Summary
Hypoxia inducible कारक 1α गतिविधि के bioluminescence इमेजिंग के लिए एक स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस माउस मॉडल में intracranial ट्यूमर hypoxia के विकास पर नजर रखने के लिए लागू किया जाता है.
Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत पशु देखभाल और टेक्सास विश्वविद्यालय Southwestern मेडिकल सेंटर का प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. इन विट्रो HIF-1α bioluminescence परख
- सामग्री और तरीके:
- मानव metastatic स्तन कैंसर कोशिका लाइन एमडीए MB231 एक उपन्यास HIF-1-निर्भर रिपोर्टर जीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, 5HRE करीब ल्यूक डा. Harada द्वारा उत्पन्न किया गया था.
- Hypoxic हालत में ऑक्सीजन पर निर्भर गिरावट (ODD) डोमेन luciferase संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति बढ़ाया hypoxia प्रतिक्रिया तत्व के 5 प्रतियां (5HRE) के द्वारा संचालित है. ODD की उपस्थिति ODD ल्यूक normoxic स्थितियों में बेहद कम पृष्ठभूमि luciferase गतिविधि में जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन की गिरावट का कारण बनता है. इसलिए, इस उपन्यास प्रणाली के लिए वास्तविक समय इमेजिंग द्वारा एक ट्यूमर में hypoxic क्षेत्रों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 5HRE करीब ल्यूक इस अभिव्यक्ति वेक्टर के निर्माण Harada एट अल 1,2 द्वारा सूचित किया गया है.
- Normoxia या hypoxia के तहत संस्कृति की कोशिकाओं:
- 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) DMEM 1% glutamine, 400 μg / G418 के मिलीलीटर की एंटीबायोटिक दवाओं और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त मध्यम में पुनः संयोजक एमडीए MB231 - कक्षों बनाए रखें.
- X 10 के लिए इन विट्रो HIF-1α bioluminescence परख, 3 थाली में 5 एमडीए-MB231 दो छह अच्छी तरह से डिश के प्रत्येक अच्छी तरह से में 5HRE करीब ल्यूक वेक्टर व्यक्त कोशिकाओं.
- कोशिकाओं पकवान दीवार रातोंरात ऊष्मायन के बाद संलग्न करने के लिए और फिर hypoxia के अध्ययन के लिए एक hypoxia के चैम्बर (Billups Rothenberg, इंक Del Mar, सीए) में एक डिश को हस्तांतरण करने के लिए, जबकि normoxic हालत (21% हे 2) के तहत अन्य पकवान रखने की अनुमति दें.
- एक गैस सिलेंडर के साथ प्रवेश बंदरगाह टयूबिंग जोड़ने के द्वारा और 0.1% 2 हे के साथ गैस चैम्बर चैम्बर reassemble .
नोट: इस प्रक्रिया के दौरान दोनों Inlet और आउटलेट बंदरगाह clamps खुला होना चाहिए. - बाद चैम्बर purged किया गया है और प्लास्टिक clamps बंद करके सील चैम्बर गैस स्रोत डिस्कनेक्ट.
- 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में चैम्बर रखें .
नोट: चैम्बर humidified हो संस्कृतियों के अत्यधिक वाष्पीकरण रोकने चाहिए. चैम्बर में 20 मिलीलीटर बाँझ पानी - यह 10 रखने के द्वारा पूरा किया जा सकता है.
- Bioluminescence परख:
- 24 घंटा ऊष्मायन के बाद, मध्यम हटाने और कोशिकाओं को बर्फ के ठंडे पीबीएस (2X) के साथ जल्दी से धो.
- Luciferin के 100 μl (गोल्ड जैव प्रौद्योगिकी, सेंट लुइस, MO) के साथ ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- विभिन्न जोखिम बार (1, 30, 60, 180 एस) के साथ बीएल इमेजिंग (IVIS स्पेक्ट्रम प्रणाली, कैलिपर लाइफ साइंसेज, Hopkinton, एमए) मोल.
- प्रत्येक अच्छी तरह लिविंग छवि (कैलिपर लाइफ साइंसेज) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रकाश की तीव्रता का उपाय.
2. एक स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस मॉडल की स्थापना
- MDA-MB231/5HRE-ODD-luc कोशिकाओं की तैयारी
- पुनर्प्राप्त और संस्कृति डी.ई.एम.ई. मध्यम में MDA-MB231/5HRE-ODD-luc कोशिकाओं को 10% FBS, 1% glutamine और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त.
- मध्यम 2-3 दिनों बदलें हर. Tripsinize और कोशिकाओं धो जब वे 80% संगम तक पहुँचने.
- कक्षों की उपयुक्त संख्या की गणना और सीरम मुक्त डी.ई.एम.ई. माध्यम में उन्हें 4 μl मात्रा में एक 10 5 कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता के साथ 25% Matrigel (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, CA) के साथ resuspend.
- बर्फ पर रखें कोशिकाओं intracranial इंजेक्शन से पहले.
- सर्जिकल आरोपण
- महिला नग्न चूहों (/ BALB ग परमाणु / परमाणु, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, Bethesda, एमडी) पुरानी 4-6 सप्ताह में इस अध्ययन में किया जाता है.
- Anesthetize (3 / एक प्रेरण कक्ष में isoflurane O2%, बैक्सटर इंटरनेशनल इंक, Deerfield, IL, संयुक्त राज्य अमेरिका से isoflurane) और ऑक्सीजन (1 डीएम 3 / मिनट) में isoflurane (1%) शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान 3 के साथ पशुओं को बनाए रखने.
- सही पार्श्विका त्वचा और फिर 70% चीरा के लिए पहले शराब betadine के साथ तैयार किया जाना चाहिए.
- एक उच्च गति ड्रिल का प्रयोग, गड़गड़ाहट खोपड़ी, 1mm पूर्वकाल के दाएँ गोलार्द्ध में 1 मिमी राज्याभिषेक सिवनी और 2 मिमी saggital सिवनी के लिए पार्श्व छेद.
- ड्रा 4 μl सेल (10 5 कोशिकाओं) मिश्रण का उपयोग एक 10 μl हैमिल्टन सिरिंज (हैमिल्टन कंपनी, Reno, NV). सही दुम का diencephalon, dura मेटर नीचे 1.5 मिमी एक कस्टम निर्मित 32G हैमिल्टन सुई का उपयोग कर में सीधे कोशिकाओं इंजेक्षन. वापसी से पहले के बारे में 30 एस के लिए जगह में सुई रखें. एक 32G ठीक सुई के प्रयोग के ऊतकों को नुकसान minimizes.
- हड्डी मोम के साथ गड़गड़ाहट छेद भरें और absorbable sutures के साथ खोपड़ी बंद.
- 70% शराब के साथ चीरा क्षेत्र तैयार.
- Buprenorphine analgesia के दो दिनों के लिए हर 12 घंटे लागू करें.
3. स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस में ट्यूमर hypoxia गतिशीलता के vivo bioluminescence इमेजिंग
- अनुदैर्ध्य bioluminescence इमेजिंग आरंभ करें (IVIS स्पेक्ट्रम प्रणाली) दो सप्ताह intracranial आरोपण और 8 के लिए एक सप्ताह में एक बार दोहराने के बाद-10 सप्ताह.
- एक बार में तीन चूहों (3% / एक प्रेरण कक्ष में isoflurane हे 2) anesthetize
- Subcutaneously प्रत्येक माउस की गर्दन क्षेत्र के रूप में विस्तार में 4 पहले से वर्णित में, डी luciferin (गोल्ड जैव प्रौद्योगिकी 120 / 80 μl की कुल मात्रा में मिलीग्राम किलो पीबीएस में) के एक समाधान का प्रशासन.
डी luciferin गैर विषैले है और बरकरार रक्त मस्तिष्क (BBB) बाधा और सेल झिल्ली 3,5 मर्मज्ञ करने में सक्षम होना दिखाया गया है.
- इमेजिंग कक्ष में 3 चूहों प्लेस और इमेजिंग के दौरान ऑक्सीजन (1 डीएम 3 / मिनट) में isoflurane (1%) के साथ रखा.
- Luciferin इंजेक्शन के बाद पांच मिनट, विभिन्न जोखिम समय (1, 30, 60, 180 एस) की एक सरणी के साथ बीएल इमेजिंग अधिग्रहण.
हमारे टिप्पणियों चलता है कि शिखर प्रकाश उत्सर्जन समय luciferin के चमड़े के नीचे प्रशासन के बाद गर्दन 3,4 क्षेत्र में 5 मिनट के बारे में है.
- लिविंग इमेजिंग सॉफ्टवेयर (कैलिपर लाइफ साइंसेज) के साथ ब्याज की एक क्षेत्र में पूर्ण फोटोन मायने रखता है (फोटॉनों /) का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण (आरओआई), मैन्युअल रूप से मस्तिष्क के संकेत BLI रूपरेखा तैयार.
- फोटोन की गिनती के प्लॉट समय बेशक वक्र ट्यूमर hypoxia गतिशीलता संकेत मिलता है.
- पिछले BLI के तुरंत बाद, pimonidazole, hypoxia मार्कर और 1 घंटा बाद प्रशासन, चूहों बलिदान और दिमाग टुकड़े करना. इष्टतम काटना (अक्टूबर) तापमान मध्यम और -80 में फ्रीज ° सी फ्रीजर में पूरे दिमाग एम्बेड. बाद histological Cresyl वायलेट धुंधला हो जाना और luciferase, hypoxia मार्कर pimonidazole के खिलाफ immunohistochemical धुंधला हो जाना, और HIF-1α इमेजिंग टिप्पणियों को मान्य करने के लिए प्रदर्शन किया.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
Fig.1 में दिखाया गया है, काफी अधिक BLI संकेत ट्रांसफ़ेक्ट 24 बजे (1% 2 हे) के लिए hypoxic कक्ष में incubated कोशिकाओं के बाद मनाया गया. कमजोर प्रकाश उत्सर्जन normoxia के तहत नियंत्रण कक्षों से मनाया गया. यह 24 x 3 10 5 कोशिकाओं है, जो कोशिकाओं को एक तनाव संकेत प्रेरित HIF-1α overexpress घंटा संस्कृति के बाद भीड़ सेल की आबादी से परिणाम हो सकता है . बहरहाल, vivo BLI परिणाम में immunohistochemical ट्यूमर hypoxia और luciferase अभिव्यक्ति के बीच colocalization दिखा धुंधला द्वारा मान्य किया गया.
जोखिम बार के एक स्वचालित सरणी छवियों की एक श्रृंखला है, जो अब जोखिम समय के साथ एक कमजोर संकेत का कब्जा की सुविधा और मजबूत संकेतों सीसीडी saturating के बिना एक कम समय का उपयोग के सतत अधिग्रहण के लिए सक्षम बनाता है.
इन विट्रो HIF-1α bioluminescence परख में चित्रा 1 शीर्ष पंक्ति: 3 x 10 5 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc 24 के लिए एक hypoxia के चैम्बर में 6 अच्छी तरह से पकवान की (0.1% 2 हे) की प्रत्येक अच्छी तरह में incubated कोशिकाओं. घंटा मध्यम से पहले हटा दिया था, धोया और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ प्रतिस्थापित. के तुरंत बाद 100 μl luciferin प्रत्येक कुएँ में जोड़ा गया है, BLI जोखिम बार (1, 30, 60, 180 एस) की एक सरणी के साथ अधिग्रहण कर लिया था. मजबूत luminescence प्रतिनिधि कुओं से मनाया गया नीचे पंक्ति: किसी नियंत्रण के रूप में, 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं normoxia की (21% 2 हे) कमजोर प्रकाश उत्सर्जित के तहत incubated.
ट्यूमर hypoxia गतिशीलता के vivo bioluminescence इमेजिंग में चित्रा 2 ए) माउस मस्तिष्क के दाईं ओर से एक कमजोर प्रकाश संकेत MDA-MB231/5HRE-ODD-luc स्तन कैंसर कोशिकाओं के intracranial आरोपण के बाद पहली बार कल्पना 5 हफ्तों था. वृद्धि ऑप्टिकल संकेत अतिरिक्त 6 सप्ताह में मनाया गया, वृद्धि हुई ट्यूमर hypoxia के संकेत बी) साजिश प्रकाश संकेत के मात्रात्मक फोटोन की गिनती के समय बेशक वक्र से पता चला ..
चित्रा luciferase और immunohisto - रासायनिक धुंधला द्वारा पता लगाया hypoxia के Colocaliztion 3. एक जमी माउस स्तन कैंसर MDA-MB231/5HRE-ODD-luc की मेटास्टेसिस अक्टूबर में एम्बेडेड असर मस्तिष्क sectioned था. एक 10 सुक्ष्ममापी hypoxic मार्कर, pimonidazole अनुभाग के साथ immunostained, hypoxia के intratumoral विविधता, जो spatially luciferase विरोधी luciferase धुंधला द्वारा पता लगाया अभिव्यक्ति के साथ सहसंबंधी पाया गया था पता चला. स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस के चतुर्थ चरण में स्तन कैंसर के रोगियों के 30% में होता है. यह उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है और 13 6 महीने के एक औसत अस्तित्व है . वहाँ एक के लिए उपयुक्त पशु मॉडल की जरूरत है इस चिकित्सकीय घातक बीमारी की नकल करने में अपनी intracranial दीक्षा और प्रगति के रूप में अच्छी तरह के रूप में pathophysiological प्रोफाइल के बारे में हमारी समझ को सुविधाजनक बनाने के है. यहाँ, हम सीधे माउस मस्तिष्क में मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन के द्वारा एक orthotopic स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस मॉडल विकसित किया है. हमारे पिछले अनुभवों से पता चला है कि एक radiologically कल्पना (एमआरआई द्वारा) intracranial घाव लगभग 2 सप्ताह के आरोपण के बाद प्रकट होता है. इस प्रत्यक्ष इंजेक्शन मॉडल के लिए वैकल्पिक है, हम हाल ही में एक intracardiac सेल इंजेक्शन चूहों के बाएं वेंट्रिकल में कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के द्वारा एक और orthotopic स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस मॉडल बनाने के दृष्टिकोण को लागू किया है. हालांकि, मस्तिष्क metastases प्रवण स्तन कैंसर की कोशिकाओं के पूर्व चयन करने के लिए इस मॉडल में 7 मल्टी फोकल दिमाग घावों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है . हमने हाल ही में एक ही HRE ल्यूक माउस स्तन कैंसर 4T1 कोशिकाओं है कि intracardiac इंजेक्शन के माध्यम से माउस मस्तिष्क में metastasize कर रहे हैं में निर्माण शुरू किया है.
Bioluminescence इमेजिंग अत्यधिक संवेदनशील और कुशल है, जो प्रतिदीप्ति इमेजिंग के विपरीत, प्रकाश उत्तेजना की जरूरत नहीं है. यह इस अध्ययन में गहरे बैठा ट्यूमर के कृंतक मॉडल में इमेजिंग, उदाहरण के लिए, माउस के intracranial मस्तिष्क ट्यूमर की सुविधा है. एक ही समय में तीन या पाँच चूहों imaged किया जा सकता है. हालांकि, संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए, खासकर जब एक कमजोर संकेत पूरे शरीर की छवि पर देखा गया था, पशु स्थिति सेटिंग कैमरे के करीब आवश्यक हो जाएगा. इस मामले में, केवल एक या दो जानवरों को हर बार imaged किया जा सकता है. BLI की एक सीमा के शरीर रचना विज्ञान के कम स्थानिक संकल्प है, हालांकि tomographic छवियों को उत्पन्न करने के लिए तरीके हैं. सूक्ष्म सीटी या एमआर छवियों के साथ सह - पंजीकरण के लिए ठीक शरीर रचना की पहचान में सहायता करेगा.
व्यापक प्रयासों के लिए गैर इनवेसिव तरीकों को विकसित करने के लिए 8,9 vivo में ट्यूमर hypoxia की निगरानी की मांग की है. कैंसर कोशिकाओं के जीनोम में hypoxia रिपोर्टर जीन को शुरू करके, ट्यूमर hypoxia के विकास के अनुदैर्ध्य निगरानी ऑप्टिकल इमेजिंग 10,11 द्वारा नजर रखी जा सकती है . इसी प्रकार, ट्यूमर hypoxia गतिशीलता इलाज के बाद इस दृष्टिकोण का उपयोग पर नजर रखी जा सकता है.
Luciferase और इसके सब्सट्रेट अलावा में, luciferin ऑक्सीजन, और एटीपी luciferin-luciferase प्रतिक्रिया में अपरिहार्य तत्व प्रकाश का उत्पादन कर रहे हैं. Hypoxic वातावरण में ऑक्सीजन और एटीपी उत्पादन की उपलब्धता काफी सीमित हो सकता है, जो कम प्रकाश उत्सर्जन में परिणाम सकता है हो सकता है. हालांकि, हमारे इन विट्रो BLI परख में पता चला है कि MDA-231/HRE-luc कोशिकाओं काफी अधिक प्रकाश उत्सर्जित के रूप में normoxic हालत में उन लोगों के लिए तुलना hypoxic हालत (<0.1% 2 हे ) के तहत incubated. इसके अलावा, ट्यूमर ऊतकों के immunohistochemical डेटा luciferase अभिव्यक्ति और pimonidazole के बीच एक अच्छा स्थानिक सहसंबंध का पता चला. इन टिप्पणियों को दूसरों के द्वारा पिछले अध्ययनों के साथ अच्छे समझौते में हैं, सुझाव है कि ऑक्सीजन की एकाग्रता और एटीपी कुशल प्रकाश उत्पादन के लिए आवश्यक उनके स्तनधारी कोशिकाओं में रहने वाले पाया स्तर के नीचे अच्छी तरह से कर रहे हैं. हम भी कार्यात्मक एमआरआई दृष्टिकोण, बोल्ड (रक्त ऑक्सीजन का स्तर निर्भर) संयुक्त है और कहा (ऊतक ऑक्सीजन निर्भर स्तर) इस मॉडल में मूल्यांकन ट्यूमर hypoxia के लिए एमआरआई. तुलनात्मक डेटा बहुविध इमेजिंग दृष्टिकोण (अप्रकाशित डेटा) से प्राप्त किया गया है. इसके अलावा, immunohistochemical धुंधला hypoxic ट्यूमर कोशिकाओं और luciferase व्यक्त कोशिकाओं की colocaliztion की पुष्टि की. इलाज के लिए जवाब में आधारभूत ट्यूमर hypoxia और गतिशील परिवर्तन का सटीक आकलन करने के लिए तर्कसंगत चिकित्सकीय संयोजन 12 की अनुमति चाहिए.
अंत में, सस्ता, तेजी से और बेहद संवेदनशील BLI एक उपयोगी उपकरण गैर invasively vivo में ट्यूमर hypoxia गतिशीलता का आकलन किया जा सकता है . जबकि orthotopic मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, कार्यप्रणाली निश्चित रूप से कृन्तकों में गहरे बैठा orthotopic ट्यूमर के अन्य प्रकारों के लिए लागू किया जा सकता सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन में भाग DOD स्तन कैंसर आईडिया पुरस्कार द्वारा समर्थित है W81XWH-08-1-0583 और NIH / CA141348 01A1 NCI (DZ) और FAMRI नैदानिक वैज्ञानिक पुरस्कार (डी एस). इमेजिंग बुनियादी ढांचे पश्चिमी छोटे पशु इमेजिंग अनुसंधान CA126608 U24 और सीमन्स कैंसर केंद्र (CA142543 p30) और NIH 1S10RR024757 01 द्वारा भाग में समर्थित प्रोग्राम द्वारा प्रदान की गई है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | L-123 | 120 mg/kg in PBS in a total volume of 80 μl for in vivo study |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 1701 | |
| 32G Hamilton needle | Hamilton Co | 7803-04 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| Bioluminescence imaging system | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum system | |
| G418 | Fisher Scientific | SV3006901 |
References
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