEK293细胞（步骤1.1），但辅以5微克/毫升杀稻瘟（Invitrogen公司， A1113902）和50μg/ ml的潮霉素B（Invitrogen公司，10687010）。当细胞密度达到90％左右，trypsinize细胞，计数细胞密度和细胞在5分钟的转速为1000 ×的离心所需数量。在相同的文化与强力霉素（费舍尔，BP26535，0.25微克/毫升）培养基在〜100细胞/ ml密度悬浮细胞。
- 配制细胞悬液，以聚- L -鸟氨酸涂层板在100μL/孔用多pipetter或MicroFill（BIO - TEK）。让坐在板至少30分钟在引擎盖之前，加湿细胞培养孵化器。在37℃，5％的CO 2为16 - 24小时。
2。解决方案
- 汉克的缓冲盐溶液（HBSS）作为细胞外液。它包含（毫米）：137氯化钠，5.4氯化钾，0.25 NA 2 HPO 4，0.44
KH 2 PO 4，1.3，1.0氯化钙硫酸镁 ，1.0 10氯化镁2，使用1N氢氧化钠调整至7.4的pH值，葡萄糖，10 HEPES） 。 - 荧光4缓冲液中包含的HBSS丙磺舒2毫米。使250毫米存量为0.5 N氢氧化钠丙磺舒（Sigma公司，P8761）。在1:125比例稀释到的HBSS。重新调整pH至7.4使用1个N盐酸。
3。细胞装载荧光凌晨4点
- 溶解于912μL无水二甲基亚砜1毫克氟- 4 AM（Invitrogen公司，F14202），使1毫米的原液。荧光4 AM原液可在-20 ° C保存至少一个月。
- 混合10微升1毫米荧光4上午10μL聚醚F - 127（Invitrogen公司，P3000MP，20％（W / V）在DMSO溶液中），然后整个内容传送到5毫升荧光4缓冲液（步骤2.2）辅以0.1％牛血清白蛋白（Sigma公司，A9418）。
- 细胞生长在96孔板（步骤1.7或1.10）80μL/ 2使用洗板机（如来自Bio - TEK ELx405TM）倍的HBSS洗净。
- 新增的氟-4上午装载解决方案（步骤3.2）50μL/孔用多pipetter或MicroFill（BIO - TEK）和板在37 ° C为1小时。
- 洗涤细胞荧光分析缓冲液使用ELx405TM洗板机（2.2）的3倍。最后一次洗涤后，离开的荧光4缓冲液，每孔80μL。
4。制备复合板
- 在1小时细胞加载期间，准备了一系列激动剂的荧光4缓冲液的最终浓度的3倍（或拮抗剂）的3倍稀释。
- 吸取250-300μL的稀释后的复合解决方案，以一个96孔的复合板。安排在同一列的复合板的化合物和相应的阳性和阴性对照的系列稀释，只要有可能，因为FlexStation 3在一次读取一个单个列。
5。读板FlexStation 3
- 打开系统（FlexStation 3，计算机，SoftMax PRO 5.2软件）
- 保存一个新的文件名实验。在设置中，选择FLEX模式，并输入以下值：
协议＃1，受体激动剂的影响 
协议＃2，拮抗效应 
- 一个新的提示框，复合板和阅读板放置到相应的托盘在FlexStation 3，点击“读取”按钮。 FlexStation 3会一次读取一列，并添加化合物在预先设定的时间点，不中断阅读。这大约需要3分钟（5分钟协议＃2）读完一列的机器将继续读取下一列化合物进行补充，为用户在步骤5.2编程，直到所有的列只读。
6。数据分析
- 处理实验数据可直接使用SoftMax PRO 5.2软件或复制并粘贴到任何电子表格程序（如Microsoft Excel，）。使用下面的最小二乘拟合常规构造一个TRPA1受体激动剂flufenamic酸（FFA）的浓度 - 反应曲线。
， 其中 Y是观察到的反应，Y 最大正常化的最大响应，C为相应的药物浓度， 欧共体 50的浓度，引起了半最大反应， 和 N H是明显的Hill系数。一个公认的TRPA1拮抗剂抑制浓度曲线，一个是通过使用固定浓度的FFA（100μM），并逐步增加的化合物A的IC 50值复合浓度，一个是由装修以下最小二乘计算方程。 
，其中Ÿ是在观察响应和Ÿ 最大是规范化的峰值响应，[蚂蚁]是一个的浓度的相应化合物，IC 50的拮抗剂浓度产生的一半，最大抑制游离脂肪酸，引起的反应，N H的表观山系数。
， 其中 Y是观察到的反应，Y 最大正常化的最大响应，C为相应的药物浓度， 欧共体 50的浓度，引起了半最大反应， 和 N H是明显的Hill系数。一个公认的TRPA1拮抗剂抑制浓度曲线，一个是通过使用固定浓度的FFA（100μM），并逐步增加的化合物A的IC 50值复合浓度，一个是由装修以下最小二乘计算方程。 
，其中Ÿ是在观察响应和Ÿ 最大是规范化的峰值响应，[蚂蚁]是一个的浓度的相应化合物，IC 50的拮抗剂浓度产生的一半，最大抑制游离脂肪酸，引起的反应，N H的表观山系数。 7。代表性的成果：
TRPA1是一个渗透性的Ca 2 +离子通道，激活钙离子内流的Ca 2 +敏感的染料，荧光4（1-2），可以通过检测。 ，一个稳定的HEK293 - hTRPA1细胞株用于研究TRPA1受体激动剂和拮抗剂的浓度 - 反应关系。细胞装有荧光凌晨4点，放置在80μL缓冲液，并阅读使用FlexStation 3。录制30秒的基线荧光后，分别加入40μL的TRPA1受体激动剂，FFA系列稀释，每3倍所需的最终浓度，通过多渠道pipetter细胞作为流体模块的一部分FlexStation 3。荧光的变化进行了监测额外的180号ΔF=（F - F 0），F和F 0的阅读兴趣和开始时的荧光值，分别表示为相对荧光4荧光每口井的变化。代表时间课程的痕迹，在一系列的FFA浓度荧光的变化如图所示。 1。注意：在过去的四个游离脂肪酸的浓度，虽然最大的响应水平都差不多，激活动力学的速度显然比在较低的游离脂肪酸浓度较高。因此，要区分这些差异，浓度 - 反应关系是通过测量后，加入不同浓度的FFA（图2）的初始利率的荧光增加（斜率）的构造。半最大效应IVE浓度的FFA（EC 50）被确定为55.4μM（n = 3时）。要测试公认的TRPA1受体拮抗剂，化合物A，我们进行了一个类似的实验，使用的协议＃2（步骤2）。在这种情况下，在30秒（3X理想的最终浓度为40μL），并分别加入系列稀释的拮抗剂FFA的增加了180秒后终浓度为100微米300微米（60μL）。化合物A剂量依赖性降低半的最大抑制浓度（IC50）为4.3μM（N = 3）（图2）为FFA的TRPA1细胞的反应。
图1。FFA的浓度依赖性地激活人力TRPA1 。痕迹随着时间的推移增加FFA的诱发荧光（显示在第一个60秒的唯一反应是为了更好地说明FFA的诱发反应的快速动力学）。请注意，在较高浓度的游离脂肪酸诱发荧光增加一个更快的动能比，即使在低浓度的荧光峰值水平相似。
图2浓度- FFA诱导荧光变化和复合A诱导抑制FFA人类TRPA1在HEK293细胞中稳定表达的响应的响应关系。 Δ，游离脂肪酸的浓度 - 反应关系确定后，加入不同浓度的FFA测量的初始利率正常化的荧光增加（斜率）。一个公认的TRPA1受体拮抗剂抑制游离脂肪酸诱发的钙响应的浓度 - 反应关系，澳，化合物A
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Discussion
细胞内的Ca 2 +在许多生理和病理条件下，如神经递质的释放（3），心肌动作电位（4），肌肉细胞收缩（5），细胞信号转导（6-7）和兴奋性细胞死亡（，起着重要作用8）。细胞内Ca 2 +浓度的测量有助于澄清功能的变化质膜或细胞器中的Ca 2 +渗透的渠道的贡献
的Ca 2 +以上的流程（9-13） 。该检测也可以用于调查“G -蛋白偶联受体的功能，其中许多激活后，导致胞内游离Ca 2 +浓度增加，释放细胞内 Ca 2 +存储的 Ca 2 +或激活其他 CA 2 +透水离子通道（14-16）。 FlexStation 3使用的Ca 2 +敏感染料，增加荧光强度，或比例的变化引起的，与细胞内Ca 2 +浓度的增加。此视频文章演示FlexStation 3中的Ca 2 +渗透TRPA1在HEK293细胞中异源表达渠道研究中的应用。虽然我们只用了96孔板为示范，用户可以轻松地选择从96 - 或384孔板格式开关配药pipetters（8 - 或16通道）。这种检测提供了一种快速的媒介激动剂和/或拮抗剂的高通量筛选能力，适用于许多其他的Ca 2 + -渗透离子通道。但是，应该指出的是细胞内钙离子的实验是一种离子通道的活动间接测量。详细的后续使用膜片钳记录直接测量流经细胞膜的离子电流的研究仍然需要得出相应的结论。
为了取得可靠的数据质量，应采取以下预防措施：
- 对于松散贴壁细胞，如HEK293细胞，涂料，板材是必不可少的。然而，强烈的贴壁细胞，如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或HeLa细胞，涂料是没有必要。
- 重要的是等量的细胞种子在每个多孔板，细胞密度在每口井的井应在90-100％汇合之间是在检测的时间。
- 轻轻免除液体细胞和加载时和洗涤细胞，以免干扰细胞。
- 丙磺舒添加，以防止染料渗漏。然而，由于丙磺舒也有一些离子通道的影响，应谨慎采取解释从实验，包括在缓冲液中丙磺舒获得的数据时。
- 为了确定在复合板化合物的浓度为每口井的缓冲液在相应的样品板以及前后复合此外，考虑稀释倍数。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢博士。约翰汉考克，雷烧烤，安德鲁莫里斯和奥尔加Chumakova的支持。 FlexStation 3系统UTHSC Cytodynamic成像设施的一部分。我们也感谢博士。 Ardem Patapoutian和迈克尔Bandell来自斯克里普斯研究所和诺华研究基金会（GNF）的基因组研究所提供的HEK293 - hTRPA1稳定的细胞株。支持这项研究是由NIH（GM081658 MXZ）和德州医学中心消化内科中心（HH）和使命连接/ TIRR基金会（农户）的赠款部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
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