Summary
במאמר זה אנו מדגימים את הבידוד של Murine ריאות תושב בתאי גזע mesenchymal (ריאות MSC), הרחבה שלהם, אפיון וניתוח של מאפייני המערכת החיסונית.
Abstract
תושב רקמות mesenchymal בתאי גזע (MSC) הם הרגולטורים חשוב לתיקון רקמות או התחדשות, סיסטיק דלקת, אנגיוגנזה היווצרות הגידול. יחדיו מחקרים אלה מראים כי MSC ריאות תושב לשחק תפקיד במהלך הומאוסטזיס פגיעה ברקמת הריאה, ולתקן במהלך מחלות כגון פיברוזיס ריאתי (PF) ויתר לחץ דם עורקי (PAH). כאן אנו מתארים בטכנולוגיה כדי להגדיר אוכלוסייה של MSC ריאות תושב. ההגדרה של אוכלוסייה זו ברקמת הריאה vivo באמצעות להגדיר סט של סמנים מאפשר בידוד חוזרות ונשנות של אוכלוסייה היטב מאופיינת בתאי גזע על ידי זרימת cytometry ולימוד סוג תא תפקוד ספציפי.
Protocol
1. ריאות בידוד
- הקורבן עכברים בוגרים (80-10 שבועות גיל: 18-20 גרם; C57Bl6J) בעכברים עם ממנת יתר של isoflurane ואחריו exsanguination באמצעות טכניקה סטרילית. פרופילים ישתנו מעט בין זנים.
- להסיר בניתוח את הסרעפת, לפתוח את בית החזה על ידי חיתוך בית החזה רוחבית בכל צד של העכבר. רוקן את הדם לריאות על ידי המרוססת את החדר הימני בלב בעדינות באמצעות 3-5mls של פוספט בופר סליין (PBS).
- מנתחים את אונות הריאה הסרת קנה הנשימה הסמפונות וגדולים מקום בצלחת פטרי מלאות הנקס שנאגרו מלוחים (HBSS). בעקבות אוסף של כל מלקחיים אונות הריאה משמשים מקום רקמה על המכסה של המנה. רקמות הוא טחון אז לחתיכות קטנות באמצעות אזמלים חד פעמיות עם נוזלי מספיק כדי לשמור אותם לחים, אבל לא עד כדי כך שהם לצוף ולנוע.
- לנתח hindlimb של אחד העכברים ולבודד את מח העצם להשתמש כביקורת מכתים להגדיר את פלוw cytometry שערים. הכתם מח העצם (BM) כפי שתואר לעיל 1.
2. הכנת תרחיף תא בודד מתוך רקמת הריאה
- הריאות כל מתעכל באמצעות משקל רקמת אופטימיזציה יחס נפח של 0.2g: 5mls של טרום חימם 0.2% וורטינגטון סוג 2 collagenase (ביוכימיקלים וורטינגטון, לייקווד, ניו ג'רזי; חתול # LS004202) מומס HBSS סטרילית. התערובת הוא שקוע בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות 2,3.
- Triturate מדגם היטב עד לעיכול רקמת הריאות זורם בקלות באמצעות פיפטה 10 מ"ל (כ -10 חזרות). דגירה במשך 15 דקות נוספות ב 37 ° C כדי להשלים את הרקמה מעכל ומבטיח השעיה אחיד יותר תא בודד.
- לדלל את תא ריאות ההשעיה עם HBSS ו triturate עם פיפטה 5 מ"ל לפזר שברי הרקמה שיורית.
- סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 70μM להסיר שברי הרקמה מעוכלים. לדוגמא ניתן לחלק multiplצינורות דואר חרוטי בשלב זה כדי למנוע עומס יתר one מסננת התא להקטין את הזמן.
- גלולה ההשעיה תא 10 דקות ב 1500 סל"ד ו למזוג supernatant.
- Resuspend התא באמצעות גלולה בעדינות בטמפרטורת החדר RBC תמוגה חיץ (eBiosciences, בסן דייגו, קליפורניה; חתול # 00-4333-57) ו לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף נפח שווה של HBSS כדי להשבית את המאגר תמוגה ולסנן את ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 40μM להסיר פסולת אגרגטים התא.
- פיפטה 10μl של כל דגימה להיות מוכתם לספור מספרים התא ריאה והן דגימות BM באמצעות hemocytometer. הערה: להקליט את הנפח הכולל של התאים.
- גלולה ההשעיה של תא בודד לתאי ריאה על ידי צנטריפוגה בסל"ד 1500 עבור 10 דקות.
- Resuspend שתי ריאות תאים בע"מ בבית 1x10 6 תאים / מ"ל ב prewarmed (37 ° C) DMEM + (בינוני שונה Dulbecco של הנשר, גלוקוז גבוה (Gibco, בקרלסבד, קליפורניה; חתול # 11965-092) המכיל bovi עוברית 2%ne בסרום (FBS) ו HEPES 10mm.
- הכן פתרון מניות 1mg/ml של Hoechst 33342 צבען (Sigma כימיקלים, St.Louis, מיזורי; חתול # B2261) במים ולסנן לעקר 1,4. לצבוע Hoechst עשוי להיות מאוחסן כמו aliquots ב -80 ° C.
- הוסף Hoescht 33342 צבע לריכוז סופי של 5μg/ml (דילול 200x מלאי 1mg/ml) על השעיית תא בודד.
- מערבבים את התאים על ידי היפוך בעדינות דגירה של 37 ° C אמבט מים במשך 90 דקות בדיוק.
3. מכתים והכנת השעיית ריאות מסוג תאים לניתוח זרימת cytometry
- אחרי 90 דקות את כל השלבים עם תאים Hoechst ריאות מוכתמות חייב להיות מוצא להורג על 4 מעלות צלזיוס או על קרח כדי למנוע בזרימת צבע. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 1500 עבור 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend התאים חיץ קרים כקרח מכתים (PBS 2% FBS).
- תאים Resuspend בריכוז של לא יותר מ 1x10 7 תאים / שפופרת באמצעות 300-600μl של PBS המכיל 2%FBS ו HEPES 10mm.
- הוספה גיחכה כראוי CD45 נוגדנים (בדרך כלל 1:200 דילול של CD45-APC (BD Pharmingen, בסן דייגו, קליפורניה; חתול # 559864) אל הריאות דגימות BM לדגור על קרח למשך 10-15 דקות כולל שליטה בלא כתם במהלך.. הליך ניסיוני שימושי כדי להגדיר את השערים ניתוח.
- תאים גלולה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 1500 סל"ד. למזוג את התאים supernatant ו resuspend ב 500 μl של חיץ מכתים מצונן (PBS 2% FBS). העברה prechilled כובע צינורות הצמד פוליפרופילן (Fisherbrand, Schaumburg, IL: חתול # 14-956-1D).
- הוסף יודיד propidium (PI, מניות 200μg/ml ב PBS) על דגימות ריכוז סופי של 2μg/ml להוציא תאים מתים. לצרכן יש להשתמש בשילוב עם הצבע Hoechst 33,342 כדי להשיג את הפרופיל הנכון הקרינה על ניתוח תזרים cytometric.
- צינורות חנות על הקרח, מוגן מפני אור עד ניתוח cytometry הזרימה.
4. Cytometry ניתוח תזרים להגדיר ולבודדריאות גזע mesenchymal Cell (ריאות MSC) אוכלוסיה באמצעות Hoechst לצבוע בזרימת לזהות אוכלוסייה לוואי (SP)
- Assay זה יש את הדרישות מכשיר הבאים:
- 488 ננומטר (350-355 ננומטר) לייזרים UV
- 2 גלאי בדרך לייזר UV עם כחול (450/65) ואדום (675/50) מסננים.
- הגלאי חייב להיות אדום UV רגישות גבוהה עבור האות האדום. זו עשויה להיות בעיה עם הממיינים תא מבוגרים.
- Chiller היחידה לשמור על מדגם ב 50-10 ° C.
- יישר לייזרים להגדיר למיון תא הבאים פרוטוקול של היצרן.
- איסוף האדום (ציר x) וכחול (ציר y) אותות Hoechst שימוש בקנה מידה ליניארי.
- כוון את שפופרת מתח מכפיל למקום שיא G0/G1 בפינה הימנית העליונה של המרכז על המגרש, כדי לאפשר להציג הולם של האוכלוסייה בצד נגרר. חלק בשלב-S לבין G2 שלם של מחזור התא עשוי להיות מחוץ סולם בצד ימין העליון של העלילה. הכחול sigNAL הוא בהיר יחסית ואילו אות אדום עמום. אופיינית MoFlo XDP (Beckman Coulter, מיאמי, פלורידה) מתח הם 425 עבור הכחול 650 עבור האדומים.
- תאים מתים הם מגודרת החוצה באמצעות לצרכן. נתיב תקן PI (עירור 488nm, 630nm פליטה) יכולה לשמש. לחלופין, PI הוא מתרגש גם על ידי לייזר UV לבין האוכלוסייה התא מת שקרים את היקף בצד ימין של האוכלוסייה בצד (SP) העלילה. זה מקל על הצורך לפצות את האות לצרכן מכל fluorochromes אחרים כגון FITC ו-PE. השיטה המקורית Goodell בעקבות הליכים האחרון 5-7.
- שמרו על ההפרש בלחץ נמוך יחסית במהלך ניתוח ומיון כדי להבטיח רזולוציה הדוק של האוכלוסייה בצד.
- SP מופיע כזרוע לוואי מלבד האוכלוסייה העיקרית לתאי ריאה. אוכלוסייה זו נקראת Hoechst נמוך.
- נמוך Hoechst / SP הוא ניתח להפריד בין אוכלוסיות CD45 חיובי ושלילי באמצעות 2,3 היסטוגרמה (Figure 1).
- בעקבות הבחירה gating של האוכלוסייה נמוכה Hoechst CD45 נג MSC ריאות תאים עשויה להיות שנאספו על ידי מיון כאוכלוסייה מעורבת או לתוך צינור או תאים בודדים כדי לבודד שיבוטים לתוך צלחת 96-היטב 3.
- עבור צלחת מיון סטיה זרם מסוג מותאם ל 25% כדי ליצור מעין זרם אנכי יותר מזה בדרך כלל משמש למיון צינור.
- כוונו את זרם מסוג ידי שליחת פולס זרם מבחן על השמאלית העליונה ואז הימנית התחתונה גם צלחת 96-היטב.
- הגדר את תוכנת סדרן המפה צלחת להפקיד את המספר הרצוי של תאים לתוך הבאר כל אחד.
- כדי לבודד שיבוטים תא בודד MSC ריאה אחת היא מיון לתוך הבאר של צלחת 96-150μl גם לתוך תרבות מדיה (α-FBS ממ בתוספת 20%). בעקבות למיין את 100μl נוספת של המדיום הוא הוסיף.
5. , בידוד תרבות אפיון ריאות MSC ו המשובטים
- Culturדואר והרחבת האוכלוסייה MSC מעורבות ריאות שיבוטים תא בודד לאחר מיון זהה באמצעות התנאים תרבות סטנדרטי (37 ° C, CO 2 ו> לחות 95% 5%). תאים מותר לדבוק בידוד הבאים עבור 16 שעות. מדיה מוחלף כל 48 שעות (α-FBS ממ בתוספת 20%). כאשר התאים מתחילים להתרבות במהירות רבה יותר ולהגיע למפגש בין 75-80% הם passaged (איור 2).
- תאים הם שטופים עם HBSS prewarmed ו מודגרות עם 0.5% טריפסין / EDTA (Cellgro, Manassas, VA; חתול # 25-053-Cl) בשעה 37 ° C פחות מ 2 דקות. תאים מנוטרים באמצעות היקף הפוכה כדי לאשר את המראה של השעיה תא.
- ריאות MSC מחולקים אז יחס של 01:02 או 01:03, תלוי בקצב התפשטות הנוכחי של התרבות.
- היכולת של MSC ריאות להתמיין שושלות mesenchymal המסורתי של אוסטאובלסטים, adipocyte ו chondrocyte ואת שטח פני התא שלהם ביטוי של סמנים mesenchymal קיבל iשל הערכה להכנת כל תא. ניתוח cytogenetic banding מבוצע גם כדי לאשר את היעדרם של פגמים בכרומוזומים ברוטו 2,3,8-11.
6. ספירת MSC ריאות באמצעות יצירת המושבה Assay (CFU-F)
- מדולל תאים בינוניים MesenCult השלם (Cell Technologies גזע, ונקובר, BC) לריכוז סופי של 1x10 6 תאים / מ"ל.
- לבצע דילולים סדרתי על מנת להשיג ריכוזי הסופי בצלחת 100mm של 6x10 4 תאים, 4 תאים 3x10, 1.5 x10 4 תאים 0.75 x10 4 תאים 10 מ"ל של התקשורת. ניתוחים מתבצעים בשלושה עותקים כפולים או ריכוז כל תא וניתן לשנותם על שטח פנים קטן יותר.
- התרבות תאים במשך 10 ימים בתנאים סטנדרטיים. ביום 10 תאים שטפה עם PBS וקבוע באמצעות מתנול 100% במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- זיהוי CFU-F מושבות על ידי צביעה עם פתרון Giemsa 0.4% w / v מכתים(סיגמא כימית Co, סנט לואיס, מיזורי) מדולל במים deionized 01:20. אפשר דגימות אוויר יבש לכמת את מספר מושבות המכיל יותר מ 25 תאים לכל המושבה (איור 3).
7. ניתוח של מאפייני המערכת החיסונית של הריאות MSC על הפצת נשק גרעיני תאים T ו אפופטוזיס
- 6.25x10 4 MSC ריאות תאים לכל הם גם מצופה ב 96-היטב צלחות מותר לעמוד 2 לילה.
- CD4 + תאים spleens של T-cell receptor (TCR) העכברים הטרנסגניים, OT-II עם תאי T מזהים את הפפטיד 323-339 ovalbumin, הם מטוהרים על ידי depleting CD8 +, CD19 +, MHC-II + ו-CD25 + תאים עם AutoMACS Miltenyi סדרן תא (Miltenyi, אובורן, CA). תאים Antigen הצגת (APC) מבודדים על ידי חיובי מיון MHC-II + 12 תאים.
- APC המתוקנות paraformaldehyde 4%, שטפתי 3 פעמים PBS / 5% BSA/2mM EDTA, ו עמוסה 0.5μg/ml או 5μg / m אני פפטיד OVA323.
- צמיחה מדומה, נעצר APC מתווספים MSC הריאה ב 96-גם הצלחות.
- גדול מ 95% טהור CD4 + 1x10 5 תאים מסומנים עם 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE: Sigma, St.Louis MO) ב-PBS וטופחו במשך 5 דקות בחושך, שטף עם BSA PBS-5%, ואז הוסיף את APC ותאי ריאה MSC ב DMEM 5% FBS התקשורת. תאים מודגרת מכן למשך 96 שעות.
- מתאי T מוכתמות אז עם אנטי אנטי CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) ו assayed באמצעות MacsQuant Miltenyi ערוץ 7 זרימה cytometer (Miltenyi, Aurburn, CA) ואת FloJo ניתוח תוכנה (Treestar, Ashland, OR). הפצה נמדדת כמו הירידה בעוצמת פלורסנט ממוצע של CFSE לעומת ברקע, ותאי T שכותרתו עם CFSE ולא נחשף APC (איור 4). מתאי T נספרים בזמן הזה הכדאיות העריכו למעט כחול trypan.
8. נציג תוצאות:
"Jove_content"> 
1. תרשים זרימה ניתוח cytometric ו הגדרה של MSC ריאות. המתלים תא בודד של רקמת הריאה לעכל מגואלות Hoechst 33342 ונותחו על ידי זרימת cytometry כדי לזהות הבדלים. פיזור קדימה (FSC) ואת הצד פיזור (SSC) ו-B. Hoechst כחול ואדום פלואורסצנטי. הנוכחות של אוכלוסייה בצד (SP) גלוי השער. נמוך Hoechst SP הוא ניתח אז להפריד את C. CD45 אוכלוסיה שלילי של MSC ריאות. CD45 חיובי יחס שלילי של הריאות SP הם בדרך כלל 70:30 / 60:40.
באיור 2. בידוד והתרבות של MSC ריאות. להלן אוסף של MSC הריאה ידי מיון תאים, התאים מצופה במנות 30mm באמצעות α-ממ supplemented עם FBS 20%.. טרי תאים ממוינים להופיע קטן, עגול ובהיר. B. לאחר כ 2-3 שבועות מושבות עם פנוטיפ mesenchymal מתחזקת ושגשוגם ברור יותר.
באיור 3. ספירת MSC על ידי יצירת Assay המושבה-פיברובלסטים. ריאה MSC מורחבות מצופה לכל פרוטוקול המתואר עבור assay CFU-F. A. לאחר 10 ימים מושבות Giemsa כתם ניכרים. המושבות ב גדולות מורכבת כמה מאות תאים. ג תאים להציג פנוטיפ mesenchymal. A ו-B, בר סולם = 0.5 ס"מ, סרגל קנה מידה C = 0.14 ס"מ.
איור 4. הסלולרי מבוסס CFSE T Assay הפצתו. בהעדר MSC ריאות ונוכחות של antigen תאים המציג (APC) + / - ovalbumin (OVA) CD40 חיובי T תא מפעיל להפגין ירידה בעוצמת CFSE המציין שגשוג (עיגול אדום). עוצמת הקרינה CFSE של קרום תא T פוחתת עם stoichiometrically כלומר כל חלוקת התא. עם כל חלוקה. בנוכחות של הריאות MSC, APC + / - OVA, CD40 חיובי T תא מפעיל להפגין לא חל שינוי משמעותי בעוצמת CFSE אשר מצביע על חוסר שגשוג (עיגול אדום).
Discussion
אנחנו צריכים להתאים שיטה המשמשת בתחילה כדי לזהות תאים hematopoietic BM לבודד אוכלוסייה ספציפית של MSC ריאות תושב. בשל שחזור של בידוד תאים אלה היו אז מאופיין גם MSC. המוצא שלהם הוגדר תושב בריאה עכבר בוגר (להבדיל BM נגזרת) ופרופיל פנוטיפי מולקולרית מתועד 2. היכולת שוב ושוב לבודד אוכלוסיה זו מתאפיינת מאפשר מחקר נוסף של חשיבות ביולוגית תפקיד של MSC הריאה במהלך הומאוסטזיס רקמה ומחלות. ההגדרה האחרונה של אוכלוסייה זו in vivo ברקמת הריאה הן Murine האדם ומקל על הפיתוח של אסטרטגיה טיפולית המכוונת להציל את התאים אנדוגני כדי להקל לתקן ריאות במהלך פציעה ומחלה.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענקים SMM: GIA0855953G AHA, NIH 1R01 HL091105-01. תמיכה נוספת סופק על ידי: DW: NIH RO1DK075013, DDK וקרן Kleberg; תזרים UCCC cytometry Core (NIH 5 P30 CA 46934-15), את UCCC microarray הליבה (NCI P30 CA 46934-14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P-5368 | |
| Hanks buffered salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30588.01 | |
| 0.2% Worthington type 2 collagenase | Worthington Biochemical | LS004202 | |
| Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| H–chst 33342 dye | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| CD45-APC | BD Biosciences | 559864 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 81845 | |
| a-MEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30265.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-069 | |
| 0.5% trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-Cl | |
| Complete MesenCult Medium | Stem Cell Technologies | 05511 | |
| 0.4% w/v Giemsa staining solution | Sigma-Aldrich | GS1L | |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformeldehyde is diluted to 4% using PBS |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21888 |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Jun, D. H. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. , (2011).
- Martin, J. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).
- Majka, S. M. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).
- Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).
- Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).
- Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).
- Chateauvieux, S. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).
- Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).
- Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).
- Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).
- Waid, D. M. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).
