Summary
このビデオでは、FlexStation 3を用いて、ヒトTRPA1チャネルの薬理学的特性を研究するための詳細なプロトコルを提供します。プロトコルは、細胞調製、染料ロードとマイクロプレートリーダー、FlexStation 3の動作の詳細について説明します。
Abstract
分子デバイス"FlexStation 3は、マルチウェルプレートの自動蛍光測定が可能な卓上型マルチモードマイクロプレートリーダーです。それは学術的設定の中〜高スループットスクリーン用に最適です。それは、マルチチャンネルピペッターやマシンを装備した統合型流体転送モジュールは、蛍光試薬の様々な蛍光の変化を監視するために一度に1列を読み取りますいます。例えば、FlexStation 3 +透過性のイオンチャンネルとGタンパク質共役型受容体細胞内遊離Ca 2 +濃度の変化を測定することにより、Ca 2 +の機能を研究するために使用されています。一過性受容体電位（TRP）チャネルは、多くの生理学的および病態生理学的機能に重要な役割を果たす非選択的カチオンチャネルの大きなファミリーです。 TRPチャネルのほとんどはカルシウム透過性であると活性化によりカルシウム流入を引き起こす。このビデオでは、我々はTRPA1チャネル、多数の有害な刺激のための分子センサーの薬理学的特性を研究するためにFlexStation 3のアプリケーションを示しています。 96ウェルプレートで培養一過性または安定的に人間のTRPA1チャネルを発現するHEK293細胞を、、のCa 2 +感受性蛍光色素、みたFluo - 4にロードされ、そしてこれらの細胞のリアルタイム蛍光の変化はのアプリケーションの実行前と実行中に測定されていますFlexStation 3のFLEXモードを使用して、TRPA1アゴニスト。推定されるTRPA1拮抗薬の効果についても検討した。データは、TRPA1活性化因子と阻害剤の濃度 - 反応関係を構築するためにSoftMax Proソフトウェアから転送されます。
Protocol
1。 96ウェルプレートでの細胞の調製品
一時的にcDNAをヒトのTRPA1とtrasfected HEK293細胞用
- HEK293細胞は、10％熱不活化ウシ胎児血清（Invitrogen社、16000から044）を添加した4.5 mg / mlのグルコースを（サーモサイエンティフィック、SH3002201）を含むダルベッコの最小必須培地（DMEM）、で1〜2日間、50ユニットのために栽培されている/ mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン（Invitrogen社、15140から163）。トランスフェクション当日に、細胞密度が70〜90パーセントに到達する必要があります。
- コート96ウェルの各ウェルに50μlのポリ- L -オルニチン（シグマP3655、滅菌蒸留水で20μg/ ml）をピペッティングし、37℃でインキュベートすることによりプレート℃で少なくとも15分間。のMg 2 +とCa 2 +（サーモサイエンティフィック、SH3002803）なし（DPBS）緩衝生理食塩水ダルベッコのリン酸で一回の各ウェルをリンス。プレートは、数時間のための細胞培養フードのままになることがあります。
- 96ウェルプレートの各ウェルについて、1.5 mlのエッペンドルフチューブに25μlのOPTI - MEM（Invitrogen社、31985から070）のcDNAは0.2μgで希釈する。同じcDNAでトランスフェクトされる井戸の数に応じて比例的にスケールアップ。また、別の1.5 mlエッペンドルフチューブにトランスフェクトされる各ウェルに25μlのOPTI - MEM 0.4μlをリポフェクトアミン2000（インビトロジェン社、11668から019）で希釈する。このアップトランスフェクトされる井戸の総数に応じて拡大縮小します。
- 簡潔に渦希釈したcDNAとリポフェクトアミン2000を、それらが約5分間室温で放置します。
- 希釈cDNAを、渦を含むチューブに希釈リポフェクタミン2000の等量を転送し、混合物を15分〜2時間室温で放置します。この時間の間に、49μL/ウェルポリ- L -オルニチン被覆プレートへのcDNA /リポフェクタミン2000混合物を転送する。
- HEK293細胞を（ステップ1.1）トリプシン、血球計算盤または伯爵自動細胞計数装置（Invitrogen社、C10227）を用いて細胞密度をカウントし、15 mlの滅菌に（一般的には約〜125,000-150,000細胞/ウェル）の細胞の所望量を転送する円錐底遠沈管。 5分間1000 × rpmで遠心。 10％熱不活性化ウシ胎児血清を添加したDMEM培地で〜1,250,00-1,500,000細胞/ ml、、で、抗生物質なしで再懸濁し、細胞。
- マルチチャンネルピペッターまたはMicroFillのマイクロプレートディスペンサー（バイオテック）を用いてcDNA -リポフェクタミン2000混合物を含む各ウェルに98μlの細胞懸濁液を分注する。プレートは加湿細胞培養インキュベーターにそれを配置する前に少なくとも30分間フードに座ってみましょう。 37℃、20〜44時間、5％のCO 2を 。
安定的にTRPA1を発現するHEK293細胞について
- コート96ウェルプレートにステップ1.2に従ってください。
- 誘導HEK293 - hTRPA1細胞株は、寛大に（Invitrogen社、博士A. Patapoutian（スクリプス研究所）によって提供され、野生型HEK293細胞（ステップ1.1）と同じ培地中で維持が、5μg/ mlのブラストサイジンを添加したA1113902）及び50μg/ mlのハイグロマイシンB（Invitrogen社、10687010）。細胞密度が約90％に達すると、細胞をトリプシン、細胞密度をカウントし、5分間1000 × RPMでの細胞の所望量を遠心してください。ドキシサイクリン（フィッシャー、BP26535、0.25μg/ ml）を補充した同じ培地で〜1,000,000セル/ mlの密度で細胞を再懸濁します。
- /ウェルマルチチャンネルピペッターまたはMicroFill（バイオテック）を用いて100℃、ポリ- L -オルニチン被覆されたプレートに細胞懸濁液を分注する。プレートは加湿細胞培養インキュベーターにそれを配置する前に少なくとも30分間フードに座ってみましょう。 37℃16℃、5％CO 2 - 24時間を。
2。ソリューション
- ハンクのバッファ塩溶液（HBSS）は細胞外液として使用されます。それは（mMで）含まれています：137のNaCl、5.4 KClを、0.25のNa 2 HPO 4、0.44
KH 2 PO 4、1.3のCaCl 2、1.0のMgSO 4、1.0を1N NaOHを用いて7.4に調整pHを持つのMgCl 2、10グルコース、10 HEPES、）。 - であるFluo - 4アッセイ用緩衝液は、HBSSでプロベネシド2mMのが含まれています。 0.5 N NaOH中の250mM株式プロベネシド（Sigma社、P8761）を作る。 1:125の割合でHBSSに希釈する。 1 N HClを用いて7.4のpHを再調整してください。
3。であるFluo - 4 AMで細胞ローディング
- 1mMのストック溶液を作るために912μlの無水DMSOには1mgであるFluo - 4 AM（Invitrogen社、F14202）を溶かす。であるFluo - 4原液が少なくとも一ヶ月は-20℃で保存できる回答。
- 5ミリリットルにみたFluo - 4アッセイバッファー（ステップ2.2）に全体の内容を転送して10μlのプルロニックF - 127（Invitrogen社、P3000MP、DMSOの20％（w / v）溶液）でAMおよび10μlの1mMのであるFluo - 4をミックス（Sigma社、A9418）0.1％ウシ血清アルブミンを補充した。
- 80μlの/ウェルマイクロプレートウォッシャーを（そのようなバイオテックからELx405TMなど）を使用して2回で、HBSSで96ウェルプレート（ステップ1.7または1.10）で培養した細胞を洗浄する。
- フルオを追加-4 /ウェルマルチチャンネルピペッターまたはMicroFill（バイオテック）を使用して、37でプレートをインキュベート50℃（ステップ3.2）ソリューションをロードした° Cで1時間。
- ELx405TMマイクロプレートウォッシャーを使用してみたFluo - 4アッセイバッファー（ステップ2.2。）で細胞を3回洗浄。最後の洗浄の後、各ウェルにみたFluo - 4アッセイ用緩衝液80μlを残す。
4。化合物のプレートの準備
- 1時間のセルローディング期間中に、みたFluo - 4アッセイ緩衝液中の所望の最終濃度の3倍のアゴニスト（または拮抗薬）の3倍希釈系列を用意する。
- 96ウェル化合物のプレートに希釈化合物溶液のピペット250〜300μL。 FlexStation 3が一度に1つの列を読み取るために、可能な限り複合板の同じ列にある化合物と対応するポジティブおよびネガティブコントロールの希釈系列を持つように手配する。
5。 FlexStation 3のプレートの読み取り
- システムの電源を入れます（FlexStation 3、コンピュータ、およびソフトマックスプロ5.2ソフトウェア）
- 新しいファイル名で実験を保存します。セットアップでは、フレックスモードを選択し、次の値を入力します。
プロトコール＃1、アゴニストの効果 
プロトコル＃2、アンタゴニスト作用 
- FlexStation 3の適切なトレイに新しいヒントボックス、化合物のプレートと読んでプレートを置き、ボタンを"読み"をクリックします。 FlexStation 3は、一度に1列を読んで、読書を中断することなく、あらかじめプログラムされた時点での化合物を追加します。これは、1つの列とマシンがすべての列が読み取られるまで、ステップ5.2のユーザーによってプログラムが実行化合物の追加と次の列を読み取るために引き続きを読み終えるには約3分（議定書＃2の5分）かかります。
6。データの分析
- 実験データは、Microsoft Excelなどの、任意のスプレッドシートプログラムに直接ソフトマックスプロ5.2ソフトウェアを使用して処理するかコピー＆ペーストすることができます。 TRPA1アゴニストフルフェナム酸（FFA）の濃度 - 反応曲線は、次の最小二乗フィッティングルーチンを使用して構築されます。
、Yは観測された応答である場合、Y maxは、正規化最大の応答である、Cは対応する薬剤の濃度であり、EC 50は最大値の半分の応答を誘発濃度であり、n Hは見かけヒル係数である。 （100μM）FFAの一定濃度を使用して、そして徐々に次のように当てはめ、最小二乗により計算される化合物の化合物AのIC 50値の濃度を増加させることにより得られる推定TRPA1アンタゴニスト化合物の濃度-阻害曲線方程式。 
、Yは観測された応答であり、Y maxは正規化ピーク応答である、[Antは]対応する化合物の濃度である、IC 50は FFA -誘発反応の最大阻害の半分を生産する拮抗薬の濃度であり、そしてnはHが明らかヒルです係数。
、Yは観測された応答である場合、Y maxは、正規化最大の応答である、Cは対応する薬剤の濃度であり、EC 50は最大値の半分の応答を誘発濃度であり、n Hは見かけヒル係数である。 （100μM）FFAの一定濃度を使用して、そして徐々に次のように当てはめ、最小二乗により計算される化合物の化合物AのIC 50値の濃度を増加させることにより得られる推定TRPA1アンタゴニスト化合物の濃度-阻害曲線方程式。 
、Yは観測された応答であり、Y maxは正規化ピーク応答である、[Antは]対応する化合物の濃度である、IC 50は FFA -誘発反応の最大阻害の半分を生産する拮抗薬の濃度であり、そしてnはHが明らかヒルです係数。 7。代表的な結果：
TRPA1は、Ca 2 +感受性色素、フルオ- 4（1-2）によって検出することができるカルシウムの流入につながる活性化、そのうちのCa 2 +透過性陽イオンチャネルである。 HEK293 - hTRPA1安定した細胞株は、TRPA1アゴニストおよびアンタゴニストの濃度 - 反応関係を研究するために使用されていました。細胞は、みたFluo - 4 AMをロードアッセイバッファー80μlの内に置かれ、FlexStation 3を使って読んでいた。 30秒のベースラインの蛍光を記録した後、TRPA1アゴニスト、FFA、所望の最終濃度の3倍で、それぞれの連続希釈の40μlをマルチチャンネルピペッターを介して細胞に添加した流体のモジュールの一部として含まれFlexStation 3。蛍光の変化は、さらに180秒間モニターした相対的にみたFluo - 4各ウェルの蛍光の変化はΔF=として表現された（F - F 0）、FとF 0はそれぞれ、興味や読書の始まりの時の蛍光値です。 FFA濃度の一連の反応の蛍光変化に時間のコースの代表的なトレースが図に示されています。 1。最大応答レベルは似ていますが、活性化速度論が低いFFAの濃度でより高いで明らかに速いですが、最後の4つのFFA濃度のために注意してください。したがって、これらの違いを区別するために、濃度 - 反応関係は、FFAの様々な濃度（図2）の添加により蛍光増の初速度を（傾き）を測定することによって構築した。半最大効果FFAのIVEの濃度（EC 50）が 55.4μM（N = 3）であると決定された。推定TRPA1アンタゴニストをテストするには、化合物、我々はプロトコル＃2（ステップ2）を使用して同様の実験を行った。このケースでは、拮抗薬の希釈系列を30秒（3倍の所望の最終濃度の40μl）で添加し、FFAは（100μMの最終濃度は300μMで60μl）を180秒後に追加されました。化合物Aは用量依存的に4.3μMの半最大阻害濃度（IC 50）（n = 3）を（図2）とFFAにTRPA1の細胞の応答を減少させる。
図1濃度に依存するFFAによるヒトTRPA1の活性化。トレースは、時間の経過とともに蛍光のFFA誘発増加（最初の60秒でだけ応答が良くFFA -誘発反応の速い反応速度を示すために掲載されています）です。高濃度でFFAがピーク蛍光レベルが類似していたにもかかわらず、はるかに高速に運動低濃度でよりと蛍光の増加を誘発ことに注意してください。
図2集中- 。FFA誘起蛍光の変化と化合物安定HEK293細胞で発現されたヒトTRPA1のFFAの応答の誘発抑制のための反応関係。 Δ、濃度 - FFAの反応関係は、FFAの濃度を変化させる添加時に正規化された蛍光増の初速度を（傾き）を測定することによって決定した。 O、推定されるTRPA1拮抗薬によってFFA誘発カルシウム応答の阻害の濃度 - 反応関係、化合物Aの
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Discussion
細胞内Ca 2 +などの神経伝達物質放出（3）、心臓の活動電位（4）、筋細胞の収縮（5）、細胞のシグナル伝達（6-7）、と興奮細胞死（のような多くの生理学的および病理学的条件下において重要な役割を果たしている8）。細胞内Ca 2 +濃度の測定は、機能+透過チャネルが細胞膜や細胞内小器官のCa 2 +の変化との寄与を解明するのに役立ちます
上記のプロセス（9-13）へのCa 2 +。アッセイはまた、その多くは、Gタンパク質共役型受容体の機能を調べる活性化により、+店舗細胞内Ca 2からのCa 2 +を放出や他のCa 2を活性化することによって細胞内遊離Ca 2 +濃度の増加につながるために使用することができます+透過性のイオンチャネル（14-16）。 FlexStation 3はCa 2 +の使用+細胞内Ca 2 +濃度の増加とともに増加した蛍光強度、またはレシオメトリックの変化を生じさせる感受性色素を、、です。このビデオの記事では、異種HEK293細胞で発現のCa 2 +透過性TRPA1チャネルの研究ではFlexStation 3のアプリケーションを示しています。調剤ピペッターを（ - または16チャネルの8）の切り替えによって、または384ウェルプレートフォーマット - 我々はデモ用の96ウェルプレートをのみを使用しているものの、ユーザーは簡単に96から選択することができます。このアッセイは、アゴニストおよび/ またはアンタゴニストのハイスループットスクリーニング機能にすばやく培地を提供し、他の多くのCa 2 +透過性のイオンチャネルに適用可能である。しかし、それは細胞内のカルシウムアッセイは、イオンチャネルの活動の間接的な測定であることに留意すべきである。詳細なフォローアップを直接細胞膜を横切って流れるイオン電流を測定するためのパッチクランプ記録を用いた研究は、依然として適切な結論を導き出すために必要とされる。
信頼性の高いデータ品質を取得するには、次の予防措置をとる必要があります。
- このようなHEK293細胞などゆるく付着細胞については、コーティングプレートが不可欠です。しかし、このようなチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはHeLa細胞として強く接着細胞、のために、コーティングは必要ありません。
- 細胞の同量は、アッセイの時点でコンフルエントに百分の90から100の間でなければなりません、マルチウェルプレート各ウェルの細胞密度の各ウェルに播種されていることが重要です。
- 静かに細胞に液体ディスペンスと細胞をロードし、洗濯の際、細胞に影響を与えることは避けてください。
- プロベネシドは、色素の漏れを防止するために追加されます。プロベネシドはまた、いくつかのイオンチャネルに影響があるので、アッセイ緩衝液中プロベネシドインクルード実験から得られたデータを解釈するときただし、注意が必要です。
- 複合板の化合物の濃度を決定するために、各ウェル化合物の添加前と後のサンプルプレートの対応するウェルにバッファーの量に応じに対する希釈係数を考慮してください。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、博士に感謝する。ジョンハンコック、レイグリル、アンドリューモリスとその支援のためのオルガChumakova。 FlexStation 3システムはUTHSC Cytodynamicイメージング施設の一部です。我々はまた、博士に感謝します。スクリップス研究所とHEK293 - hTRPA1安定した細胞株を提供するためのノバルティス研究財団（GNF）のゲノム研究所からArdem PatapoutianとマイケルBandell。研究は、NIH（MXZにGM081658）とテキサスメディカルセンター消化器病センター（HH）およびミッション接続/ TIRR財団（HHまで）からの助成金によって部分的にサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
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