Summary
यह वीडियो मानव TRPA1 FlexStation का उपयोग 3 चैनलों के औषधीय प्रोफ़ाइल का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है. प्रोटोकॉल सेल तैयारी, डाई लोड हो रहा है और microplate रीडर, 3 FlexStation के आपरेशन के विवरण शामिल हैं.
Abstract
आण्विक 'औज़ार 3 FlexStation एक benchtop बहु मोड microplate बहु अच्छी तरह प्लेटें में स्वचालित प्रतिदीप्ति माप के सक्षम पाठक है. यह शैक्षिक सेटिंग्स में मध्यम से उच्च throughput स्क्रीन के लिए आदर्श है. यह एक एकीकृत तरल हस्तांतरण के साथ एक मल्टी चैनल pipetter और मशीन फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों की एक किस्म के प्रतिदीप्ति परिवर्तन की निगरानी के लिए एक समय में एक स्तंभ पढ़ता सुसज्जित मॉड्यूल है. उदाहरण के लिए, 3 FlexStation intracellular मुक्त Ca + 2 स्तर के परिवर्तन को मापने के द्वारा + पारगम्य आयन चैनलों और जी प्रोटीन रिसेप्टर्स मिलकर समारोह के 2 Ca अध्ययन किया गया है. क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल (टीआरपी) nonselective कटियन चैनलों कि कई शारीरिक और pathophysiological कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के एक बड़े परिवार कर रहे हैं. टीआरपी चैनलों के अधिकांश कैल्शियम पारगम्य हैं और सक्रियण पर कैल्शियम बाढ़ प्रेरित. इस वीडियो में, हम 3 FlexStation TRPA1 चैनल, कई हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए एक आणविक संवेदक के औषधीय प्रोफ़ाइल का अध्ययन करने के आवेदन को प्रदर्शित करता है. HEK293 transiently या stably मानव TRPA1 चैनल, 96 अच्छी तरह प्लेटों में हो, व्यक्त कोशिकाओं + संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक 2 ca, Fluo-4, और इन कोशिकाओं में वास्तविक समय प्रतिदीप्ति परिवर्तन के साथ लोड कर रहे हैं पहले और के आवेदन के दौरान मापा जाता है एक TRPA1 agonist 3 FlexStation के फ्लेक्स मोड का उपयोग कर. एक ख्यात TRPA1 प्रतिपक्षी के प्रभाव भी जांच की गई थी. डेटा SoftMax प्रो सॉफ्टवेयर से स्थानांतरित कर रहे हैं TRPA1 activators और inhibitors के एकाग्रता प्रतिक्रिया रिश्तों का निर्माण.
Protocol
1. 96 अच्छी तरह प्लेटों में सेल की तैयारी
HEK293 transiently मानव सीडीएनए TRPA1 साथ trasfected कोशिकाओं के लिए
- HEK293 कोशिकाओं Dulbecco मिनिमल आवश्यक मध्यम में एक से दो दिन (DMEM) 4.5 ग्लूकोज मिलीग्राम / एमएल (थर्मो वैज्ञानिक, SH3002201) युक्त, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (Invitrogen, 16000-044) के साथ पूरक, 50 इकाइयों के लिए बड़े हो रहे हैं / एमएल पेनिसिलिन और 50 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen, 15140-163). अभिकर्मक के दिन पर, सेल घनत्व 70-90% तक पहुँचने चाहिए.
- कोट एक अच्छी तरह से 50 μl पाली एल ओर्निथिन (सिग्मा P3655, 20 / बाँझ आसुत जल में μg मिलीलीटर) pipetting और 37 में incubating ° कम से कम 15 मिनट के लिए सी द्वारा 96 अच्छी तरह प्लेटें. Dulbecco फास्फेट प्रत्येक के साथ अच्छी तरह से एक बार कुल्ला 2 मिलीग्राम बिना Saline (DPBS) buffered + और Ca 2 + (थर्मो वैज्ञानिक, SH3002803). थाली कुछ घंटों के लिए सेल संस्कृति हुड में छोड़ा जा सकता है है.
- एक 96 अच्छी तरह से थाली की हर अच्छी तरह से के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब 25 μl OPTI सदस्य (Invitrogen, 31985-070) में 0.2 सीडीएनए μg में जलमिश्रित. आनुपातिक स्केल वही सीडीएनए द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट हो कुओं की संख्या के अनुसार. इसके अलावा एक अलग 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब 0.4 μl 2000 के लिए प्रत्येक के लिए ट्रांसफ़ेक्ट किया जा अच्छी तरह से (Invitrogen, 11668-019) Lipofectamine 25 μl OPTI-सदस्य में में पतला. ट्रांसफ़ेक्ट हो कुओं की कुल संख्या के अनुसार इस स्केल.
- संक्षेप में पतला सीडीएनए और Lipofectamine 2000 भंवर और उन्हें बारे में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं.
- ट्यूब है कि पतला सीडीएनए भंवर, होता पतला Lipofectamine 2000 के एक बराबर मात्रा स्थानांतरण और मिश्रण 15 मिनट से 2 बजे के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं. इस समय के दौरान, 49 μl / अच्छी तरह से पाली एल ओर्निथिन लेपित थाली सीडीएनए Lipofectamine / 2000 मिश्रण का हस्तांतरण.
- HEK293 कोशिकाओं (1.1 चरण) Trypsinize, सेल घनत्व गिनती एक hemocytometer या काउंटेस स्वचालित सेल काउंटर (Invitrogen, C10227) का उपयोग, और कोशिकाओं के एक वांछित राशि हस्तांतरण किया (आमतौर पर के बारे में ~ 125,000-150,000 कोशिकाओं को अच्छी तरह /) एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब. 5 मिनट के लिए 1000 x RPM में अपकेंद्रित्र. ~ 1,250,00-1,500,000 कोशिकाओं / DMEM संस्कृति माध्यम में मिलीलीटर, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, लेकिन एंटीबायोटिक दवाओं के बिना Resuspend कोशिकाओं.
- हर अच्छी तरह से है कि सीडीएनए Lipofectamine 2000 मिश्रण का उपयोग एक multichannel pipetter या MicroFill Microplate औषधि (बायो - टेक) शामिल 98 μl सेल निलंबन बग़ैर. चलो थाली हुड में humidified सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में रखने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए बैठते हैं. 20-44 बजे के लिए °% 5 सी, सीओ 2 37 सेते हैं .
HEK293 stably TRPA1 व्यक्त कोशिकाओं के लिए
- 96 अच्छी तरह कोट प्लेटों को 1.2 चरण का पालन करें.
- inducible HEK293 hTRPA1 सेल लाइन उदारता डॉ. ए Patapoutian (स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट) द्वारा प्रदान की गई थी और जंगली प्रकार HEK293 कोशिकाओं (1.1 चरण) के रूप में एक ही माध्यम में बनाए रखा, लेकिन 5 μg / मिलीलीटर blasticidin के साथ पूरक (Invitrogen, A1113902) और 50 μg / एमएल hygromycin बी (Invitrogen, 10,687,010). जब सेल घनत्व के बारे में 90% तक पहुँचता है, कोशिकाओं trypsinize, घनत्व सेल गिनती, और 5 मिनट के लिए x 1000 आरपीएम पर कोशिकाओं के वांछित राशि अपकेंद्रित्र. डॉक्सीसाइक्लिन (फिशर, BP26535, 0.25 μg / एमएल) के साथ पूरक एक ही संस्कृति माध्यम में ~ १०,००,००० कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व Resuspend कोशिकाओं.
- 100 पर पाली एल ओर्निथिन लेपित प्लेटें μl अच्छी तरह / एक multichannel pipetter या MicroFill (जैव टेक) का उपयोग करने के लिए सेल निलंबन बग़ैर. चलो थाली हुड में humidified सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में रखने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए बैठते हैं. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस, 5% से 16 के लिए 2 सीओ - 24 घंटा.
2. समाधान
- हांक बफर नमक समाधान (HBSS) कोशिकी समाधान के रूप में प्रयोग किया जाता है. यह (मिमी में) शामिल हैं: 137 NaCl, 5.4 KCl, 0.25 ना 2 HPO 4, 0.44
2 के.एच. पीओ 4, 1.3 CaCl 2, 1.0 MgSO 4, 1.0 2 MgCl, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES, पीएच 7.4 करने के लिए समायोजित 1N NaOH का उपयोग कर के साथ). - Fluo-4 परख बफर 2 मिमी HBSS में प्रोबेनेसिड शामिल हैं. 0.5 एन NaOH में 250 मिमी शेयर प्रोबेनेसिड (सिग्मा, P8761) बनाओ. 1:125 के अनुपात में HBSS के लिए पतला. पीएच 7.4 1 एन एचसीएल का उपयोग कर मरम्मत करना.
3. Fluo 4 AM के साथ सेल लोड हो रहा है
- 912 μl निर्जल DMSO में 1 मिलीग्राम Fluo 4-AM (Invitrogen, F14202) भंग करने के लिए 1 मिमी की एक शेयर समाधान कर. Fluo-4 AM स्टॉक कम से कम एक महीने के समाधान के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता.
- 10 μl मिमी 1 मिक्स Fluo 4 10 μl Pluronic एफ 127 (Invitrogen, P3000MP, 20 (w / v) DMSO में% समाधान) और फिर 5 मिलीलीटर Fluo 4 परख बफर (2.2 चरण) के लिए संपूर्ण सामग्री हस्तांतरण के साथ AM 0.1% गोजातीय सीरम albumin (सिग्मा, A9418) के साथ पूरक है.
- 96 - अच्छी तरह प्लेटें (1.7 या 1.10 चरण) में 80 μl / अच्छी तरह से 2 बार एक microplate वॉशर (जैसे बायो - टेक से ELx405TM के रूप में) का उपयोग HBSS के साथ बड़े हो कोशिकाओं को धो लें.
- Fluo जोड़ें-4 समाधान AM लोड हो रहा है (3.2 चरण) 50 पर 1 घंटे के लिए μl अच्छी तरह / एक multichannel pipetter या MicroFill (जैव टेक) का उपयोग और 37 पर थाली सेते ° C.
- कोशिकाओं को परख Fluo 4 (2.2 चरण) बफर ELx405TM microplate वॉशर का उपयोग कर के साथ 3 बार धोएं. पिछले धोने के बाद, प्रत्येक कुएं में Fluo-4 परख बफर के 80 μl छोड़ दें.
4. यौगिक थाली तैयार
- 1 घंटा सेल लोड हो रहा है अवधि के दौरान, agonists के Fluo-4 परख बफर में वांछित अंतिम सांद्रता के 3x के 3x dilutions (या गरम) की एक श्रृंखला तैयार करते हैं.
- पिपेट 250-300 पतला यौगिक समाधान के एक 96 अच्छी तरह यौगिक प्लेट μl. व्यवस्थित और यौगिक प्लेट की उसी स्तंभ में यौगिक इसी सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के धारावाहिक dilutions जब भी यह संभव है क्योंकि FlexStation तीन एक समय में एक एकल स्तंभ पढ़ता है.
5. 3 FlexStation प्लेट पढ़ने में
- सिस्टम पर मुड़ें (3 FlexStation, कंप्यूटर, और SoftMax प्रो 5.2 सॉफ्टवेयर)
- एक नया फ़ाइल नाम के साथ प्रयोग बचाओ. सेट अप में, फ्लेक्स मोड का चयन और निम्न मान दर्ज करें:
# 1 प्रोटोकॉल, agonist प्रभाव 
# 2 प्रोटोकॉल, प्रतिपक्षी प्रभाव 
- 3 FlexStation में उचित ट्रे के लिए एक नई टिप बॉक्स में, यौगिक प्लेट और प्लेट पढ़ने रखें और क्लिक करें बटन "पढ़ें". 3 FlexStation एक समय में एक स्तंभ पढ़ सकते हैं और पढ़ने में दखल के बिना preprogrammed समय अंक पर यौगिकों जोड़ने जाएगा. यह एक स्तंभ और मशीन के लिए यौगिक प्रदर्शन परिवर्धन के साथ अगले स्तंभ के रूप में 5.2 चरण में उपयोगकर्ता द्वारा क्रमादेशित जब तक सभी स्तंभों को पढ़ रहे हैं पढ़ने के लिए जारी रहेगा पढ़ने समाप्त करने के लिए के बारे में 3 मिनट (# 2 प्रोटोकॉल के लिए 5 मिनट) लेता है.
6. डेटा विश्लेषण
- प्रयोगात्मक डेटा सीधे SoftMax प्रो 5.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर या नकल की और तो Microsoft Excel के रूप में किसी भी स्प्रेडशीट प्रोग्राम, में चिपकाया संसाधित किया जा सकता है. एकाग्रता प्रतिक्रिया TRPA1 agonist flufenamic एसिड (FFA) के वक्र निम्नलिखित कम से कम वर्गों फिटिंग दिनचर्या का उपयोग करने के लिए निर्माण किया है.
50 ईसी, वाई अधिकतम है, जहां Y मनाया प्रतिक्रिया है सामान्यीकृत अधिक से अधिक प्रतिक्रिया है, सी इसी दवा एकाग्रता एकाग्रता है कि एक आधा अधिक से अधिक प्रतिक्रिया पैदा है, और पता एच स्पष्ट हिल गुणांक है. एक ख्यात TRPA1 प्रतिपक्षी यौगिक के लिए एकाग्रता निषेध वक्र एक FFA (100 सुक्ष्ममापी) के एक निश्चित एकाग्रता का उपयोग कर, और उत्तरोत्तर यौगिक परिसर के ए आईसी 50 मूल्य की एकाग्रता बढ़ाने के एक निम्न के ढाले कम से कम वर्गों द्वारा परिकलित किया जाता है के द्वारा प्राप्त की है समीकरण. 
, जहां वाई मनाया प्रतिक्रिया है और वाई अधिकतम पीक प्रतिक्रिया सामान्यीकृत है [चींटी] 50 आईसी, इसी यौगिक एक एकाग्रता है कि आधा अधिकतम FFA - पैदा की प्रतिक्रिया का निषेध उत्पादन प्रतिपक्षी एकाग्रता है, और पता एच स्पष्ट हिल गुणांक.
50 ईसी, वाई अधिकतम है, जहां Y मनाया प्रतिक्रिया है सामान्यीकृत अधिक से अधिक प्रतिक्रिया है, सी इसी दवा एकाग्रता एकाग्रता है कि एक आधा अधिक से अधिक प्रतिक्रिया पैदा है, और पता एच स्पष्ट हिल गुणांक है. एक ख्यात TRPA1 प्रतिपक्षी यौगिक के लिए एकाग्रता निषेध वक्र एक FFA (100 सुक्ष्ममापी) के एक निश्चित एकाग्रता का उपयोग कर, और उत्तरोत्तर यौगिक परिसर के ए आईसी 50 मूल्य की एकाग्रता बढ़ाने के एक निम्न के ढाले कम से कम वर्गों द्वारा परिकलित किया जाता है के द्वारा प्राप्त की है समीकरण. 
, जहां वाई मनाया प्रतिक्रिया है और वाई अधिकतम पीक प्रतिक्रिया सामान्यीकृत है [चींटी] 50 आईसी, इसी यौगिक एक एकाग्रता है कि आधा अधिकतम FFA - पैदा की प्रतिक्रिया का निषेध उत्पादन प्रतिपक्षी एकाग्रता है, और पता एच स्पष्ट हिल गुणांक. 7. प्रतिनिधि परिणाम:
TRPA1 Ca 2 + पारगम्य कटियन चैनल, जिनमें से सक्रियण कैल्शियम बाढ़ है कि 2 + संवेदनशील डाई Ca, Fluo 4 (1-2) से पता लगाया जा सकता है की ओर जाता है. एक HEK293 - hTRPA1 स्थिर सेल लाइन TRPA1 agonists और antagonists की एकाग्रता प्रतिक्रिया रिश्तों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. कोशिकाओं AM Fluo 4 के साथ भरी हुई थी, परख बफर के 80 μl में रखा है, और 3 FlexStation का उपयोग कर पढ़ने के. 30 एस के लिए आधारभूत प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग के बाद, TRPA1 agonist, FFA के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने की 40 μl, वांछित अंतिम एकाग्रता की 3x पर प्रत्येक, एक बहु चैनल pipetter के माध्यम से कोशिकाओं को जोडी fluidics मॉड्यूल के एक भाग के रूप में शामिल थे 3 FlexStation की. प्रतिदीप्ति परिवर्तन एक अतिरिक्त 180 एस के लिए निगरानी की गई (- एफ 0 एफ), जहां एफ और एफ 0 ब्याज और पढ़ने की शुरुआत के समय में प्रतिदीप्ति मान रहे हैं क्रमशः प्रत्येक के लिए अच्छी तरह रिश्तेदार Fluo-4 प्रतिदीप्ति परिवर्तन ΔF = के रूप में व्यक्त किया गया. प्रतिदीप्ति परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम के प्रतिनिधि FFA सांद्रता के एक श्रृंखला के जवाब में निशान छवि में दिखाया गया हैं. 1. पिछले चार FFA सांद्रता के लिए, नोट, हालांकि अधिक से अधिक प्रतिक्रिया का स्तर समान हैं, सक्रियण कैनेटीक्स स्पष्ट रूप से कम FFA सांद्रता में अधिक से अधिक तेज है. इसलिए, इन मतभेदों, एकाग्रता भेद करने के लिए प्रतिक्रिया रिश्ते FFA के अलग सांद्रता (छवि 2) के अलावा पर प्रतिदीप्ति वृद्धि की प्रारंभिक दर (ढलान) को मापने के द्वारा निर्मित किया गया था. आधा अधिक से अधिक प्रभावFFA के ive (50 ईसी) एकाग्रता के लिए 55.4 सुक्ष्ममापी (n = 3) के लिए निर्धारित किया गया था. ख्यात TRPA1 प्रतिपक्षी परीक्षण करने के लिए, एक परिसर में, हम एक समान प्रोटोकॉल # 2 (चरण 2) का उपयोग कर प्रयोग किया. इस मामले में, विरोधी के dilutions की एक श्रृंखला 30 एस (3x वांछित अंतिम सांद्रता के 40 μl) में जोड़ा गया था और FFA 180 जोड़ा गया बाद (100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए 300 सुक्ष्ममापी पर 60 μl). यौगिक एक खुराक-dependently 4.3 सुक्ष्ममापी की एक आधा अधिक से अधिक निरोधात्मक (50 आईसी) एकाग्रता (n = 3) (छवि 2) के साथ TRPA1 FFA के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को कम.
चित्रा 1. FFA द्वारा एकाग्रता पर निर्भर मानव TRPA1 के सक्रियण. निशान समय पर प्रतिदीप्ति FFA पैदा वृद्धि (पहले 60 एस में केवल प्रतिक्रिया के लिए बेहतर FFA - पैदा की प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स तेजी से वर्णन करने के लिए दिखाए जाते हैं) हैं. कृपया ध्यान दें कि उच्च सांद्रता में FFA के साथ प्रतिदीप्ति वृद्धि पैदा एक तेजी से बहुत कम सांद्रता में से गतिज, भले ही पीक प्रतिदीप्ति स्तर समान थे.
चित्रा 2 एकाग्रता - FFA प्रेरित प्रतिदीप्ति परिवर्तन और यौगिक मानव TRPA1 में FFA प्रतिक्रिया stably HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त की एक प्रेरित निषेध के लिए प्रतिक्रिया संबंधों . Δ, एकाग्रता - FFA की प्रतिक्रिया के संबंध FFA की सांद्रता varying के अलावा पर सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति वृद्धि की प्रारंभिक दर (ढलान) को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था. हे, एक ख्यात TRPA1 प्रतिपक्षी द्वारा एकाग्रता प्रतिक्रिया FFA - पैदा कैल्शियम प्रतिक्रिया के निषेध के संबंध, यौगिक ए
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Discussion
Intracellular Ca 2 + neurotransmitter रिहाई (3), हृदय की संभावित कार्रवाई (4), मांसपेशी कोशिका संकुचन (5), सेल संकेत transduction (6-7), और excitotoxic सेल (मृत्यु के रूप में कई शारीरिक और रोग की स्थिति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है 8). Intracellular Ca 2 + स्तर के मापन के लिए 2 Ca के कार्यात्मक परिवर्तन और प्लाज्मा झिल्ली या intracellular organelles + पारगम्य चैनलों का योगदान स्पष्ट में मदद करता है
Ca 2 ऊपर प्रक्रियाओं (13/09) +. परख भी जी प्रोटीन रिसेप्टर्स मिलकर कार्य की जांच करने के लिए, जिनमें से कई, सक्रियण पर, intracellular मुक्त Ca 2 सांद्रता + + दुकानों intracellular 2 Ca से 2 + Ca जारी या अन्य 2 Ca सक्रिय वृद्धि हुई नेतृत्व करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है + पारगम्य आयन चैनल (14-16). 3 FlexStation Ca 2 का उपयोग + संवेदनशील रंजक, जो वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति तीव्रता, या ratiometric परिवर्तन को जन्म दे, intracellular 2 + एकाग्रता CA की वृद्धि के साथ बनाता है . यह वीडियो लेख + पारगम्य TRPA1 heterologously HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त चैनलों Ca 2 के अध्ययन में 3 FlexStation के आवेदन को दर्शाता है. हालांकि हम केवल प्रदर्शन के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों का इस्तेमाल किया है, उपयोगकर्ताओं को आसानी से 96 चुन सकते हैं - या वितरण pipetters (8 - या 16 चैनल) स्विचन द्वारा 384 अच्छी तरह से थाली स्वरूप. इस परख agonists और / या विरोधी की उच्च throughput स्क्रीनिंग की क्षमता के लिए एक त्वरित माध्यम प्रदान करता है और कई अन्य 2 Ca + पारगम्य आयन चैनलों के लिए लागू है. हालांकि, यह नोट किया जाना चाहिए कि intracellular कैल्शियम परख आयन चैनल गतिविधियों के एक अप्रत्यक्ष माप है. विस्तृत का पालन पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग को सीधे ईओण कोशिका झिल्ली भर से बह वर्तमान को मापने के अध्ययन अभी भी उचित निष्कर्ष आकर्षित करने की जरूरत हैं.
विश्वसनीय डेटा की गुणवत्ता को प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित सावधानियों लिया जाना चाहिए:
- HEK293 कोशिकाओं, कोटिंग के रूप में शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं, के लिए प्लेटें आवश्यक है. हालांकि, चीनी हैम्स्टर अंडाशय (CHO) कोशिकाओं या HELA कोशिकाओं के रूप में दृढ़ता से पक्षपाती कोशिकाओं, के लिए, कोटिंग आवश्यक नहीं है.
- यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं के बराबर राशि बहु - अच्छी तरह से थाली और प्रत्येक कुएं में सेल घनत्व के प्रत्येक अच्छी तरह से में वरीयता प्राप्त परख के समय में 9-10 confluency% के बीच होना चाहिए.
- धीरे कोशिकाओं को तरल बांटना और परेशान कोशिकाओं कोशिकाओं जब लोड हो रहा है और कपड़े धोने से बचें.
- प्रोबेनेसिड डाई रिसाव को रोकने के लिए जोड़ा जाता है. हालांकि, के बाद से प्रोबेनेसिड कुछ आयन चैनलों पर भी प्रभाव पड़ता है, जब प्रयोगों है कि परख बफर में प्रोबेनेसिड शामिल से प्राप्त आंकड़ों की व्याख्या सावधानी लिया होना चाहिए.
- यौगिक थाली में यौगिक सांद्रता का निर्धारण करने के लिए, अच्छी तरह से प्रत्येक नमूना थाली की इसी पहले अच्छी तरह से और चक्रवृद्धि के बाद इसके अलावा बफर मात्रा के अनुसार के लिए कमजोर पड़ने कारक पर विचार करें.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम डीआरएस धन्यवाद. जॉन Hancock, रे ग्रिल, एंड्रयू मॉरिस और उनके समर्थन के लिए ओल्गा Chumakova. FlexStation 3 प्रणाली UTHSC Cytodynamic इमेजिंग सुविधा का हिस्सा है. हम भी डीआरएस धन्यवाद. Ardem Patapoutian और स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट और HEK293 - hTRPA1 स्थिर सेल लाइन उपलब्ध कराने के लिए नोवार्टिस रिसर्च फाउंडेशन (GNF) के जीनोमिक्स संस्थान से माइकल Bandell. अनुसंधान में भाग (GM081658 MXZ) NIH और टेक्सास मेडिकल सेंटर पाचन रोग केंद्र (HH के लिए) और मिशन कनेक्ट / TIRR फाउंडेशन (HH के लिए) से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
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