Summary
I den här artikeln visar vi isolering av murina mesenkymala bosatt lung stamceller (lungor MSC), deras expansion, karakterisering och analys av immunmodulerande egenskaper.
Abstract
Tissue bosatt mesenkymala stamceller (MSC) är viktiga regulatorer av vävnad reparation eller förnyelse, fibros, inflammation, angiogenes och tumörbildning. Sammantaget dessa studier tyder på att bosatta lunga MSC spela en roll under lungvävnad homeostas, skada och reparation under sjukdomar som lungfibros (PF) och arteriell hypertension (PAH). Här beskriver vi en teknik för att definiera en population av inhemska lunga MSC. Definitionen av denna population in vivo lungvävnad med hjälp av en definiera uppsättning markörer underlättar upprepade isolering av en väldefinierad stamceller befolkningen med flödescytometri och studiet av en viss celltyp och funktion.
Protocol
1. Lung Isolering
- Sacrifice vuxna möss (8-10 veckors ålder, 18-20 g, C57Bl6J) möss med en överdos av isofluran följt av exsanguination med steril teknik. Profiler kan variera något mellan stammar.
- Kirurgiskt avlägsna membranet, öppna upp bröstkorgen genom att skära bröstkorgen i sidled på varje sida av musen. Spola blod från lungorna genom perfusing rätt hjärtat kammare försiktigt med hjälp av 3-5mls av fosfat saltlösning (PBS).
- Dissekera lungan loberna bort luftstrupen och stora bronker och lägg i en petriskål fylld med Hanks koksaltlösning (HBSS). Efter samling av alla lungcancer lober peang används för att placera vävnad på locket på skålen. Tissue är då malet i små bitar med hjälp av disponibel skalpeller med tillräckligt med vätska för att hålla dem fuktiga men inte så mycket att de flyter och flytta.
- Dissekera en bakdelen av en av möss och isolera benmärgen att använda som en färgning för att ställa in Flow cytometry grindar. Fläck benmärgen (BM) som tidigare beskrivits 1.
2. Beredning av en enda cell Avstängning från lungvävnad
- Varje lunga bryts ned med hjälp av en optimerad vävnad vikt till volym förhållandet 0,2 g: 5mls av förvärmda 0,2% Worthington typ 2 kollagenas (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ, katt # LS004202) löses upp i steril HBSS. Blandningen är nedsänkt i ett 37 ° C vattenbad i 30 min 2,3.
- Mal sönder prov bra tills lungvävnad smälta flyter lätt genom en 10 ml pipett (ca 10 repetitioner). Inkubera i ytterligare 15 min vid 37 ° C för att slutföra vävnaden smälter och ger en mer enhetlig enda cell suspension.
- Späd suspensionen lungan cellen med HBSS och kör med en 5 ml pipett för att skingra kvarvarande vävnad fragment.
- Filtrera suspensionen med 70μM cell sil för att ta bort osmält vävnad fragment. Exempel kan delas in i multiple koniska rör vid denna tidpunkt för att förhindra överbelastning en cell sil och minska tiden.
- Pellets cellsuspensionen i 10 min vid 1500 rpm och dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten försiktigt rumstemperatur RBC lyseringsbuffert (eBiosciences, San Diego, Kalifornien, katt # 00-4333-57) och inkubera vid RT för 5 min. Tillsätt en motsvarande volym av HBSS att inaktivera lyseringsbuffert och filtrera cellsuspension med en 40μM cell sil för att avlägsna skräp och aggregat cell.
- Pipettera 10μl av varje prov som färgas och räkna cell nummer för både lung-och BM prover med en hemocytometer. Observera: spela in den totala volymen av cellerna.
- Pellets den enda cellsuspension av lungceller genom centrifugering vid 1500 rpm i 10 min.
- Resuspendera både lung-och BM celler vid 1x10 6 celler / ml i uppvärmd (37 ° C) DMEM + (Dulbecco ändrade Eagles medium, hög glukos (Gibco, Carlsbad, Kalifornien, katt # 11.965-092) innehållande 2% fetalt Bovine serum (FBS) och 10 mm HEPES.
- Förbered en 1mg/ml stamlösning av Hoechst 33.342 färgämne (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO, katt # B2261) i vatten och filtrera sterilisera 1,4. Den Hoechst färgämne kan lagras som alikvoter vid -80 ° C.
- Lägg Hoescht 33.342 färg till en slutlig koncentration av 5μg/ml (en 200x utspädning av en 1mg/ml lager) till den gemensamma cellsuspension.
- Blanda de celler genom att försiktigt inversion och inkubera i 37 ° C vattenbad i exakt 90 minuter.
3. Färgning och Beredning av Lung cellsuspensionen för flödescytometri analys
- Efter 90 min alla steg med Hoechst färgade lungceller måste utföras vid 4 ° C eller på is för att förhindra att färga efflux. Pellets cellerna genom centrifugering vid 1500 rpm i 10 min vid 4 ° C och återsuspendera cellerna i iskallt färgning buffert (PBS 2% FBS).
- Resuspendera cellerna vid en koncentration på högst 1x10 7 celler / rör med 300-600μl PBS innehållande 2%FBS och 10 mm HEPES.
- Lägg tillräckligt fnissade CD45 antikroppar (vanligen 1:200 utspädning av CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, Kalifornien, katt # 559.864) till lungan och BM prover Inkubera på is i 10-15 minuter Inklusive en ofärgade kontroll under.. experimentell procedur är lämpligt att ange analysen grindarna.
- Pellets celler vid 4 ° C i 5 min vid 1500 rpm. Dekantera supernatanten och suspendera cellerna i 500 l av kylda färgning buffert (PBS 2% FBS). Transfer till prechilled polypropylen snäpplock rör (Fisherbrand, Chicago, IL, katt # 14 till 956-1D).
- Lägg propidiumjodid (PI, 200μg/ml lager i PBS) till prover för en slutlig koncentration av 2μg/ml att utesluta döda celler. PI måste användas i kombination med Hoechst 33.342 färgen för att få rätt fluorescens profilen på flödescytometrisk analys.
- Förvara provrören på is, skyddas från ljus tills flödescytometri analys.
4. Flödescytometrisk analys att definiera och Isoleraen lunga mesenkymala stamceller (lungor MSC) befolkningen som använder Hoechst färgämne efflux att upptäcka en Side Befolkning (SP)
- Denna analys har följande instrumentet krav:
- 488 nm och UV (350-355 nm) laser
- 2 detektorer på UV-laser vägen med blå (450/65) och röd (675/50) filter.
- UV röda detektor måste ha hög känslighet för röd signal. Detta kan vara ett problem med äldre cell sorterare.
- Frysaggregat att hålla provet vid 5-10 ° C.
- Rikta laser och ställa upp för cellsortering enligt tillverkarens protokollet.
- Samla de röda (x-axeln) och blå (y-axel) Hoechst signaler med hjälp av en linjär skala.
- Justera spänningar fotomultiplikatorn röret för att placera G0/G1 topp i övre högra hörnet i mitten på tomten för att möjliggöra adekvat visning av den avslutande sidan befolkningen. En del av S-fas och hela G2 av cellcykeln kan vara utanför skalan uppe till höger i handlingen. Den blå SIGNAL är relativt ljusa medan den röda signalen är svag. Typiska MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) spänningar 425 för blå och 650 för de röda.
- Döda celler gated ut med PI. Standarden PI-bana (excitation 488nm, utsläpp 630nm) kan användas. Alternativt är PI också upphetsad av UV-laser och döda cellpopulation ligger utanför skalan på höger sida av sida befolkningen (SP) tomt. Detta minskar behovet av att kompensera PI signal från någon annan fluorokromer som FITC och PE. Den ursprungliga Goodell Metoden följde de senare metoderna 5-7.
- Bibehålla en relativt låg tryckskillnad under analysen och sortering för att säkerställa tät lösning av sidan befolkningen.
- SP visas som en sidoarm bortsett från de största population av lungceller. Denna population kallas Hoechst låg.
- Den Hoechst låga / SP analyseras för att skilja CD45 positiva och negativa populationer med hjälp av ett histogram 2,3 (Figure 1).
- Efter urval och slussning av Hoechst låg CD45-neg lunga MSC befolkningen cellerna kan samlas genom att sortera antingen som en blandad befolkning i ett rör eller enstaka celler att isolera kloner i en 96-brunnar 3.
- För platta sortera böjningen sorts ström justeras till 25% för att skapa en mer vertikal sorts ström än vad som vanligtvis används för rör sortering.
- Rikta sortera strömmen genom att skicka en puls testa ström på den övre vänstra och sedan det nedre högra väl om en 96-brunnar.
- Ställ sorterare kartprogramvara platta att sätta önskat antal celler i varje brunn.
- Att isolera enstaka cell kloner en enda lunga MSC är sorterade i brunnen av en 96-väl plattan i 150μl kultur-medier (α-MEM kompletterad med 20% FBS). Efter typ en extra 100μl av medium tillsätts.
5. Isolering, kultur och karakterisering av lung MSC och kloner
- Culture och expansion av blandad lung MSC befolkningen och enstaka kloner cell efter sortering är identisk med standard odlingsbetingelser (37 ° C, 5% CO 2 och> 95% luftfuktighet). Celler är tillåtet att följa efter isolering i 16 timmar. Media ersätts var 48 timmar (α-MEM kompletterad med 20% FBS). När cellerna börjar föröka sig snabbare och når mellan 75-80% sammanflödet de passerats (Figur 2).
- Celler sköljs med uppvärmd HBSS och inkuberas med 0,5% trypsin / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, katt # 25 till 053-Cl) vid 37 ° C för mindre än 2 min. Celler övervakas med hjälp en inverterad utrymme för att bekräfta förekomsten av en cellsuspension.
- Lung MSC är sedan upp till förhållandet mellan 1:2 eller 1:3 beroende på den aktuella spridningen takt av kulturen.
- Förmågan av lung MSC att differentieras till traditionella mesenkymala linjerna av osteoblastmigrering, fettceller och chondrocyte och deras cellytan uttryck accepteras mesenkymala markörer is utvärderas för varje cell beredning. Cytogenetiska banding analys utförs också för att bekräfta avsaknaden av grov kromosomavvikelser 2,3,8-11.
6. Räkning av lunga MSC använda en kolonibildande analys (CFU-F)
- Späd celler i Komplett MesenCult medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) till en slutlig koncentration på 1x10 6 celler / ml.
- Utför seriespädningar du uppnår halter i ett 100mm fat 6x10 4 celler, 3x10 4 celler, 1,5 x10 4 celler och 0,75 X10 4 celler i 10 ml av media. Analyser utförs i två eller tre exemplar för varje cell koncentration och kan skalas för mindre ytor.
- Kultur celler i 10 dagar under normala förhållanden. På dag 10 celler sköljs med PBS och fixeras med 100% metanol i 5 minuter i rumstemperatur.
- Upptäcka CFU-F kolonier genom färgning med 0,4% w / v Giemsa färglösning(Sigma Chemical Co, St Louis, MO) späds 1:20 med avjoniserat vatten. Låt prover för att lufttorka och kvantifiera antalet kolonier som innehåller mer än 25 celler per koloni (Figur 3).
7. Analys av immunmodulerande egenskaper av lung MSC på T-cellernas tillväxt och apoptos
- 6.25x10 4 lunga MSC celler per brunn är pläterade i 96-brunnar och får stå över natten 2.
- CD4 + celler från mjälte av T-cells receptor (TCR) transgena möss, OT-II med T-celler som känner igen äggalbumin 323-339 peptid, renas genom nedbrytande CD8 +, CD19 +, MHC-II + och CD25 + celler med en Miltenyi AutoMACS cell sorterare (Miltenyi, Auburn, Kalifornien). Antigenpresenterande celler (APC) är isolerade med positivt sortering MHC-II + celler 12.
- APC är fasta i 4% paraformaldehyd, tvättade 3 gånger i PBS / 5% BSA/2mM EDTA, och laddade med 0.5μg/ml eller 5 mikrogram / ml OVA323 peptid.
- Simulerad, tillväxt greps APC läggs till lungan MSC i 96-hålsplattor.
- Mer än 95% ren CD4 + 1x10 5 celler är märkta med 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE, Sigma, St.Louis MO) i PBS och inkuberas i 5 minuter i mörkret, tvättas med PBS-5% BSA, och därefter till APC och lungceller MSC i DMEM 5% FBS medier. Cellerna inkuberas därefter i 96 timmar.
- T-cellerna färgas sedan med anti anti-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue), Vbeta 5 (PE) och analyseras med hjälp av en Miltenyi MacsQuant 7 flödescytometer kanal flöde (Miltenyi, Aurburn, CA) och Flojo analysprogram (Treestar, Ashland, OR). Spridning mäts som minskning av genomsnittligt fluorescerande intensitet CFSE jämfört med den bakgrunden, T-celler märkta med CFSE och inte utsätts för APC (Figur 4). T-celler räknas vid denna tid och livskraft bedömas trypan blå utslagning.
8. Representativa resultat:
Figur 1. Flödescytometrisk analys och definition av lung MSC. Enstaka cellsuspensioner av lungvävnad smälta färgas med Hoechst 33.342 och analyseras med flödescytometri att upptäcka skillnader i A. Forward Scatter (FSC) och Side Scatter (SSC) och B. Hoechst blå och röd fluorescens. Närvaron av en sida befolkning (SP) är synligt i grind. Den Hoechst låga SP analyseras sedan att separera C. CD45 negativ befolkningsutveckling av lung MSC. CD45 positiva till negativa tal av lung SP är typiskt 70:30 / 60:40.
Figur 2. Isolering och odling av Lung MSC. Efter insamlingen av lungan MSC genom cell sortering, är de celler pläterade i 30mm rätter med α-MEM supplemorienterade med 20% FBS. A. Färskt sorteras celler, tycks små, runda och ljusa. B. Efter ca 2-3 veckor kolonier med en mesenkymala fenotyp blivit uppenbar och spridningen är mer uppenbart.
Figur 3. Räkning av MSC av kolonibildande-Fibroblast Assay. Expanded lungan MSC är pläterade per den beskrivna protokollet för CFU-F-analysen. Efter 10 dagar A. och Giemsa fläcken kolonier är uppenbara. B. kolonier är stora och består av en några hundra celler. C. celler visar en mesenkymala fenotyp. A & B, Scale bar = 0,5 cm, C Scale bar = 0,14 cm.
Figur 4. CFSE Baserat T-cellernas tillväxt analys. I avsaknad av lunga MSC och förekomsten av antigen presenterande celler (APC) + / - äggalbumin (OVA) CD40 positiva effektor T-cell visar en minskning i CFSE intensitet som indikerar spridning (röd cirkel). CFSE fluorescensintensitet av T-cellmembranet minskar stökiometriskt vid varje celldelning, dvs. med varje division. I närvaro av lungan MSC, APC + / - OVA, CD40 positiva effektor T-cell visar ingen signifikant förändring av CFSE intensitet som tyder på en brist av spridning (röd cirkel).
Discussion
Vi har anpassat en metod användes ursprungligen för att identifiera BM hematopoetiska celler att isolera en specifik population av inhemska lunga MSC. På grund av reproducerbarheten av isolering dessa celler var då väl karaktäriseras som MSC. Deras ursprung har definierats som bosatt i vuxen mus lungan (i motsats till härledda BM) och en fenotypisk och molekylära profil dokumenterade 2. Förmågan att upprepade gånger isolera denna kännetecknas befolkningen gör att ytterligare studier av den biologiska betydelse och roll i lungan MSC under vävnad homeostas och sjukdom. Den senaste definitionen av denna population in vivo i både mus och mänsklig lungvävnad underlättar utvecklingen av en terapeutisk strategi inriktad på att rädda endogena celler för att underlätta lunga reparation under skador och sjukdomar.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av bidrag till SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Ytterligare stöd kom från: DW: NIH RO1DK075013, DDK och Kleberg Foundation, den Uccc flödescytometrisystem Core (NIH 5 P30 CA 46.934-15), den Uccc Microarray kärnan (GNI P30 CA 46.934-14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P-5368 | |
| Hanks buffered salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30588.01 | |
| 0.2% Worthington type 2 collagenase | Worthington Biochemical | LS004202 | |
| Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| H–chst 33342 dye | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| CD45-APC | BD Biosciences | 559864 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 81845 | |
| a-MEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30265.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-069 | |
| 0.5% trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-Cl | |
| Complete MesenCult Medium | Stem Cell Technologies | 05511 | |
| 0.4% w/v Giemsa staining solution | Sigma-Aldrich | GS1L | |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformeldehyde is diluted to 4% using PBS |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21888 |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Jun, D. H. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. , (2011).
- Martin, J. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).
- Majka, S. M. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).
- Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).
- Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).
- Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).
- Chateauvieux, S. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).
- Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).
- Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).
- Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).
- Waid, D. M. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).
