Summary
Biolumineszenz-Bildgebung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α Aktivität wird angewandt, um intrakranielle Tumorhypoxie Entwicklung in einer Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell zu überwachen.
Abstract
Es ist allgemein anerkannt, dass Tumor-Hypoxie eine wichtige Rolle bei der Förderung der malignen Progression und beeinflussen therapeutische Reaktion negativ spielt. Es gibt wenig Wissen über in situ, in vivo, Tumor-Hypoxie während intrakranieller Entwicklung von bösartigen Hirntumoren wegen des Mangels an effizienten Mitteln, um es in diesen tief sitzenden Tumoren orthotopen überwachen. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), auf der Detektion von Licht durch lebende Zellen, die ein Luciferase-Gen emittiert basiert, wurde schnell für die Krebsforschung hat, insbesondere, um das Tumorwachstum oder Tumorgröße Veränderungen in Reaktion auf die Behandlung in präklinischen Tierstudien zu bewerten. Darüber hinaus durch die Expression eines Reportergens unter der Kontrolle einer Promotorsequenz kann die Genexpression nicht-invasiv durch BLI überwacht werden. Unter hypoxischen Stress, signalisieren Reaktionen hauptsächlich über die Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α (HIF-1α) vermittelt, um die Transkription verschiedener Gene zu fahren. Deshalb haben wir eine HIF-1α Reporter-Konstrukt, 5HRE-ODD-luc, stabil in menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB231-Zellen (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In-vitro-HIF-1α Biolumineszenzassay ist durchgeführt transfizierten verwendet Inkubation der transfizierten Zellen in einer hypoxischen Kammer (0,1% O 2) für 24 Stunden vor dem BLI, während die Zellen in Normoxie (21% O 2) als Kontrolle dienen. Deutlich höhere Photonenfluss für die Zellen unter Hypoxie beobachtet schlägt eine erhöhte HIF-1α Bindung an seinen Promotor (HRE Elemente), wie diese in Normoxie verglichen. Die Zellen werden direkt in das Gehirn der Maus injiziert, um eine Brustkrebs Hirnmetastasen Modell zu etablieren. In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamik ausgelöst wird 2 Wochen nach der Implantation und wiederholte einmal pro Woche. BLI zeigt zunehmende Licht Signale aus dem Gehirn, da der Tumor fortschreitet, was darauf hinweist erhöhten intrakraniellen Tumor Hypoxie. Histologische und immunhistochemische Untersuchungen werden verwendet, um die in-vivo-Bildgebung Ergebnisse zu bestätigen. Hier werden wir Ansätze von In-vitro-HIF-1α Biolumineszenzassay, chirurgische Einrichtung einer Brustkrebs Hirnmetastasen in einer Nacktmaus und Anwendung von In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung zur intrakraniellen Tumorhypoxie Monitor vorstellen.
Protocol
Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of Texas Southwestern Medical Center genehmigt.
1. In-vitro-HIF-1α Biolumineszenzassay
- Materialien und Methoden:
- Menschliche metastasierendem Brustkrebs-Zelllinie MDA-MB231 mit einem neuartigen HIF-1-abhängigen Reportergen transfiziert wurde 5HRE-ODD-luc durch Dr. Harada generiert.
- In hypoxischen Zustand ist die verstärkte Expression von Sauerstoff-abhängigen Abbau Domain (ODD)-Luciferase-Fusionsprotein von 5 Exemplare von Hypoxie-Response-Element (5HRE) angetrieben. Die Anwesenheit von ODD bewirkt, dass der Abbau von ODD-Luc resultierende Protein in extrem niedrigen Hintergrund Luciferaseaktivität in normoxischen Bedingungen. Daher kann dieses neue System verwendet, um hypoxische Regionen eines Tumors durch Echtzeit-Bildgebung zu erkennen. Der Bau dieser 5HRE-ODD-luc Expressionsvektor wurde von Harada et al 1,2 berichtet worden.
- Kultur-Zellen unter Normoxie oder Hypoxie:
- Pflegen Sie die rekombinante MDA-MB231-Zellen in 10% fötalem Rinderserum (FBS)-DMEM-Medium mit 1% Glutamin, Antibiotika von 400 pg / ml G418 und 1% Penicillin / Streptomycin.
- Für die in vitro HIF-1α Biolumineszenzassay, Platte 3 x 10 5 MDA-MB231-Zellen, die 5HRE-ODD-luc-Vektor in jede Vertiefung von zwei sechs gut Schüssel.
- Lassen Sie Zellen in die Schale Wand nach Inkubation über Nacht befestigen und dann übertragen ein Gericht in eine Hypoxie Kammer (Billups-Rothenberg, Inc. Del Mar, CA) für Hypoxie-Studien, während die übrigen Gericht unter normoxischen Bedingungen (21% O 2).
- Montieren Sie die Kammer und Gas der Kammer mit 0,1% O 2, indem Sie den Einlass-Schlauch mit einer Gasflasche.
Hinweis: Sowohl Ein-und Auslass-Anschluss Klemmen muss während dieser Verhandlung zu eröffnen. - Trennen Gasquelle nach Kammer wurde gespült und Dichtungsraum durch Schließen Kunststoffklammern.
- Setzen Sie die Kammer in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2.
Hinweis: Die Kammer muss befeuchtet werden, um übermäßige Verdunstung der Kulturen zu verhindern. 20 ml steriles Wasser in die Kammer - Dies kann, indem 10 erreicht werden.
- Biolumineszenz-Assay:
- Nach 24 Stunden Inkubationszeit, entfernen Sie das Medium und die Zellen schnell mit eiskaltem PBS (2X).
- 1 ml kaltem PBS mit 100 ul Luciferin (Gold Biotechnologie, St Louis, MO).
- Erwerben BL-Tomographie (IVIS Spectrum System Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) mit verschiedenen Belichtungszeiten (1, 30, 60, 180 s).
- Messen Sie die Lichtintensität in jedem gut mit dem Leben Image Software (Caliper Life Sciences).
2. Einrichtung einer Brustkrebs Hirnmetastasen Modell
- Vorbereitung der MDA-MB231/5HRE-ODD-luc Zellen
- Abrufen und Kultur der MDA-MB231/5HRE-ODD-luc Zellen in DEME-Medium mit 10% FBS, 1% Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin.
- Ersetzen Medium alle 2-3 Tage. Tripsinize und waschen Sie die Zellen, wenn sie 80% Konfluenz erreichen.
- Graf entsprechende Anzahl von Zellen und resuspendieren sie in serumfreien Medium DEME mit 25% Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) mit einer Endkonzentration von 10 5 Zellen in 4 ul Volumen.
- Legen Zellen auf Eis vor intrakranielle Injektion.
- Chirurgische Implantation
- Weiblicher Akt Mäusen (BALB / c nu / nu; National Cancer Institute, Bethesda, MD) bei 4-6 Wochen alt sind in dieser Studie verwendet.
- Anesthetize (3% Isofluran / O2 in einer Induktion Kammer; Isofluran von Baxter International Inc., Deerfield, IL, USA) und pflegen die Tiere mit Isofluran (1%) in Sauerstoff (1 dm 3 / min) während des chirurgischen Verfahren 3.
- Die rechte parietal Haut sollte mit betadine und dann 70% igem Alkohol vor Einschnitt vorbereitet werden.
- Mit einem High-Speed-Bohrer, Fräse ein 1 mm Loch in der rechten Hemisphäre des Schädels, 1mm anterior der Kranznaht und 2 mm lateral saggital Naht.
- Draw 4 ul Zellgemisch (10 5 Zellen) mit einem 10 ul Hamilton-Spritze (Hamilton Company, Reno, NV). Spritzen Sie die Zellen direkt in die rechte kaudale Zwischenhirn, 1,5 mm unter der Dura mater mit einem maßgeschneiderten 32G Hamilton Nadel. Halten Sie die Nadel in Platz für ca. 30 s vor dem Rückzug. Die Nutzung eines 32G feinen Nadel minimiert Gewebeschäden.
- Füllen Sie das Bohrloch mit Knochenwachs und in der Nähe der Kopfhaut mit resorbierbaren Fäden.
- Bereiten Sie den Schnitt Region mit 70% Alkohol.
- Bewerben Buprenorphin Analgesie alle 12 Stunden für zwei Tage.
3. In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamik bei Brustkrebs Hirnmetastasen
- Initiieren Längs-Biolumineszenz-Bildgebung (IVIS Spectrum System) zwei Wochen nach intrakraniellen Implantation und wiederholen Sie einmal in der Woche für 8-10 Wochen.
- Anesthetize drei Mäusen zu einer Zeit (3% Isofluran / O 2 in einer Induktion Kammer)
- Verwalten einer Lösung von D-Luciferin (120 mg / kg in PBS in einem Gesamtvolumen von 80 ul; Gold-Biotechnologie) subkutan im Halsbereich jeder Maus, wie im Detail beschrieben bisher 4.
D-Luciferin ist ungiftig und hat sich gezeigt, dass zu durchdringen vermag intakte Blut-Hirn-Schranke (BHS) und Zellmembranen 3,5.
- Legen Sie die 3 Mäuse in der Imaging-Kammer und gepflegt mit Isofluran (1%) in Sauerstoff (1 dm 3 / min) während der Bildgebung.
- Fünf Minuten nach Injektion Luciferin, erwerben BL Bildgebung mit einer Reihe von verschiedenen Belichtungszeiten (1, 30, 60, 180 s).
Unsere Beobachtungen zeigen, dass die Peak-Lichtemission ca. 5 Minuten nach subkutaner Verabreichung von Luciferin im Halsbereich 3,4 ist.
- Analysieren von Daten mit dem lebendigen Imaging-Software (Caliper Life Sciences), indem Sie absolute Photonen (Photonen / s) in einer Region of Interest (ROI), manuell gezogen, um die BLI-Signal des Gehirns zu skizzieren.
- Plot Zeitverlauf Kurve der Photonen, um anzuzeigen, Tumorhypoxie Dynamik.
- Unmittelbar nach dem letzten BLI, verwalten pimonidazole, die Hypoxie-Marker und 1 Stunde später, opfern die Mäuse und sezieren die Gehirne. Embed das ganze Gehirn in Optimal Cutting Temperature (OCT) mittel-und frieren in -80 ° C Gefrierschrank. Nachfolgende histologische Kresylviolett-Färbung und die immunhistochemische Färbung gegen Luciferase, Hypoxie-Marker pimonidazole und HIF-1α durchgeführt, um Imaging-Beobachtungen bestätigen.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Wie in Abb. 1 dargestellt, war signifikant höher BLI-Signal nach der transfizierten Zellen in der hypoxischen Kammer (1% O 2) für 24 Stunden inkubiert beobachtet. Schwache Lichtemission aus dem Kontroll-Zellen unter Normoxie beobachtet. Dies kann aus der überfüllten Zelle Bevölkerung nach 24 Stunden Kultur der 3 x 10 5 Zellen, die einen Stress-Signal zu den Zellen induziert HIF-1α überexprimieren führen. Dennoch wurden in vivo BLI Ergebnisse durch immunhistochemische Färbung zeigt Kolokalisation zwischen Tumor Hypoxie und Luciferaseexpression validiert.
Eine automatisierte Auswahl an Belichtungszeiten ermöglicht eine kontinuierliche Akquisitionen von einer Reihe von Bildern, die Erfassung von einem schwachen Signal erleichtert durch längere Belichtungszeit, und starke Signale mit einer kürzeren Zeit ohne Sättigung des CCD.
Abbildung 1 In-vitro-HIF-1α Biolumineszenzassay Obere Reihe:. 3 x 10 5 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc Zellen in jeder Vertiefung einer 6-well-Schale in einer Hypoxie Kammer (0,1% O 2) für 24 inkubiert hr, bevor das Medium entfernt, gewaschen und ersetzt mit 1 ml PBS. Unmittelbar nach 100 ul Luciferin in jedes Well zugegeben wurde BLI mit einer Reihe von Belichtungszeiten (1, 30, 60, 180 s) erworben. Starke Lumineszenz wurde von repräsentativen Brunnen beobachtet Untere Reihe:. Als eine Kontrolle, 3 x 10 5 Zellen unter Normoxie (21% O 2) emittiert schwachem Licht inkubiert.
Abbildung 2 In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamik. A) Eine schwache Lichtsignal von der rechten Maus-Gehirn wurde erstmals visualisiert 5 Wochen nach der intrakraniellen Implantation MDA-MB231/5HRE-ODD-luc Brustkrebszellen. Erhöhte optisches Signal wurde über weitere 6 Wochen beobachtet, was auf erhöhte Tumor-Hypoxie. B) Die Handlung des zeitlichen Verlaufs Kurve quantitative Photonen des Lichts Signal zeigten.
Abbildung 3 Colocaliztion von Luciferase und Hypoxie durch immunhistochemische Färbung nachgewiesen. Eine gefrorene Gehirn der Maus trägt eine Metastase des Brustkrebses MDA-MB231/5HRE-ODD-luc in OCT eingebettet wurde geschnitten. A 10 pm Abschnitt immungefärbt mit hypoxischen Marker, pimonidazole zeigte intratumoralen Heterogenität der Hypoxie, die gefunden räumlich korrelieren mit Luciferase-Expression durch anti-Luciferase Färbung erkannt wurde. Scale-bar, 100 um.
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Discussion
Brustkrebs Hirnmetastasen tritt in 30% der Patientinnen mit Brustkrebs im Stadium IV. Es ist mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden und hat eine mediane Überlebenszeit von 13 Monaten 6. Es besteht ein Bedarf an geeigneten Tiermodellen für diese klinisch verheerenden Krankheit vortäuschen, um unser Verständnis der intrakraniellen Initiation und Progression sowie pathophysiologischen Profilen zu erleichtern. Hier haben wir einen orthotopen Brustkrebs Hirnmetastasen Modell durch die Injektion von menschlichen Brustkrebszellen, direkt in der Maus Gehirn entwickelt. Unsere bisherigen Erfahrungen haben gezeigt, dass eine radiologisch sichtbar gemacht (durch MRT) intrakraniellen Läsion ca. 2 Wochen nach der Implantation erscheint. Alternative zu diesem Direkteinspritzung Modell haben wir kürzlich eine intrakardiale Zellinjektion Ansatz zu einem anderen orthotopen Brustkrebs Hirnmetastasen Modell durch die Injektion von Krebszellen in den linken Ventrikel der Mäuse zu schaffen umgesetzt. Allerdings ist Pre-Selection von Hirnmetastasen-anfällig Brustkrebszellen notwendig, multifokale Läsionen im Gehirn in diesem Modell 7 zu erreichen. Wir haben vor kurzem die gleiche HRE-luc in die Maus Brustkrebs 4T1 Zellen, die in der Lage, in Maus-Gehirn über intrakardiale Injektion metastasieren konstruieren eingeführt.
Biolumineszenz-Bildgebung ist sehr sensibel und effizient, die im Gegensatz zu Fluoreszenz-Imaging, braucht nicht Lichtanregung. Dies erleichtert die Bildgebung von tiefliegenden Tumoren in Tiermodellen, z. B. das intrakraniellen Hirntumoren von Mäusen in dieser Studie. Drei oder sogar fünf Mäuse können gleichzeitig abgebildet werden. Um jedoch einen Anstieg der Empfindlichkeit vor allem, wenn ein schwaches Signal auf den ganzen Körper Bild zu sehen war, das Tier Position näher an der Kamera notwendig sein wird. In diesem Fall kann nur ein oder zwei Tiere jedes Mal abgebildet werden. Eine Einschränkung von BLI ist geringer räumlicher Auflösung der Anatomie, obwohl es Methoden, um tomographische Bilder zu erzeugen. Co-Registrierung mit Mikro-CT-oder MR-Bilder würden helfen, zur Identifizierung der Anatomie.
Umfangreiche Bemühungen wurden gesucht, um nicht-invasive Ansätze zu entwickeln, um Tumor-Hypoxie in vivo 8,9 überwachen. Durch die Einführung einer Hypoxie Reportergens in das Genom der Krebszellen können Längs-Überwachung Tumorhypoxie Evolution durch optische Bildgebung 10,11 überwacht werden. Ebenso können Tumorhypoxie Dynamik nach der Behandlung überwacht mit Hilfe dieses Ansatzes sein.
Neben Luciferase und ihr Substrat, sind Luciferin, Sauerstoff und ATP unverzichtbare Elemente in der Luciferin-Luciferase-Reaktion auf Licht zu erzeugen. In hypoxischen Umgebung, kann die Verfügbarkeit von Sauerstoff und ATP-Produktion werden deutlich eingeschränkt, was zu reduzierten Lichtemission. Aber unsere in vitro-Assay BLI zeigten, dass die MDA-231/HRE-luc Zellen unter hypoxischen Bedingungen (<0,1% O 2) deutlich mehr Licht, abgestrahlt, um diesen in normoxischen Zustand verglichen inkubiert. Darüber hinaus zeigte die immunhistochemische Daten von Tumorgewebe eine gute räumliche Korrelation zwischen Luciferaseexpression und pimonidazole. Diese Beobachtungen sind in guter Übereinstimmung mit früheren Studien von anderen, was darauf hindeutet, dass die Sauerstoffkonzentration und ATP für die effiziente Lichterzeugung benötigt deutlich unter dem Niveau lebenden Säugerzellen gefunden werden. Wir haben auch funktionelle MRT Ansätze, BOLD (Blood Oxygen Level Dependent) kombiniert und sagte (tissue Oxygen Level Dependent) MRI ausgewertet Tumorhypoxie in diesem Modell. Vergleichbare Daten wurden von der multimodalen Bildgebung Ansätze (unveröffentlichte Daten) gewonnen worden. Darüber hinaus bestätigte immunhistochemische Färbung colocaliztion von hypoxischen Tumorzellen und Luciferase exprimierenden Zellen. Genaue Einschätzung der Grundlinie Tumorhypoxie und die dynamischen Veränderungen in Reaktion auf die Behandlung sollte rational therapeutische Kombination 12 zu ermöglichen.
Zusammenfassend kann die kostengünstige, schnelle und hochsensitive BLI ein nützliches Werkzeug, um nicht-invasiv zu beurteilen Tumorhypoxie Dynamik in vivo werden. Während der orthotopen Gehirn-Tumor-Modell hat in dieser Studie verwendet wurde, kann die Methode sicherlich für andere Arten von tief sitzenden Tumoren orthotopen in Nagetieren angewandt werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie ist Teil von DOD Breast Cancer IDEA Award unterstützt W81XWH-08-1 bis 0583 und NIH / NCI CA141348-01A1 (DZ) und FAMRI klinischen Scientist Award (DS). Imaging-Infrastruktur wird durch Southwestern Small Animal Imaging Research Program zum Teil durch U24 CA126608 und Simmons Cancer Center (P30 CA142543) und NIH 1S10RR024757-01 unterstützt werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | L-123 | 120 mg/kg in PBS in a total volume of 80 μl for in vivo study |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 1701 | |
| 32G Hamilton needle | Hamilton Co | 7803-04 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| Bioluminescence imaging system | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum system | |
| G418 | Fisher Scientific | SV3006901 |
References
- Harada, H. The combination of hypoxia-response enhancers and an oxygen-dependent proteolytic motif enables real-time imaging of absolute HIF-1 activity in tumor xenografts. Biochem Biophys Res Commun. 360, 791-796 (2007).
- Ou, G. Usefulness of HIF-1 imaging for determining optimal timing of combining bevacizumab and radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75, 463-467 (2009).
- Zhou, H. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, e8051-e8051 (2009).
- Contero, A., Richer, E., Gondim, A., Mason, R. P. High-throughput quantitative bioluminescence imaging for assessing tumor burden. Methods Mol Biol. 574, 37-45 (2009).
- Zhao, D., Richer, E., Antich, P. P., Mason, R. P. Antivascular effects of combretastatin A4 phosphate in breast cancer xenograft assessed using dynamic bioluminescence imaging and confirmed by MRI. FASEB J. 22, 2245-2451 (2008).
- Chang, E. L., Lo, S. Diagnosis and management of central nervous system metastases from breast cancer. Oncologist. 8, 398-410 (2003).
- Palmieri, D. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clin Cancer Res. 15, 6148-6157 (2009).
- Mason, R. P. Multimodality imaging of hypoxia in preclinical settings. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54, 259-280 (2010).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Moeller, B. J. Pleiotropic effects of HIF-1 blockade on tumor radiosensitivity. Cancer Cell. 8, 99-110 (2005).
- Lu, X. In vivo dynamics and distinct functions of hypoxia in primary tumor growth and organotropic metastasis of breast cancer. Cancer Res. 70, 3905-3914 (2010).
- Zhao, D., Chang, C. H., Kim, J. G., Liu, H., Mason, R. P. In vivo Near-Infrared Spectroscopy and Magnetic Resonance Imaging Monitoring of Tumor Response to Combretastatin A-4-Phosphate Correlated With Therapeutic Outcome. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 80, 574-581 (2011).
