Summary
Dra nytta av de framsteg i fluoroforen utveckling och bildteknik, en enkel metod för Alexa Fluor märkning av denguefeber virus utformades för att visualisera det tidiga samspelet mellan virus och cell.
Abstract
Den tidiga händelser i samspelet mellan virus och cell kan ha stor påverkan på resultatet av infektion. Att fastställa de faktorer som påverkar denna interaktion kan leda till ökad förståelse för sjukdomen patogenes och därmed påverka vaccin eller terapeutiska design. Därför skulle utvecklingen av metoder för att undersöka detta samspel vara användbart. Senaste framstegen inom fluoroforer utveckling 1-3 och bildteknik 4 kan utnyttjas för att förbättra vår nuvarande kunskap om denguefeber patogenes och därmed bana väg för att minska de miljontals denguefeber infektioner inträffar årligen.
Den höljeförsedda denguefeber viruset har en extern schavotten bestående av 90 (E) kuvert glykoprotein dimerer skydda nukleokapsid skal, som innehåller ett enda positivt tråd RNA-genom 5. Den identiska protein subenheter på viruset ytan kan därmed märkas med en amin reaktiva färg-och visualiseras genom immunofluorescens mikroskopi. Här presenterar vi en enkel metod för märkning av denguefeber virus med Alexa Fluor succinimidyl ester färgen löses upp direkt i en bikarbonat buffert som gav mycket livskraftiga virus efter märkning. Det finns inget standardiserat förfarande för märkning av levande virus och befintliga tillverkarens protokoll för protein märkning krävs i allmänhet beredning av färg i dimetylsulfoxid. Förekomsten av dimetylsulfoxid, även i små mängder, kan blockera produktiv infektion av viruset och förmå cell cytotoxicitet 6. Undantaget för användning av dimetylsulfoxid i detta protokoll minskas alltså denna möjlighet. Alexa Fluor färgämnen har en överlägsen fotostabilitet och är mindre pH-känslig än vanliga färger, såsom fluorescein och Rhodamine 2, vilket gör dem idealiska för studier av cellulära upptag och endosomal transport av viruset. Den konjugering av Alexa Fluor färgämnet påverkade inte erkänna märkt denguefeber virus av virus-specifik antikropp och dess förmodade receptorer i värdceller 7. Denna metod kunde ha användbara program i virologiska studier.
Protocol
1. Alexa Fluor märkning av denguefeber virus
- Innan märkning reaktionen, rena denguefeber virus med sackaros kudde och förbereda de nödvändiga reagenser och utrustning som anges i protokollet.
- Bered en färsk 0,2 buffert bikarbonat, pH 8,5 (märkning buffert) och 1,5 M hydroxylamin buffert, pH 8,3 (stopp reagens), strax innan märkning och filter sterilisera med 0.2μm spruta filter.
- Späd ca 3x10 8 plack bildas enheter (PFU) av renat denguefeber virus i 1 ml märkning buffert i en 2 ml rör. Detta kan skalas upp proportionellt för batch märkning av virus.
- Rekonstituera den frystorkade Alexa Fluor 594 (AF594) succinimidyl estrar till 1 mm i märkningen buffert omedelbart före märkningen reaktion. Andra fluorokromer från Alexa Fluor färgämnet serie kan användas i enlighet med ett behov. Minimera exponering för ljus från detta steg framåt.
- Tillsätt 100μl av 1mm AF594 färgen till den utspädda viruset under omrörning försiktigt med pipettspetsen.
- Inkubera mixen märkning reaktionen vid rumstemperatur i 1 timme i mörker. Blanda genom försiktig inversion varje 15 min.
- Spin röret kort stund i en bordsskiva centrifug och lägga 100μl av stopp reagens till reaktionsblandningen under omrörning försiktigt med pipettspetsen.
- Inkubera vid rumstemperatur under ytterligare en timme i mörkret. Blanda genom försiktig inversion varje 15 min.
2. Purifying Alexa Fluor märkt denguefeber virus
- Under tiden balansera rening kolonnen med buffert val. I detta experiment är en PD-10 kolonn jämvikt med 25ml av HNE buffert (5mm Hepes, 150mm NaCl, 0.1mm EDTA), 7,4 pH, före användning.
- Applicera märkt viruset till toppen av kolonnen och börja samla genomströmning när den märkta viruset kommer in i matrisen. Fyll kolonnen med HNE buffert när alla märkt viruset har kommit in i matrisen. Kasta de första 2,5 ml av genomströmning och samla in nästa 2 ml av märkt virus bråk.
- Alikvotera och lagra renas AF594 märkt denguefeber virus i -80 ° C, bort från ljuskällan.
- Tina en alikvot och bestämma titer av den märkta viruset av plack-analysen innan du använder det parti av märkt virus.
- Seed 5x10 4 per brunn i Vero celler odlas i M-199 odlingsmedium i en 4-brunnar med ett täckglas på undersidan av väl en dag innan infektion.
- Ta bort supernatant väl och infektera celler med mångfald av infektion i ett av de märkta viruset i 100μl volym (utspädd i M-199 underhåll medium som krävs) för 10min vid 37 ° C.
- Ta bort inoculums och tvätta täckglasen två gånger i 1xPBS.
- Fixera cellerna i 3% paraformalydehyde för 30 minuter.
- Tvätta täckglasen 3 gånger i 1xPBS.
- Permeabilize cellerna med permeabilization lösning innehållande 0,1% saponin och 5% BSA i 1xPBS för 30 minuter.
- Inkubera cellerna med outspädd centrifugering-förtydligas supernatant av 3H5 monoklonal antikropp Hybridomteknik kultur för 1 timme i en fuktig kammare, skyddat från ljus.
- Tvätta täckglasen 3 gånger i tvättbuffert (1xPBS innehåller 1mm kalciumklorid, 1mm magnesiumklorid och 0,1% saponin).
- Inkubera cellerna med AF488 anti-mus IgG-antikroppar, 1:100 utspädd i permeabilization lösning, 45 min i fuktig kammare, skyddat från ljus.
- Tvätta täckglasen 3 gånger i tvättbuffert och skölj en gång i avjoniserat vatten.
- Sandskädda kanten av täckglaset mot en pappershandduk för att dränera överflödigt vatten och montera på glasplatta med 8μl Mowiol 4-88 innehåller 2,5% Dabco.
- Låt monteringslösning att ställa över natten vid 4 ° C innan du visar med hjälp av en Zeiss konfokalmikroskop. Sekventiell förvärv ska utföras spännande fluoroforen i taget och växla mellan detektorerna samtidigt.
- Bilderna analyseras sedan för samarbete lokalisering av E protein antikroppar färgning med den märkta viruset använder Zeiss LSM Zen programvara för att uppskatta graden av märkningen.
3. Representativa resultat
Ett exempel på avkastningen av denguefeber virus märkta med AF594 färg visas i figur 2. Normalt skall mindre än 10-faldig minskning från den ursprungliga titern följas efter framgångsrik märkning. Det bör dock noteras att alla buffertar måste beredas på nytt för märkning ska lyckas och Alexa Fluor succinimidyl estrar bör användas omedelbart efter beredning eftersom de hydrolysera till non-reaktiva fria syror i vattenlösningar 8.
Därefter har märkt viruset som ska kontrolleras tillräckligt med fluorescens före användning i experiment. En enkel immunofluorescens test gjordes på Vero-celler och graden av märkning kan beräknas från co-lokalisering av den märkta virus med anti-E-protein-antikroppar färgning. Several celler undersöktes och en typisk konfokala bilden visas i figur 3. Co-lokalisering analys av bilder med hjälp av LSM Zen programvaran visat överlappning koefficienter som sträcker sig från 0,65 till 0,8, vilket tyder på att cirka 65 till 80% av virioner var märkta med färg.
Figur 1.De totala systemet skildrar Alexa Fluor färg märkning av denguefeber virus förfarande. För det första är den relevanta buffertar och renas denguefeber virus förberedd. Den Alexa Fluor färgämne bereds och läggs till i denguefeber virus utspädd i märkningen buffert. Reaktionen är då slutade 1 timme senare med tillägg av stopp reagens. Därefter är märkt viruset renas genom ett utanförskap kolumn för att ta bort gratis färgämne. Slutligen är märkt viruset åter titreras av plack analys och testas för fluorescens.
Figur 2. Genomsnittliga antalet livskraftiga virioner (PFU / ml) som fastställts på en plakett analys före och efter AF594 märkning. Ett delprov av den märkta AF594 denguefeber virus tinas och åter titreras av plack-analysen och det normalt sett visar mindre än 10-faldig minskning från start titer. Felstaplar visar standardavvikelsen för dubbletter.
Figur 3. Co-lokalisering av AF594 etiketter med denguefeber proteiner virus E i Vero-celler. Celler som odlas på täckglas dagen innan var infekterade med AF594 märkt denguefeber på MOI av 1 i 10 minuter vid 37 ° C. Cellerna har därefter fasta och försedda med anti-E-antikroppar, och undersöks för colocalization E protein (grön) och AF594 märkning (röd). Fluorescerande signalerna visualiseras i 63x förstoring med Zeiss LSM 710 konfokalmikroskop. Skala bar är 10μm. Gult indikerar områden colocalization, som visas i infällda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även AF594 färg har använts i denna rapport är ett brett spektrum av fluoroforer i Alexa Fluor succinimidyl estrar serie nu med liknande märkning kemi. Detta kan förlänga märkning ansökan bortom avbildning. Flödescytometri kan användas som ett alternativ till konfokalmikroskopi för att uppskatta graden av märkning för fluoroforer som kan vara upphetsad och upptäcks av FACS maskin.
Alexa Fluor färgämnen är små molekyler som reagerar med fria aminogrupper, främst arginin och lysin 9, normalt utåt mot rester av proteiner. I vårt laboratorium, konjugering av denguefeber virus med 100μM av Alexa Fluor 594 färga lämnat tillräcklig ljusstyrka för avbildning med minimal förlust i det virala titer. Olika ljusstyrka kan uppnås genom att variera koncentrationen av färg som används. Däremot kan öka färgen koncentrationen minska virusets överlevnad 7,10. En möjlig begränsning är det störningar i receptorbindning på grund av blockad av tillgänglighet för fluoroforer. Därför beroende på tillämpning, bör en optimal nivå för märkning bestämmas att säkerställa en balans mellan graden av märkning och funktionella abrogation10. Notera att koncentrationen också kan påverkas av den post-förpackning reaktivitet Alexa Fluor succinimidyl estrar 8.
Den direkta märkning av denguefeber virus med Alexa Fluor färgämne som presenteras här kräver inga ytterligare märkning steg för att visualisera viruset, och därmed ta bort möjligheten av icke-specifik färgning från indirekta antivirala antikroppar. Det möjliggör också spårning i realtid av post-internalisering händelser i levande cell imaging. Denna metod är relativt enkel, och eftersom konjugation är stabil, kan den användas för att producera och lagra batch-märkta virus för flera experiment i motsats till lipophillic fluorescerande färger, såsom långkedjiga carbocyanine1 ,1-dioctadecyl-3, 3, 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (gjorde) eller styryl färgämnen, som inte kan lagras i kylan i mer än 3 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av National Medical Research Council, Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W.
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
