Protocol
1. Celpreparaten in 96-well platen
Voor HEK293 cellen tijdelijk trasfected met menselijke TRPA1 cDNA
- HEK293 cellen worden gekweekt voor een tot twee dagen in Minimal Essential Medium Dulbecco's (DMEM) met 4,5 mg / ml glucose (Thermo Scientific, SH3002201), aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (Invitrogen, 16000-044), 50 stuks / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine (Invitrogen, 15140-163). Op de dag van de transfectie, moet de cel dichtheid bereikt 70-90%.
- Coat 96-well platen eveneens 50 ul poly-L-ornithine (Sigma P3655, 20 ug / ml in steriel gedistilleerd water) aan elk putje en incubatie bij 37 ° C gedurende ten minste 15 minuten. Spoel elk putje een keer met fosfaat Dulbecco's gebufferde fysiologische zoutoplossing (DPBS) zonder Mg 2 + en Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). De plaat kan worden achtergelaten in de celkweek kap voor een paar uur.
- Voor elke well van een 96-well plaat, verdund in een 1,5 ml Eppendorf buis 0,2 mg cDNA in 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Proportioneel op basis van het aantal putten te getransfecteerd door dezelfde cDNA. Ook verdunnen in een aparte 1,5 ml Eppendorf buis 0,4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) in 25 ul OPTI-MEM voor elk goed te worden getransfecteerd. Schaal dit op basis van het totale aantal putten te getransfecteerd.
- Kort vortex de verdunde cDNA en Lipofectamine 2000 en laat ze bij kamertemperatuur zitten voor ongeveer 5 minuten.
- Overdracht een gelijk volume van de verdunde Lipofectamine 2000 aan de buis die de verdunde cDNA, vortex bevat en laat het mengsel op kamertemperatuur zitten voor 15 minuten tot 2 uur. Gedurende deze tijd, overdracht van de cDNA / Lipofectamine 2000 mengsel bij 49 ul / putje van de poly-L-ornithine gecoate plaat.
- Trypsinize de HEK293 cellen (stap 1.1), tel celdichtheid behulp van een hemocytometer of gravin geautomatiseerde celgetalmeter (Invitrogen, C10227), en breng een gewenste hoeveelheid van cellen (in het algemeen ongeveer ~ 125,000-150,000 cellen / putje) om een 15-ml steriel conische bodem centrifugebuis. Centrifugeer bij 1000 x rpm gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen op ~ 1,250,00-1,500,000 cellen / ml in het kweekmedium DMEM, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, maar zonder antibiotica.
- Verdeel 98 ui celsuspensie in elk putje dat de cDNA-Lipofectamine 2000 mengsel met behulp van een meerkanaals pipetter of de MicroFill Microplate Dispenser (Bio-Tek) bevat. Laat de plaat in de kap zitten voor minstens 30 minuten voordat het naar de bevochtigde celcultuur incubator. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 20 tot 44 uur.
Voor HEK293 cellen die stabiel tot expressie TRPA1
- Volg stap 1.2 voor het coaten van 96-well platen.
- De induceerbare HEK293-hTRPA1 cellijn werd rijkelijk voorzien door dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) en onderhouden in hetzelfde medium als het wild-type HEK293 cellen (stap 1.1), maar aangevuld met 5 ug / ml blasticidine (Invitrogen, A1113902) en 50 ug / ml hygromycine B (Invitrogen, 10687010). Wanneer celdichtheid ongeveer 90% bereikt, trypsinize cellen, tellen celdichtheid, en centrifugeer de gewenste hoeveelheid cellen op 1000 x rpm gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen bij een dichtheid van ~ 1 miljoen cellen / ml in dezelfde cultuur medium aangevuld met doxycycline (Fisher, BP26535, 0,25 ug / ml).
- Doseer de celsuspensie aan poly-L-ornithine gecoate platen bij 100 ul / putje met behulp van een meerkanaals pipetter of de MicroFill (Bio-Tek). Laat de plaat in de kap zitten voor minstens 30 minuten voordat het naar de bevochtigde celcultuur incubator. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 16 - 24 uur.
2. Oplossingen
- Gebufferde zout Hank's oplossing (HBSS) wordt gebruikt als de extracellulaire oplossing. Het bevat (in mm): 137 NaCl, KCl 5,4, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44
KH 2 PO 4, 1,3 CaCl2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 glucose, 10 HEPES, met een pH ingesteld op 7,4 met behulp van 1 N NaOH). - Fluo-4 testbuffer bevat 2 mM probenecide bij HBSS. Maak 250 mM voorraad probenecide (Sigma, P8761) in 0,5 N NaOH. Verdun tot HBSS in een verhouding van 1:125. Stel de pH op 7,4 met behulp van een N HCl.
3. Cel laden met Fluo-4 AM
- Los 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) in 912 ul watervrij DMSO een voorraad oplossing van 1 mM te maken. De Fluo-4 AM voorraad oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C gedurende ten minste een maand.
- Mix 10 ul 1 mM Fluo-4 AM met 10 ul Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) oplossing in DMSO) en breng de gehele inhoud aan 5 ml Fluo-4 testbuffer (Stap 2.2) aangevuld met 0,1% Bovine serum albumine (Sigma, A9418).
- Was de cellen gekweekt in 96-wells platen (Stap 1.7 of 1.10) met HBSS bij 80 ul / putje 2 keer met een microplaat ring (zoals ELx405TM van Bio-Tek).
- Voeg de Fluo-4 AM laad-oplossing (stap 3.2) bij 50 ul / putje met behulp van een meerkanaals pipetter of de MicroFill (Bio-Tek) en de plaat op 37 incubeer ° C gedurende 1 uur.
- Was de cellen drie keer met de Fluo-4 testbuffer (Stap 2.2.) Met de ELx405TM microplaat wasmachine. Na de laatste wasbeurt, laat 80 ul van de Fluo-4 assay buffer in elk putje.
4. Bereiding van verbinding plaat
- Tijdens de 1 uur cel laden tijd, voor te bereiden een reeks van 3x verdunningen van agonisten (of antagonisten) van 3x van de gewenste uiteindelijke concentraties in het Fluo-4 assay buffer.
- Pipetteer 250-300 pi van de verdunde stof oplossingen voor een 96-well plaat compound. Schik op de seriële verdunningen van een verbinding en de bijbehorende positieve en negatieve controles in dezelfde kolom van de verbinding plaat hebben wanneer het is mogelijk omdat FlexStation 3 leest een enkele kolom per keer.
5. Plaat lezen in FlexStation 3
- Zet het systeem (FlexStation 3, computer, en de SoftMax Pro 5.2 software)
- Sla het experimenteren met een nieuwe bestandsnaam. Op de set-up, kies FLEX-modus en voer de volgende waarden:
Protocol nr. 1, agonistisch effect 
Protocol nr. # 2, antagonist effect 
- Plaats een nieuwe tip doos, samengestelde plaat en het lezen plaat op de juiste trays in FlexStation 3 en klik op "lezen" te klikken. De FlexStation 3 leest een column op een moment en voeg stoffen in de voorgeprogrammeerde tijdstippen zonder onderbreking van de lezing. Het duurt ongeveer 3 minuten (5 min voor Protocol nr. 2) tot eind lezen een column en de machine zal doorgaan naar de volgende kolom met uitgevoerd samengestelde toevoegingen zoals geprogrammeerd door de gebruiker in stap 5.2 tot alle columns worden gelezen gelezen.
6. Data-analyse
- Experimentele gegevens kunnen direct worden verwerkt met behulp van de SoftMax Pro 5.2 software of gekopieerd en geplakt in een spreadsheet-programma, zoals Microsoft Excel. Concentratie-respons curve van een TRPA1 agonist flufenamic zuur (FFA) is gebouwd met behulp van de volgende kleinste kwadraten fitting routine.
, Waarbij Y wordt de waargenomen respons, Y max is de genormaliseerde maximale respons, C is de bijbehorende concentratie van het geneesmiddel, EC 50 is de concentratie die een half-maximale reactie opgeroepen, en n H is de schijnbare Hill coëfficiënt. Concentratie-inhibitie curve voor een vermeende TRPA1 antagonist verbinding A wordt verkregen door middel van een vaste concentratie van FFA (100 uM), en geleidelijk verhogen van de concentratie van de stof A. IC 50 van mengvoeders voor A wordt berekend door de kleinste-kwadraten passend bij de volgende vergelijking. 
, Waarbij Y wordt de waargenomen respons-en Y-max is genormaliseerd grootste gevoeligheid, [Ant] is de overeenkomstige verbinding A de concentratie, IC 50 is de antagonist concentratie die half-maximale remming van de FFA-opgewekte reacties produceert, en n H is de schijnbare Hill coëfficiënt.
, Waarbij Y wordt de waargenomen respons, Y max is de genormaliseerde maximale respons, C is de bijbehorende concentratie van het geneesmiddel, EC 50 is de concentratie die een half-maximale reactie opgeroepen, en n H is de schijnbare Hill coëfficiënt. Concentratie-inhibitie curve voor een vermeende TRPA1 antagonist verbinding A wordt verkregen door middel van een vaste concentratie van FFA (100 uM), en geleidelijk verhogen van de concentratie van de stof A. IC 50 van mengvoeders voor A wordt berekend door de kleinste-kwadraten passend bij de volgende vergelijking. 
, Waarbij Y wordt de waargenomen respons-en Y-max is genormaliseerd grootste gevoeligheid, [Ant] is de overeenkomstige verbinding A de concentratie, IC 50 is de antagonist concentratie die half-maximale remming van de FFA-opgewekte reacties produceert, en n H is de schijnbare Hill coëfficiënt. 7. Representatieve resultaten:
TRPA1 is een Ca 2 +-permeabele kation kanaal, de activering van dat leidt tot calcium influx die kunnen worden gedetecteerd door de Ca 2 +-gevoelige kleurstof, Fluo-4 (1-2). Een HEK293-hTRPA1 stabiele cellijn werd gebruikt om de concentratie-respons relaties van TRPA1 agonisten en antagonisten te bestuderen. Cellen werden geladen met Fluo-4 AM, geplaatst in 80 ul van de assay buffer, en lezen met behulp van FlexStation 3. Na het opnemen van de basislijn fluorescentie gedurende 30 s, werden 40 pi van een seriële verdunning van de TRPA1 agonist, FFA, elk op 3x van de gewenste uiteindelijke concentratie, toegevoegd aan de cellen door middel van een multi-channel pipetter opgenomen als een onderdeel van de vloeistofcomponenten module van FlexStation 3. De fluorescentie wijzigingen werden gecontroleerd op een extra 180 s. De relatieve Fluo-4 fluorescentie veranderingen voor elk putje werden uitgedrukt als AF = (F - F 0), waarbij F en F 0 zijn fluorescentie waarden op het moment van de rente en het begin van de lezing, respectievelijk. Representatief zijn sporen van de tijd cursussen om fluorescentie verandert in reactie op een reeks van FFA-concentraties zijn weergegeven in Fig. 1. Noot voor de laatste vier FFA concentraties, hoewel de maximale respons levels zijn vergelijkbaar, de activatie kinetiek is duidelijk sneller bij de hogere dan bij de lagere FFA concentraties. Daarom, om deze verschillen is de concentratie te onderscheiden - respons relatie werd gebouwd door het meten van de aanvankelijke tarieven (helling) van de fluorescentie te verhogen door toevoeging van verschillende concentraties van de FFA (afb. 2). Het half maximaal effective concentratie (EC 50) van de FFA werd bepaald op 55,4 uM (n = 3). Voor het testen van de vermeende TRPA1 antagonist, een verbinding, hebben we een soortgelijk experiment met behulp van protocol # 2 (stap 2). In dit geval werd een reeks van verdunningen van de antagonist toegevoegd op 30 s (40 pl 3x gewenste uiteindelijke concentraties) en de FFA werd toegevoegd 180 s later (60 pl op 300 uM voor een uiteindelijke concentratie van 100 uM). Compound Een dosis-afhankelijk verminderde de reactie van de TRPA1 cellen FFA met een half maximale remmende concentratie (IC 50) van 4,3 uM (n = 3) (afb. 2).
Figuur 1. Concentratie-afhankelijke activering van de menselijke TRPA1 door de FFA. Sporen zijn FFA-opgeroepen toename van de fluorescentie in de tijd (alleen de antwoorden in de eerste 60 s worden aangetoond dat beter illustreren de snelle kinetiek van de FFA-geëvoceerde responsen). Houdt u er rekening mee dat bij hogere concentraties FFA fluorescentie toenemen opgeroepen met een veel snellere kinetische dan bij lagere concentraties, ook al is de piek fluorescentie niveaus vergelijkbaar waren.
Figuur 2 Concentratie -. Respons relaties voor de FFA-geïnduceerde fluorescentie verandering en samengestelde A-geïnduceerde remming van de FFA reactie in de menselijke TRPA1 stabiel uitgedrukt in HEK293 cellen. Δ, De concentratie - response-relatie van de FFA werd bepaald door het meten van de aanvankelijke tarieven (helling) van de genormaliseerde fluorescentie te verhogen door toevoeging van verschillende concentraties van de FFA. O, concentratie-respons relatie van de remming van de FFA opgewekte calcium reactie van een vermeende TRPA1 antagonist, compound A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).
- Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons. Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).
- Mason, S. A., MacLeod, K. T. Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females. Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).
- Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline. Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).
- Alagarsamy, S., Johnson, K. M. Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS. Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).
- Su, L. T. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain. J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).
- Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).
- George, J. Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons. J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).
- Price, K. L., Lummis, S. C. FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems. J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).
- Laude, A. J. Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors. Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).
- Marincsak, R. The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1. Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).
- Xie, X. Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol. 5, 191-203 (2007).
- Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).
- Boulay, G. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein. J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).
- Nanda, K. Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter. Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).
