Summary
ניצול של התקדמות בפיתוח fluorophore ואת טכנולוגיית הדמיה, שיטה פשוטה של אלקסה פלואוריד תיוג של וירוס דנגה תוכננה כדי לחזות את האינטראקציות המוקדמות בין וירוס לתא.
Abstract
האירועים בתחילת האינטראקציה בין הנגיף לתא יכולה להיות השפעה רבה על התוצאה של זיהום. קביעת הגורמים המשפיעים על האינטראקציה הזאת יכולה להוביל להבנה משופרת של הפתוגנזה במחלה ובכך להשפיע על החיסון או עיצוב טיפולית. לפיכך, פיתוח של שיטות בדיקה זו אינטראקציה יהיה שימושי. הפיתוחים האחרונים fluorophores בפיתוח טכנולוגיית הדמיה 1-3 ו 4 ניתן לנצל כדי לשפר את הידע הנוכחי שלנו על הפתוגנזה דנגה, ובכך לסלול את הדרך כדי להפחית את מיליוני זיהומים דנגה המתרחשים מדי שנה.
וירוס דנגה אפוף יש פיגום חיצונית המורכבת 90 גליקופרוטאין המעטפה (E) הדימרים להגן על הקליפה nucleocapsid, אשר מכיל גדיל RNA חיובי יחיד בגנום 5. יחידות משנה החלבון זהה על פני הווירוס ולכן יכול להיות מתויג עם צבע תגובתי אמין ו דמיינו באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescent. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה של תיוג של וירוס דנגה עם אלקסה פלואוריד succinimidyl אסתר צבע מומס ישירות חיץ סודיום ביקרבונט שהניבו וירוס קיימא מאוד לאחר תיוג. אין הליך סטנדרטי עבור תיוג של נגיף חי פרוטוקול היצרן הקיימים תיוג חלבון בדרך כלל דורש את הכינון מחדש של צבע בתוך sulfoxide דימתיל. הנוכחות של sulfoxide דימתיל, אפילו בכמויות מזעריות, יכול לחסום זיהום פרודוקטיבי של הנגיף וגם לגרום cytotoxicity תא 6. הדרה של השימוש sulfoxide דימתיל בפרוטוקול זה ובכך לצמצם את האפשרות הזאת. אלקסה צבעים פלואוריד יש photostability מעולה פחות pH רגיש יותר צבעים נפוצים, כגון והעמסת ו rhodamine 2, מה שהופך אותם אידיאליים עבור מחקרים על ספיגת הסלולר תחבורה endosomal של הנגיף. נטיה של אלקסה פלואוריד לצבוע לא השפיע על זיהוי של וירוס דנגה שכותרתו ידי נוגדן וירוסים ספציפיים קולטנים המשוערת שלה בתאים לארח 7. שיטה זו יכולה להיות יישומים שימושיים במחקרים virological.
Protocol
1. אלקסה פלואוריד תיוג של וירוס דנגה
- לפני התגובה תיוג, לטהר וירוס דנגה עם כרית סוכרוז ולהכין את הצורך ריאגנטים וציוד כמפורט בפרוטוקול.
- הכן ביקרבונט טרי 0.2M נתרן חיץ, pH 8.5 (חיץ תיוג), ו 1.5M חיץ hydroxylamine, pH 8.3 (לעצור מגיב), ממש לפני תיוג לסנן לעקר עם מסנני מזרק 0.2μm.
- מדולל כ 3x10 8 יחידות פלאק ויוצרים (pfu) של מטוהרים וירוס דנגה ב 1ml של תיוג חיץ בתוך שפופרת 2ml. זה יכול להיות scaled עד פרופורציונלי תיוג אצווה של הנגיף.
- מחדש את lyophilized אלקסה פלואוריד 594 (AF594) אסטרים succinimidyl כדי 1mm ב תיוג חיץ מייד לפני התגובה תיוג. Fluorochromes אחרים של פלואוריד אלקסה לצבוע סדרת ניתן להשתמש בהתאם לצרכים של האדם. מזעור החשיפה לאור מכאן ואילך צעד.
- הוסף 100μl של צבע 1mm AF594 לנגיף בדילול תוך ערבוב בעדינות עם קצה פיפטה.
- דגירה התגובה תיוג לערבב בטמפרטורת החדר 1 שעות בחושך. מערבבים על ידי תנוחות הפוכות עדינות כל 15mins.
- ספין בקצרה צינור בצנטריפוגה השולחן ולהוסיף 100μl של מגיב להפסיק לערבב את התגובה תוך ערבוב בעדינות עם קצה פיפטה.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה נוספת בחושך. מערבבים על ידי תנוחות הפוכות עדינות כל 15mins.
2. טיהור אלקסה פלואוריד שכותרתו וירוס דנגה
- בינתיים, לאזן את העמודה טיהור עם המאגר של בחירה. בניסוי זה, טור PD-10 הוא equilibrated עם 25ml של חיץ HNE (Hepes 5mm, 150mm NaCl, 0.1mm EDTA), pH 7.4, לפני השימוש.
- החל את הנגיף שכותרתו לחלק העליון של הטור להתחיל לאסוף את הזרימה דרך אחת הנגיף שכותרתו נכנס מטריקס. מלאו את העמודה עם חיץ HNE כל פעם את הנגיף שכותרתו חתמה מטריקס. בטל 2.5ml הראשון של זרימה דרך לאסוף את 2ml הבא של שבריר וירוס הנקרא.
- Aliquot ולאחסן מטוהרים AF594 וירוס דנגה שכותרתו ב -80 ° C, הרחק ממקור אור.
- הפשירי one aliquot ולקבוע את כייל של נגיף הנקרא על ידי assay פלאק לפני השימוש אצווה של וירוס הנקרא.
- זרעים 5x10 4 ל Vero היטב של תאים, שגודלו בינוני M-199 גדילה, בצלחת 4-היטב עם coverslip על החלק התחתון של יום הרבה לפני זיהום.
- הסר את supernatant תרבות היטב להדביק תאים עם ריבוי הזיהום של 1 של הנגיף שכותרתו בנפח 100μl (בדילול מלא בינוני M-199 תחזוקה כנדרש) עבור 10min ב 37 ° C.
- הסר את inoculums ולשטוף coverslips פעמיים 1xPBS.
- תקן את התאים paraformalydehyde 3% עבור 30mins.
- שטפו את coverslips 3 פעמים 1xPBS.
- Permeabilize התאים עם פתרון permeabilization המכיל saponin 0.1% ו BSA 5% 1xPBS עבור 30mins.
- דגירה התאים עם חי צנטריפוגה, הבהיר supernatant של 3H5 תרבות נוגדן חד שבטי hybridoma עבור 1 שעות בתא לח, מוגן מפני אור.
- שטפו את coverslips 3 פעמים חיץ לשטוף (1xPBS המכיל כלוריד 1mm סידן, מגנזיום כלוריד 1mm saponin 0.1%).
- דגירה התאים עם הנוגדנים AF488 IgG נגד העכבר, 1:100 בדילול מלא בתמיסה permeabilization, עבור 45mins בתא לח, מוגן מפני אור.
- שטפו את coverslips 3 פעמים חיץ לרחוץ ולשטוף במים deionized פעם.
- טובלים את קצה coverslip נגד מגבת נייר לניקוז המים העודפים על הר להחליק זכוכית עם Dabco 8μl 4-88 Mowiol 2.5% המכיל.
- אפשר פתרון הרכבה להגדיר לילה בשעה 4 ° C לפני צפייה באמצעות מיקרוסקופ confocal Zeiss. רכישות רצופות יש לבצע fluorophore מרגש אחד בכל פעם ומיתוג בין גלאי במקביל.
- תמונות מנותחים ואז לוקליזציה משותף של חלבון מכתים נוגדנים E בווירוס שכותרתו באמצעות תוכנת LSM Zeiss זן כדי לאמוד את מידת תיוג.
3. נציג תוצאות
דוגמה תשואה של וירוס דנגה שכותרתו עם צבע AF594 מוצג באיור 2. בדרך כלל, פחות ירידה של פי 10 מן titer הראשונית צריכה להיות שנצפו בעקבות תיוג מוצלח. עם זאת, יש לציין כי חוצצי כל צריך להיות מוכן טרי תיוג להצליח ואת פלואוריד אלקסה אסטרים succinimidyl יש להשתמש מיד לאחר הכינון מחדש כפי שהם hydrolyze לחומצות חינם nonreactive תמיסות מימיות 8.
בשלב הבא, הווירוס שכותרתו יש להיבדק על הקרינה מספיק לפני השימוש בניסויים. Assay immunofluorescence פשוט נעשה על תאים Vero ומידת תיוג ניתן לאמוד מתוך לוקליזציה המשותפת של הנגיף שכותרתו עם אנטי מכתים E-נוגדן חלבון. לנתקאל התאים נבדקו תמונה confocal טיפוסי מוצגת באיור 3. Co-לוקליזציה ניתוח של תמונות באמצעות התוכנה זן LSM הפגינו חפיפה מקדמי החל 0.65-0.8, טוען כי כ -65 עד 80% של virions תויגו עם הצבע.
תכנית איור המתאר את 1.Overall פלואוריד אלקסה תיוג צבען של ההליך וירוס דנגה. ראשית, מאגרים רלוונטיים וירוס דנגה מטוהרים מוכנים. פלואוריד הוא Alexa לצבוע מחדש והוסיף לנגיף דנגה מדולל תיוג חיץ. התגובה היא ונעצר 1 שעה מאוחר יותר עם תוספת של מגיב לעצור. לאחר מכן, הנגיף שכותרתו היא מטוהרים באמצעות עמודה הדרה גודל להסיר צבע חופשי. לבסוף, הווירוס שכותרתו מחדש טיטרציה ידי assay רובד נבדק פלואורסצנטי.
איור 2. ממוצע מספר virions קיימא (pfu / ml) כפי שנקבע על assay שלט לפני ואחרי תיוג AF594. Aliquot של וירוס דנגה AF594 שכותרתו היא מופשר מחדש טיטרציה ידי assay רובד זה בדרך כלל עולה פחות מ -10 לקפל ירידה מ titer ההתחלה. ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן של כפילויות.
איור 3. Co-לוקליזציה של AF594 תוויות עם E וירוס דנגה חלבונים בתאי Vero. התאים גדל על coverslips יום לפני נדבקו דנגה AF594 שכותרתו על הפנים של 1 במשך 10 דקות על 37 ° C. התאים היו קבועים לאחר מכן ומסומן עם נוגדנים נגד E, בדק עבור colocalization של חלבון ה '(ירוק) AF594 תיוג (אדום). אותות פלורסנט היו דמיינו בהגדלה 63X באמצעות Zeiss LSM 710 מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה המידה 10μm. צהוב עולה תחומי colocalization, כפי שמוצג הבלעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות AF594 לצבוע שימש בדוח זה, מגוון רחב של fluorophores בסדרת פלואוריד אלקסה אסטרים succinimidyl זמין כימיה עם תיוג דומה. זה יכול להרחיב את היישום תיוג מעבר הדמיה. Cytometry זרימת יכול לשמש כחלופה מיקרוסקופיה confocal להערכת מידת תיוג עבור fluorophores שניתן נרגש זוהה על ידי מכונת FACS.
אלקסה צבעים פלואוריד הם מולקולות קטנות להגיב עם קבוצות אמינו חופשיות, בעיקר ארגינין ליזין 9, בדרך כלל כלפי חוץ מול שאריות של חלבונים. בשנת נטיה שלנו, מעבדה של וירוס דנגה עם 100μM של אלקסה פלואוריד 594 צבע בתנאי בהירות מספקת הדמיה עם הפסד מינימלי כייל ויראלי. בהירות שונות עשויות להיות מושגת על ידי שינוי ריכוז של צבע המשמשים. עם זאת, להגדיל את הריכוז צבע יכול להפחית את הכדאיות וירוס 7,10. מגבלה אחת אפשרית היא התערבות מחייבת קולטן בשל המצור של גישה ידי fluorophores. לכן, בהתאם ליישום, ברמה אופטימלית של תיוג צריך להיקבע על מנת להבטיח איזון בין מידת תיוג abrogation10 תפקודית. יש לציין כי הריכוז יכול להיות מושפע גם תגובתיות שלאחר האריזה של פלואוריד אסטרים אלקסה succinimidyl 8.
תיוג ישיר של וירוס דנגה עם אלקסה פלואוריד לצבוע המובא כאן אינו דורש שום תיוג צעדים נוספים כדי להמחיש את הנגיף, ובכך להסיר את האפשרות של מכתים הלא ספציפית של נוגדנים אנטי עקיף. זה גם מאפשר מעקב בזמן אמת אחרי הפנמת אירועים בתחום ההדמיה תא חי. שיטה זו היא פשוטה יחסית, כי נטיה יציב, ניתן להשתמש בו כדי לייצר ולאחסן אצווה שכותרתו וירוס עבור ניסויים מרובים לעומת צבעים lipophillic ניאון, כגון carbocyanine1 ארוכי שרשרת ,1-dioctadecyl-3, 3, צבעים 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (האם) או styryl, אשר לא ניתן לאחסן בקור במשך יותר מ 3 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו כבר מומן על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, סינגפור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W.
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
