Summary
Aproveitando os avanços na fluoróforo desenvolvimento e tecnologia de imagem, um método simples de Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue foi planejado para visualizar a interação precoce entre vírus e células.
Abstract
Os eventos iniciais na interação entre vírus e células podem ter profunda influência sobre o resultado da infecção. Determinar os fatores que influenciam essa interação pode levar a uma melhor compreensão da patogênese da doença e assim influenciar a vacina ou o projeto terapêutico. Assim, o desenvolvimento de métodos para investigar essa interação seria útil. Os recentes avanços na fluoróforos desenvolvimento 1-3 e tecnologia de imagem 4 pode ser explorada para melhorar o nosso conhecimento atual sobre a patogênese da dengue e assim pavimentar o caminho para reduzir os milhões de infecções por dengue ocorrem anualmente.
O vírus da dengue envolvido tem um andaime externo composto de 90 glicoproteína do envelope (E) dímeros que protejam o reservatório nucleocapsídeo, que contém uma fita única de RNA positivo genoma 5. As subunidades idênticas de proteína na superfície do vírus pode assim ser rotulados com um corante reativo de amina e visualizados através de microscopia de imunofluorescência. Aqui, apresentamos um método simples de rotulagem do vírus da dengue com Alexa Fluor succinimidyl éster corante dissolvido diretamente em um buffer de bicarbonato de sódio que rendeu vírus altamente viável após rotulagem. Não existe um procedimento padronizado para a rotulagem de vírus vivo e protocolo do fabricante existente para a rotulagem de proteínas geralmente requer a reconstituição do corante em dimetilsulfóxido. A presença de dimetilsulfóxido, mesmo em quantidades mínimas, podem bloquear a infecção produtiva de vírus e também induzir citotoxicidade de 6 células. A exclusão do uso de dimetil sulfóxido neste protocolo, assim, reduzida essa possibilidade. Corantes Alexa Fluor têm fotoestabilidade superior e são menos sensíveis ao pH do que as tinturas comuns, como a fluoresceína e rodamina 2, tornando-as ideais para estudos sobre a absorção celular e transporte endossomal do vírus. A conjugação de Alexa Fluor tintura não afeta o reconhecimento do vírus da dengue rotulado por vírus específicos de anticorpos e seus supostos receptores em células hospedeiras 7. Esse método pode ter aplicações úteis em estudos virológicos.
Protocol
1. Alexa Fluor rotulagem de vírus da dengue
- Antes da reação de rotulagem, purificar o vírus da dengue com almofada de sacarose e preparar os reagentes e equipamentos necessários, conforme indicado no protocolo.
- Prepare tampão de bicarbonato de sódio 0,2 M fresca, pH 8,5 (tampão de marcação), e 1,5 M tampão hidroxilamina, pH 8.3 (parar de reagente), pouco antes de rotulagem e filtro de esterilizar com filtros de seringa 0,2 Hm.
- Diluir aproximadamente 3x10 8 unidades formadoras de placa (UFP) de vírus da dengue purificada em 1ml de rotulagem de buffer em um tubo de 2 ml. Isto pode ser ampliado proporcionalmente para a rotulagem lote de vírus.
- Reconstituir o liofilizado Alexa Fluor 594 (AF594) ésteres succinimidyl 1mm de rotulagem tampão imediatamente antes da reação rotulagem. Fluorocromos outra do Alexa Fluor corante série pode ser usado de acordo com nossas necessidades. Minimizar a exposição à luz a partir desta etapa.
- Adicionar 100μl do AF594 1mM corante ao vírus diluído agitando suavemente com a ponta da pipeta.
- Incubar a mistura de reacção rotulagem em temperatura ambiente por 1 hora no escuro. Misture por inversão suave a cada 15mins.
- Girar o tubo brevemente em uma centrífuga de mesa e adicionar 100μl do reagente de parada para a mistura de reacção, agitando suavemente com a ponta da pipeta.
- Incubar a temperatura ambiente por uma hora adicional no escuro. Misture por inversão suave a cada 15mins.
2. Purificando Alexa Fluor rotulados vírus da dengue
- Nesse meio tempo, equilibrar a coluna de purificação com tampão de escolha. Neste experimento, uma coluna PD-10 é equilibrada com 25ml de tampão HNE (Hepes 5mM, 150mm NaCl, 0,1 mM EDTA), pH 7,4, antes de usar.
- Aplicar o vírus rotulados para o topo da coluna e começar a recolher o fluxo através uma vez que o vírus entra no rotulados matriz. Preencher a coluna com tampão HNE uma vez todos os vírus rotulados entrou na matriz. Descartar o primeiro de 2,5 ml de fluxo e recolher o 2ml próxima da fração vírus rotulados.
- Alíquotas e armazenar purificada AF594 vírus da dengue rotulados de -80 ° C, longe da fonte de luz.
- Descongelar uma alíquota e determinar o título do vírus marcado pelo ensaio de placa antes de usar o lote de vírus rotulados.
- Semente de 5x10 4 por bem de células Vero, cultivadas em M-199 meio de crescimento, em uma placa de quatro poços com uma lamela na parte inferior do bem um dia antes da infecção.
- Retire o sobrenadante da cultura em bem e infectar as células com multiplicidade de infecção de um vírus da rotulados em volume 100μl (diluído em M-199 meio de manutenção, conforme necessário) para 10min a 37 ° C.
- Remover o inóculo e lavar as lamelas duas vezes em 1xPBS.
- Fixar as células em paraformalydehyde 3% para 30 minutos.
- Lavar as lamelas 3 vezes em 1xPBS.
- Permeabilizar as células com uma solução de permeabilização contendo saponina 0,1% e BSA 5% em 1xPBS para 30 minutos.
- Incubar as células com puro-centrifugação sobrenadante clarificado da cultura hibridoma anticorpo monoclonal 3H5 para 1h em câmara úmida, protegido da luz.
- Lavar as lamelas 3 vezes em tampão de lavagem (1xPBS contendo 1mM de cloreto de cálcio, cloreto de magnésio 1 mM e 0,1% saponina).
- Incubar as células com anticorpos IgG AF488 anti-mouse, diluída em solução 1:100 permeabilização, por 45mins em câmara úmida, protegido da luz.
- Lavar as lamelas 3 vezes em tampão de lavagem e enxágüe de vez em água deionizada.
- Dab a borda da lamínula contra uma toalha de papel para drenar o excesso de água e monte sobre a lâmina de vidro com 8μl Mowiol 4-88 Dabco contendo 2,5%.
- Permitir que a solução de montagem para definir durante a noite a 4 ° C antes de visualizar usando um microscópio confocal Zeiss. Aquisições seqüenciais devem ser realizadas fluoróforo uma emocionante ao mesmo tempo e alternar entre os detectores concomitantemente.
- As imagens são então analisados para co-localização da coloração de anticorpos E proteínas com o vírus rotulados usando o software LSM Zeiss Zen para estimar o grau de rotulagem.
3. Resultados representante
Um exemplo da produção de vírus da dengue marcado com corante AF594 é mostrado na Figura 2. Normalmente, menos de 10 vezes caem do título inicial deve ser observado após a rotulagem de sucesso. No entanto, deve-se notar que todos os buffers tem que estar preparado para a nova rotulagem para ser bem sucedido e os ésteres Alexa Fluor succinimidyl deve ser utilizado imediatamente após a reconstituição como eles hidrolisar em nonreactive ácidos livres em soluções aquosas 8.
Em seguida, o vírus rotulados tem que ser verificada para fluorescência suficiente antes do uso em experimentos. Um simples teste de imunofluorescência foi feito em células Vero e do grau de rotulagem pode ser estimada a partir da co-localização do vírus marcados com anti-E coloração do anticorpo da proteína. Cortaral células foram examinadas e uma imagem típica confocal é mostrado na Figura 3. Co-localização análise das imagens utilizando o software LSM Zen demonstraram sobreposição coeficientes que variam de 0,65-0,8, sugerindo que cerca de 65 a 80% do virions foram marcados com o corante.
Figura esquema 1.Overall retratando o Alexa Fluor rotulagem tintura de dengue procedimento vírus. Primeiro, os buffers relevantes e vírus da dengue purificada estão preparados. O Alexa Fluor corante é reconstituído e adicionado ao vírus da dengue diluído em rotulagem buffer. A reação é então interrompida uma hora depois, com a adição do reagente de parar. Posteriormente, o vírus rotulados é purificado através de uma coluna de exclusão de tamanho para remover tinta livre. Finalmente, o vírus é rotulado re-titulada por ensaio de placa e testado para fluorescência.
Figura 2. O número médio de virions viáveis (UFP / ml), conforme determinado em um ensaio de placa antes e depois da AF594 rotulagem. Uma alíquota do AF594 vírus da dengue é rotulado descongeladas e re-titulada por ensaio de placa e ele mostra tipicamente menos de 10 vezes queda de o título de partida. Barras de erro indicam o desvio padrão de duplicatas.
Figura 3. Co-localização de AF594 etiquetas com proteínas do vírus da dengue E em células Vero. Células cultivadas em lamínulas no dia anterior estavam infectadas com dengue AF594 rotulada a MOI de 1 por 10 minutos a 37 ° C. As células foram fixadas e marcadas com anti-E de anticorpos, e examinadas para co-localização da proteína E (verde) e AF594 rotulagem (vermelho). Sinais fluorescentes foram visualizados sob a ampliação 63X usando Zeiss LSM 710 microscópio confocal. Barra de escala é 10μm. Amarelas indicam áreas de co-localização, como mostrado no encarte.
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Discussion
Embora AF594 corante foi usado neste relatório, uma ampla gama de fluoróforos na succinimidyl Alexa Fluor ésteres série está disponível com a química rotulagem similar. Isso poderia estender a aplicação rotulagem além de imagens. Citometria de fluxo pode ser usado como uma alternativa para microscopia confocal para estimar o grau de rotulagem para os fluoróforos que pode ser animado e detectado pela máquina FACS.
Corantes Alexa Fluor são pequenas moléculas que reagem com grupos amino livres, principalmente lisina arginina e 9, normalmente virado para o exterior os resíduos de proteínas. Em nosso laboratório conjugação, do vírus da dengue com 100μM de Alexa Fluor 594 dye desde brilho suficiente para geração de imagens com uma perda mínima do título viral. Brilho diferente pode ser conseguido através da variação da concentração de corante utilizado. No entanto, o aumento da concentração de corante pode reduzir a viabilidade do vírus 7,10. Uma possível limitação é a interferência na ligação aos receptores, devido ao bloqueio de acesso pela fluoróforos. Portanto, dependendo da aplicação, um nível óptimo de rotulagem deve ser determinada para garantir um equilíbrio entre o grau de rotulagem e abrogation10 funcional. Note que a concentração também pode ser afetada pela reação pós-embalagem dos ésteres Alexa Fluor succinimidyl 8.
A rotulagem directa do vírus da dengue com Alexa Fluor dye aqui apresentados não requer quaisquer passos adicionais de rotulagem para visualizar o vírus, eliminando assim a possibilidade de não-específicas de coloração indireta anticorpos antivirais. Ele também permite o rastreamento em tempo real interiorização da pós-eventos em imagens de células vivas. Este método é relativamente simples, e porque a conjugação é estável, ele pode ser usado para produzir e armazenar lote marcado com vírus para inúmeras experiências em vez de corantes fluorescentes lipophillic, como de cadeia longa carbocyanine1 ,1-dioctadecyl-3, 3, corantes 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (DiD) ou styryl, que não podem ser armazenados no frio por mais de 3 dias.
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Disclosures
Não temos nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela National Medical Research Council, de Cingapura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
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