Summary
Fluorofor geliştirme ve görüntüleme teknolojisi, virüs, virüs ve hücre arasındaki ilk etkileşimleri görselleştirmek için geliştirildi dang Alexa Fluor etiketleme basit bir yöntem gelişmeler yararlanan.
Abstract
Virüs ve hücre arasındaki etkileşimin erken olaylar enfeksiyon sonucu üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. Bu etkileşimin etkileyen faktörlerin belirlenmesi, hastalık patogenezi daha iyi anlaşılması için yol ve böylece aşı veya tedavi edici tasarımı etkileyebilir. Bu nedenle, bu etkileşimin prob yöntemlerin geliştirilmesi yararlı olacaktır. Fluorophores geliştirme 1-3 ve görüntüleme teknolojisi 4, son gelişmeler, dang patogenezi ile ilgili mevcut bilgi geliştirmek ve böylece milyonlarca yılda meydana gelen dang enfeksiyonları azaltmak için önünü yararlanılabilir.
Zarflı Dang virüsü tek bir pozitif iplikli RNA genomu 5 içeren nucleocapsid kabuk korunması, 90 zarf glikoprotein (E) dimerleri oluşan harici bir iskele vardır. Böylece virüsün yüzeyinde aynı protein altbirimden amin reaktif boya ile etiketlenmiş ve immunofluorescent mikroskobu yoluyla görüntülendi olabilir. Burada, Alexa Fluor succinimidyl ester boya etiketleme sonra, son derece canlı virüs vermiştir sodyum bikarbonat tampon doğrudan çözünmüş dang virüsü etiketleme basit bir yöntem mevcut. Canlı virüs ve protein etiketleme genellikle dimetil sülfoksit boya sulandırılması gereklidir mevcut üretici protokol etiketlenmesi için standart bir prosedür yoktur. Varlığı, dimetil sülfoksit dakika miktarlarda bile, virüs verimli enfeksiyonu engellemek ve aynı zamanda hücre sitotoksik 6 neden. Bu protokol dimetil sülfoksit kullanımı dışlama böylece bu olasılığı azalır. Alexa Fluor boyalar üstün fotostabilite ve hücresel alımı ve virüs endosomal taşıma çalışmaları için ideal hale getirir, floresein ve rodamin 2 olarak ortak boyalar, daha az pH duyarlı . Alexa Fluor boya konjugasyon virüs spesifik antikor ve konak hücrelerine 7 varsayılan reseptörleri etiketli Dang virüsü tanıma etkilemedi. Bu yöntem, virolojik çalışmalarda faydalı uygulamalar olabilir.
Protocol
1. Dang virüsü Alexa Fluor etiketleme
- Etiketleme reaksiyon önce, sakaroz yastık dang virüs arındırmak ve protokolde belirtilen gerekli reaktifler ve ekipman hazırlamak.
- Etiketleme ve filtre 0.2μm şırınga filtreler ile sterilize hemen önce taze 0,2 M sodyum bikarbonat tamponu, pH 8.5 (etiketleme tampon), ve 1,5 M hidroksilamin tamponu, pH 8.3 (reaktif durdurmak) hazırlayın.
- 1ml 2ml tüp tampon etiketleme saflaştırılmış dang virüsü yaklaşık 3x10 8 plak oluşturan birim (pfu) sulandırınız. Bu virüs toplu etiketleme için orantılı büyütülüyor olabilir.
- Sulandırın liyofilize Alexa Fluor 594 (AF594) hemen önce etiketleme reaksiyon tampon etiketleme 1mm succinimidyl esterleri. Alexa Fluor boya serisi Diğer fluorochromes ihtiyaçlarına göre kullanılıyor olabilir. Bu adım itibaren ışığa maruz kalma en aza indirin.
- 1mm AF594 boya, 100μl seyreltilmiş virüs pipet ucu ile hafifçe karıştırarak ekleyin.
- Karanlıkta 1hr için etiketleme reaksiyon karışımı oda sıcaklığında inkübe edin. Nazik inversiyon her 15mins karıştırın.
- Bir masaüstü santrifüj tüp kısaca Spin ve pipet ucu ile hafifçe karıştırarak durdurmak reaktifin reaksiyon karışımı 100μl ekleyin.
- Karanlık bir ek saat oda sıcaklığında inkübe edin. Nazik inversiyon her 15mins karıştırın.
2. Arındırıcı Alexa Fluor dang virüsü etiketli
- Bu arada, seçim tamponu ile arıtma sütun dengelenmesi. Bu deneyde, PD-10 sütun HNE tampon 25ml (5mM HEPES, 150mm NaCl, 0.1mm EDTA) Kullanmadan önce pH 7.4 ile dengelenmiş.
- Sütunun üst etiketli virüs uygulayın ve etiketli virüs matris girer kez-through akış toplamaya başlar. Etiketli tüm virüs matris girdikten sonra HNE tamponu ile sütun doldurun. Flow-through ilk 2.5ml atın ve etiketli virüs fraksiyonu sonraki 2ml toplamak.
- -80 Yılında saflaştırılmış AF594 etiketli Dang virüsü kısım ve mağaza ° C, ışık kaynağından uzakta.
- Bir kısım çözülme ve etiketli virüs toplu kullanmadan önce virüs etiketli plak yöntemi ile titresi belirlemek.
- Enfeksiyon bir gün önce iyice altındaki bir lamel ile 4 plaka M-199 büyüme ortamında yetişen Tohum Vero hücreleri 5x10 4'e göre,.
- 37 iyi kültür süpernatantı ve 10dk 100μl hacmi (M-199 bakım orta gerektiği gibi seyreltilmiş) etiketli bir virüsün 1 enfeksiyon çokluğu ile hücreleri enfekte ° C
- Inoculums çıkarın ve 1xPBS lamelleri iki kez yıkayın.
- 30 dakika için% 3 paraformalydehyde hücrelerin sabitleyin.
- 1xPBS lamelleri 3 kere yıkayın.
- Permeabilization çözümü ile, 30 dakika için 1xPBS% 0,1 saponin ve% 5 BSA içeren hücreler Permeabilize.
- Hücreleri inkübe sulandırılmamış santrifüj açıklık, nemli bir odasında 1hr 3H5 monoklonal antikor hibridoma kültür süpernatant ışıktan korunmalıdır.
- (1xPBS 1mm kalsiyum klorür, 1mm magnezyum klorür ve% 0,1 saponin içeren) yıkama tamponu lamelleri 3 kere yıkayın.
- AF488 anti-fare IgG ile hücreler inkübe, 1:100 nemli odasında 45 dakikaya, ışıktan koruyarak, permeabilization çözüm seyreltilmiş.
- Lamelleri 3 kez yıkama tamponu deiyonize su ile yıkayın ve bir kez yıkayın.
- Dab 8μl Mowiol 4-88 içeren% 2.5 Dabco aşırı su tahliye ve cam slayt üzerine monte etmek için bir kağıt havlu karşı lamel kenarında.
- Zeiss konfokal mikroskop kullanarak görüntülemeden önce 4 geceleme ayarlamak için montaj çözümü ° C izin verin. Sıralı satın almalar, eş zamanlı dedektörleri arasında bir zaman ve anahtarlama heyecan verici bir fluorofor yapılmalıdır.
- Görüntüler daha sonra etiketleme derecesini tahmin etmek Zeiss LSM Zen yazılımı kullanarak virüs etiketli E protein antikor boyama co-lokalizasyonu için analiz edilir.
3. Temsilcisi Sonuçlar
AF594 boya ile etiketlenmiş dang virüsü verim bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. Normalde, ilk titresi 10 kat damla daha az başarılı etiketleme dikkat edilmelidir. Ancak, tüm tamponlar, başarılı olmak ve sulu çözeltileri 8 reaktif serbest asitleri hidroliz olarak Alexa Fluor succinimidyl esterleri sulandırıldıktan sonra hemen kullanılması gerekir etiketleme için taze hazırlıklı olmak olduğunu belirtmek gerekir .
Sonra, etiketli virüs deneylerde kullanmadan önce yeterli floresan için kontrol edilmelidir. Vero hücreleri üzerinde basit bir immünofloresan tahlil yapıldı ve etiketleme derecesi etiketli virüsün anti-E protein antikor boyama ile co-lokalizasyon tahmin edilebilir. Kesmekal hücreleri incelendi ve tipik bir konfokal görüntü Şekil 3'te gösterilmiştir. Co-localisation virionlar yaklaşık 65 -% 80 boya ile etiketlenmiş olduğunu düşündüren, 0.65 ile 0.8 arasında değişen katsayılar örtüşme gösterdi LSM Zen yazılımı kullanarak görüntü analizi.
Şekil 1.Overall düzeni dang virüs prosedürü Alexa Fluor boya etiketleme resmeden İlk olarak, ilgili tamponlar ve saflaştırılmış Dang virüsü hazırlanır. Alexa Fluor boya sulandırılmış ve tampon etiketleme seyreltilmiş dang virüse eklenir. Reaksiyon, daha sonra durdurmak reaktif ilavesi ile 1 saat sonra durdurulur. Ardından, ücretsiz boya etiketli virüs kaldırmak için bir boyut dışlama sütun aracılığıyla arındırılır. Son olarak, etiketli virüs plak yöntemi ile yeniden titre ve floresans test.
Şekil 2. AF594 etiketleme öncesi ve sonrası bir plaket tahlil belirlenen uygulanabilir virionlar (pfu / ml) sayısı ortalama AF594 etiketli dang virüsü bir kısım çözülmüş ve plak yöntemi ile yeniden titre ve genellikle 10 kat daha az açılan menüden gösterir. başlangıç titresi. Hata çubukları çiftleri standart sapma gösterir.
Şekil 3. Vero hücrelerinde dang virüs E proteinleri ile AF594 etiket Co-lokalizasyon gün önce lamelleri üzerinde yetiştirilen hücreler 37 ° 10 dakika için 1, İçişleri Bakanlığı AF594 etiketli Dang ile enfekte olmuş ° C Hücreler daha sonra sabit ve anti-D antikoru ile etiketlenmiş ve E protein ko (yeşil) ve AF594 etiketleme (kırmızı) açısından incelenir. Floresan sinyalleri 63X büyütme altında Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. Ölçek çubuğu 10μm. Içerlek gösterildiği gibi, Sarı, ko alanları işaret etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporda AF594 boya kullanılmış olmasına rağmen, Alexa Fluor succinimidyl esterleri serisi fluorophores geniş bir yelpazede benzer etiketleme kimyası ile kullanılabilir. Bu etiketleme uygulaması görüntüleme ötesinde genişletmek olabilir. Flow sitometri, heyecanlı ve FACS makine ile tespit edilebilir fluorophores etiketleme derecesini tahmin etmek için konfokal mikroskopi bir alternatif olarak kullanılabilir.
Alexa Fluor boyalar, serbest amino grupları, öncelikle arginin ve lizin 9, normalde dışa proteinlerin artıkları karşı karşıya ile reaksiyona girerek küçük moleküllerdir. Alexa Fluor 594 boya 100μM ile dang virüsü laboratuvar, konjugasyon viral titresi minimum kayıp ile görüntüleme için yeterli parlaklık sağladı. Kullanılan boya konsantrasyonu farklı farklı parlaklık elde edilebilir. Ancak, virüs canlılığı 7,10 boya konsantrasyonu artırarak azaltabilir. Olası bir sınırlama fluorophores erişim abluka nedeniyle reseptör bağlayıcı girişim. Bu nedenle, uygulamaya bağlı olarak, optimal düzeyde bir etiketleme, etiketleme ve fonksiyonel abrogation10 derecesi arasında bir denge sağlamak için kararlı olmalıdır. Konsantrasyonu da Alexa Fluor succinimidyl esterleri 8 post-paketleme reaktivite tarafından etkilenmiş olabilir not etmeyin.
Alexa Fluor boya Burada sunulan dang virüs doğrudan etiketleme, herhangi bir ek etiketleme adımlarını böylece dolaylı antiviral antikorların spesifik olmayan boyama olasılığını ortadan kaldırarak, virüs görselleştirmek için gerekli değildir. Bu da canlı hücre görüntüleme sonrası içselleştirilmesi olaylar gerçek zamanlı izleme sağlar. Bu yöntem, nispeten basit ve konjugasyon istikrarlı, çünkü üretmek ve uzun zincirli carbocyanine1 ,1-dioctadecyl-3, 3 olarak lipophillic floresan boyalar, aksine olarak, birden fazla deneyler için toplu etiketli virüs saklamak için kullanılabilir 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (DKB) veya styryl boyalar, fazla 3 gün süreyle soğuk saklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek için bir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma, Singapur Ulusal Tıp Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W.
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
