Summary
Биолюминесценция визуализации гипоксии индуцируемый фактор-1α деятельности применяется для контроля внутричерепного развития опухоли гипоксии мозга рака молочной железы мыши модель метастазов.
Abstract
Хорошо известно, что опухолевые гипоксия играет важную роль в развитии злокачественных прогрессии и влияющие терапевтический ответ отрицательно. Существует мало знают о на месте, в естественных условиях, опухоли гипоксии при внутричерепной развития злокачественных опухолей головного мозга из-за отсутствия эффективных средств для контроля его в этих глубинных ортотопической опухоли. Биолюминесценция томография (BLI), основанный на обнаружении света, излучаемого жизни клеток, экспрессирующих ген люциферазы, был быстро принят для исследования рака, в частности, для оценки роста опухоли или опухоли изменения размера в ответ на лечение в доклинических исследованиях на животных. Более того, выражая ген репортер под контролем промотора, конкретное выражение гена можно контролировать неинвазивным путем BLI. Под гипоксического стресса, сигнализации ответы опосредованы основном через гипоксии индуцируемый фактор-1α (HIF-1α) для управления транскрипции различных генов. Поэтому мы использовали HIF-1α репортер построить, 5HRE-ODD-Люк, стабильно трансфицированных в человеческий рака молочной железы MDA-MB231 клеток (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). Экстракорпоральное HIF-1α биолюминесценции анализа осуществляется инкубации трансфекции клеток в гипоксической камере (0,1% O 2) в течение 24 часов, прежде чем BLI, в то время как клетки в нормоксии (21% O 2) служить в качестве контроля. Значительно более высокая потока фотонов наблюдается клетки в условиях гипоксии предлагает увеличить HIF-1α привязки к его промотор (HRE элементов), по сравнению с теми в нормоксии. Клетки вводят непосредственно в мозг мыши, чтобы установить мозга метастазами рака молочной железы модели. В естественных изображений биолюминесценции опухолевых динамики гипоксии инициируется 2 недель после имплантации и повторяется один раз в неделю. BLI показывает увеличение световые сигналы из мозга, как опухоль прогрессирует, что указывает на повышение внутричерепного гипоксии опухоли. Гистологическое и иммуногистохимическое исследования используются для подтверждения результатов в естественных изображений. Здесь мы познакомим подходы в пробирке HIF-1α биолюминесценции анализа, хирургическое создание мозга рак молочной железы метастазы в обнаженном мыши и применение в естественных изображений биолюминесценции для контроля внутричерепного гипоксии опухоли.
Protocol
Все животные процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Университета Техаса Юго-западного медицинского центра.
1. В пробирке HIF-1α биолюминесценции анализа
- Материалы и методы:
- Человек метастатическим раком молочной железы клеточной линии MDA-MB231, трансфицированных роман HIF-1-зависимого гена-репортера, 5HRE-ODD-Люк был сгенерирован Доктор Харада.
- В гипоксического состояния, повышенной экспрессии кислородно-зависимой деградации домена (ODD)-люциферазы слитого белка обусловлена 5 экземпляров гипоксии-ответ элемент (5HRE). Наличие оптического причины деградации ODD-Люк белка приводит к крайне низкой активности люциферазы фон в гипоксическим условиям. Таким образом, эта новая система может быть использован для обнаружения гипоксических регионов в опухоли реальными изображениями времени. Строительство этого 5HRE-ODD-Люк вектора экспрессии, как сообщается на 1,2 Харада и соавт.
- Культуры клеток под нормоксии или гипоксии:
- Поддерживать рекомбинантный MDA-MB231 клеток в 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)-DMEM среде, содержащей 1% глютамина, антибиотиков 400 мкг / мл G418 и 1% пенициллина / стрептомицина.
- Для в пробирке HIF-1α биолюминесценции анализа, плиты 3 х 10 5 MDA-MB231 клеток, экспрессирующих 5HRE-ODD-Люк вектора в каждой лунке двух шесть хорошо блюдо.
- Разрешить клеткам придают блюду стены после инкубации в течение ночи, а затем передать одно блюдо в камере гипоксии (Биллапс-Ротенберг, Inc Дель Мар, Калифорния) для гипоксии исследования, в то время держать другое блюдо под гипоксическим условия (21% O 2).
- Соберите камеры и газовые камеры с 0,1% O 2, соединяя впускной трубы порт с газовой камерой.
Примечание: Оба входе и выходе зажимы порт должен быть открыт во время этой процедуры. - Отключите источник газа после камеры были очищены и уплотнительной камеры, закрыв пластиковых зажимов.
- Место камеры в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
Примечание: камера должна быть увлажненной, чтобы предотвратить чрезмерное испарение культур. Это может быть достигнуто путем размещения 10 - 20 мл стерильной воды в камере.
- Биолюминесценция анализа:
- После 24 ч инкубации удалить средних и мыть клетки быстро с ледяной PBS (2х).
- Добавьте 1 мл холодного PBS 100 мкл люциферин (Gold биотехнологии, Сент-Луис, Миссури).
- Приобретать BL томография (ИВИС спектра системы, суппорт Life Sciences, Хопкинтон, MA) с различными время экспозиции (1, 30, 60, 180 сек).
- Мера интенсивности света в каждую лунку с помощью программного обеспечения Жизнь изображения (суппорт Life Sciences).
2. Создание мозга груди модель метастазов рака
- Подготовка MDA-MB231/5HRE-ODD-luc клетки
- Получить и культуры MDA-MB231/5HRE-ODD-luc клеток в ДЕМЕ среде, содержащей 10% FBS, 1 глютамин% и 1% пенициллина / стрептомицина.
- Замените среду каждые 2-3 дня. Tripsinize и промыть клетки, когда они достигают 80% слияния.
- Граф соответствующее число клеток и их ресуспендируют в бессывороточной среде ДЕМЕ с 25% Матригель (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) с конечной концентрации 10 5 клеток в 4 мкл.
- Место клетки на льду до внутричерепных инъекций.
- Хирургическая имплантация
- Женский безволосых мышей (BALB / с ню / ню, Национальный институт рака, Bethesda, MD) на 4-6 недель используются в данном исследовании.
- Обезболить (3% изофлуран / O2 в индукционной камере; изофлуран от Baxter International Inc, Дирфилд, штат Иллинойс, США) и сохранить животных с изофлуран (1%) в кислороде (1 дм 3 / мин) во время хирургического вмешательства 3.
- Право кожи теменной должны быть нацелен с бетадин, а затем 70% спиртом до разреза.
- Использование высокоскоростных дрель, заусенцев 1 мм отверстие в правом полушарии черепа, 1 мм кпереди от венечного шва и 2 мм латеральнее сагиттального шва.
- Draw 4 мкл смеси ячейки (10 5 клеток), используя 10 мкл Hamilton шприца (Hamilton компании, Рино, штат Невада). Inject клеток непосредственно в правый хвостовой промежуточного мозга, 1,5 мм под твердую мозговую оболочку использованием заказных 32G Гамильтон иглы. Держите иглу на месте в течение примерно 30 секунд до выхода. Использование тонкой иглой 32G сводит к минимуму повреждение тканей.
- Заполните отверстие заусенцев с костью воска и закрыть головы с рассасывающиеся нити.
- Подготовка разрез региона с 70% спиртом.
- Применение бупренорфина обезболивания каждые 12 часов в течение двух дней.
3. В естественных изображений биолюминесценции опухолевой гипоксии динамика в груди метастазы рака мозга
- Инициировать продольных изображений биолюминесценции (ИВИС спектра системы) через две недели после имплантации внутричерепных и повторять раз в неделю в течение 8-10 Недель.
- Обезболить три мыши на время (3% изофлуран / O 2 в индукции камеры)
- Администрирование решение D-люциферин (120 мг / кг в PBS в общем объеме 80 мкл; Золотая биотехнологии) подкожно в область шеи каждой мыши, как подробно описано ранее 4.
D-люциферин не токсичен и было показано, что способны проникать нетронутыми гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и клеточных мембран 3,5.
- Место 3 мышей в камеру изображения и поддерживать с изофлуран (1%) в кислороде (1 дм 3 / мин) во время съемки.
- Через пять минут после инъекции люциферин, приобретать BL изображений с множеством различных времени экспозиции (1, 30, 60, 180 сек).
Наши наблюдения показывают, что пик светлое время выбросов составляет около 5 минут после подкожного введения люциферин в области шеи 3,4.
- Анализ данных с помощью программного обеспечения Жизнь Imaging (суппорт науки о жизни) с помощью абсолютного фотоотсчетов (фотонов / с) в области интереса (ROI), вручную обращено наброски BLI сигнала головного мозга.
- Участок время курс кривой фотоотсчетов, чтобы указать, опухоли динамики гипоксии.
- Сразу же после последнего BLI, администрирования pimonidazole, гипоксия маркер и 1 час позже, жертву мышей и препарировать мозг. Добавить целом мозги в оптимальной температуры резки (октябрь) средние и заморозить в -80 ° C морозильнике. Последующее гистологическое окрашивание крезиловый фиолетовый и иммуногистохимического окрашивания против люциферазы, гипоксия маркер pimonidazole и HIF-1α производится для проверки изображений наблюдений.
4. Представитель результаты:
Как показано на рисунке 1, что значительно выше BLI сигнала наблюдалось после трансфекции клетки инкубировали в гипоксической камере (1% O 2) в течение 24 часов. Слабое свечение наблюдалось из-под контроля клеток под нормоксии. Это может быть результатом переполненных популяции клеток через 24 ч культуры 3 х 10 5 клеток, которые индуцированной стрессом сигнал к клеткам гиперэкспрессией HIF-1α. Тем не менее, в естественных результатах BLI были подтверждены иммуногистохимического окрашивания показывает колокализации между опухолевой гипоксии и люциферазы выражения.
Автоматизированные массив экспозиции обеспечивает непрерывную приобретения серии изображений, что облегчает захват слабого сигнала путем увеличения выдержки, а сильные сигналы, используя более короткие сроки без насыщения ПЗС.
Рисунок 1 В пробирке HIF-1α биолюминесценции анализа Верхний ряд:. 3 х 10 5 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc клетки инкубировали в каждую лунку 6-хорошо блюдо в камере гипоксии (0,1% O 2) в течение 24 часа до среду удаляли, промывали и заменяли 1 мл PBS. Сразу же после 100 мкл люциферин был добавлен в каждую лунку, BLI был приобретен с массивом выдержек (1, 30, 60, 180 сек). Сильные люминесценции наблюдался с представителем скважин Нижний ряд:. В качестве контроля, 3 х 10 5 клеток инкубировали при нормоксии (21% O 2), испускаемых слабый свет.
Рисунок 2 В естественных изображений биолюминесценции опухолевых динамики гипоксии.) Слабый сигнал свет от правой стороны мозга мыши была впервые визуализируется через 5 недель после имплантации внутричерепных MDA-MB231/5HRE-ODD-luc клеток рака молочной железы. Увеличение оптического сигнала наблюдалось в течение еще 6 недель, что указывает на увеличение опухоли гипоксии. B) показали сюжет кривой времени хода количественных фотоотсчетов светового сигнала.
Рисунок 3 Colocaliztion люциферазы и гипоксии обнаружено immunohisto-химического окрашивания. Замороженного мозга мыши подшипников метастазов рака молочной железы MDA-MB231/5HRE-ODD-luc встроенные в октябре была разделена. 10 мкм разделе immunostained с гипоксически маркер, pimonidazole, показал неоднородность внутриопухолевые гипоксии, которая коррелирует с пространственно люциферазы выражение обнаружены анти-люциферазы окрашивания. Шкала бар, 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рак молочной железы метастазы в головной мозг возникает у 30% больных раком молочной железы на стадии IV. Это связано с высокой заболеваемостью и смертностью и медиана выживаемости 13 месяцев 6. Существует необходимость иметь соответствующие модели на животных, чтобы имитировать эту клинически разрушительной болезни для того, чтобы облегчить наше понимание его внутричерепного инициации и прогрессии, а также патофизиологических профилей. Здесь, мы разработали ортотопической рак молочной железы метастазы в головной мозг модель, вводя человека клеток рака молочной железы, непосредственно в мозг мыши. Наш предыдущий опыт показывает, что радиологически визуализируются (МРТ), внутричерепные поражения появляется примерно через 2 недели после имплантации. Альтернативой этой модели прямого впрыска, мы недавно реализован подход внутрисердечной инъекции ячейки для создания еще одной ортотопической рак молочной железы метастазы в головной мозг модели путем введения опухолевых клеток в левый желудочек мышей. Тем не менее, предварительный отбор метастазами в головной мозг подверженных клеток рака молочной железы является необходимым для достижения нескольких очаговых поражений мозга в этой модели 7. Мы недавно ввели же HRE-Люк построить на рак молочной железы мыши 4T1 клеток, которые способны метастазировать в мозг мыши с помощью инъекции внутрисердечной.
Биолюминесценция изображений обладает высокой чувствительностью и эффективным, что, в отличие от флуоресценции, не нуждается в свете возбуждения. Это облегчает съемку глубинных опухолей у грызунов моделей, например, внутричерепные опухоли головного мозга мышей в этом исследовании. Три или даже пять мышей могут быть отображены в то же время. Однако, для повышения чувствительности особенно когда слабый сигнал был замечен на все изображение тела, устанавливая животное позицию ближе к камере будет необходимо. В этом случае, только один или два животных могут быть отображены для каждого времени. Одним из ограничений BLI является низкое пространственное разрешение анатомии хотя Есть методы для генерации томографических изображений. Сотрудничество регистрации с микро-КТ или МРТ изображений поможет правильно определить анатомию.
Обширные усилия были стремились разработать неинвазивные подходы для мониторинга опухолей в естественных условиях гипоксии 8,9. Вводя гипоксии гена-репортера в геном раковых клеток, продольный мониторинг эволюции опухоли гипоксии можно контролировать с помощью оптических изображений 10,11. Кроме того, опухоль гипоксия динамика после лечения можно контролировать с помощью этого подхода.
В дополнение к люциферазы и ее субстратом, люциферин, кислорода и АТФ являются необходимыми элементами в люциферин-люциферазы реакции, чтобы произвести свет. В гипоксических окружающей среды, наличие кислорода и АТФ могут быть значительно ограничены, что может привести к снижению выбросов света. Тем не менее, наши в анализе пробирке BLI показали, что клетки инкубировали MDA-231/HRE-luc под гипоксического состояния (<0,1% O 2) испускается значительно больше света, по сравнению с теми в гипоксическим состоянии. Более того, иммуногистохимических данных опухолевых тканей показало хорошие пространственной корреляции между люциферазы выражения и pimonidazole. Эти наблюдения находятся в хорошем согласии с предыдущими исследованиями, другие, предполагая, что концентрация кислорода и АТФ, необходимые для эффективного производства света намного ниже их уровня обнаружили в живых клетках млекопитающих. У нас есть также комбинированные подходы функциональной МРТ, ЖИРНЫЙ (уровень кислорода в крови зависит) и рассказал (ткани кислорода зависимых) МРТ для оценки опухолевой гипоксии в этой модели. Сопоставимые данные были получены из мультимодальных подходов томография (неопубликованные данные). Более того, иммуногистохимического окрашивания подтвердил colocaliztion гипоксических опухолевых клеток и клеток, экспрессирующих люциферазы. Точная оценка базовых гипоксии опухоли и динамические изменения в ответ на лечение должно позволить рациональным терапевтическим 12 комбинации.
В заключение, недорогой, быстрый и высокочувствительный BLI может быть полезным инструментом для неинвазивно оценивать опухоль гипоксия динамики в естественных условиях. Хотя ортотопической модели опухоли головного мозга была использована в данном исследовании, методологии, безусловно, может быть применена и для других типов глубинных ортотопической опухолей у грызунов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование при частичной финансовой поддержке Министерства обороны груди премии IDEA Рак W81XWH-08-1-0583 и NIH / NCI CA141348-01A1 (ДЗ) и FAMRI клинических ученым премии (DS). Изображениями инфраструктуры обеспечивается Юго-Западного Маленькое Существо Imaging Research Программа выполнена при частичной поддержке U24 CA126608 и Симмонс Cancer Center (P30 CA142543) и NIH 1S10RR024757-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | L-123 | 120 mg/kg in PBS in a total volume of 80 μl for in vivo study |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 1701 | |
| 32G Hamilton needle | Hamilton Co | 7803-04 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| Bioluminescence imaging system | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum system | |
| G418 | Fisher Scientific | SV3006901 |
References
- Harada, H. The combination of hypoxia-response enhancers and an oxygen-dependent proteolytic motif enables real-time imaging of absolute HIF-1 activity in tumor xenografts. Biochem Biophys Res Commun. 360, 791-796 (2007).
- Ou, G. Usefulness of HIF-1 imaging for determining optimal timing of combining bevacizumab and radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75, 463-467 (2009).
- Zhou, H. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, e8051-e8051 (2009).
- Contero, A., Richer, E., Gondim, A., Mason, R. P. High-throughput quantitative bioluminescence imaging for assessing tumor burden. Methods Mol Biol. 574, 37-45 (2009).
- Zhao, D., Richer, E., Antich, P. P., Mason, R. P. Antivascular effects of combretastatin A4 phosphate in breast cancer xenograft assessed using dynamic bioluminescence imaging and confirmed by MRI. FASEB J. 22, 2245-2451 (2008).
- Chang, E. L., Lo, S. Diagnosis and management of central nervous system metastases from breast cancer. Oncologist. 8, 398-410 (2003).
- Palmieri, D. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clin Cancer Res. 15, 6148-6157 (2009).
- Mason, R. P. Multimodality imaging of hypoxia in preclinical settings. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54, 259-280 (2010).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Moeller, B. J. Pleiotropic effects of HIF-1 blockade on tumor radiosensitivity. Cancer Cell. 8, 99-110 (2005).
- Lu, X. In vivo dynamics and distinct functions of hypoxia in primary tumor growth and organotropic metastasis of breast cancer. Cancer Res. 70, 3905-3914 (2010).
- Zhao, D., Chang, C. H., Kim, J. G., Liu, H., Mason, R. P. In vivo Near-Infrared Spectroscopy and Magnetic Resonance Imaging Monitoring of Tumor Response to Combretastatin A-4-Phosphate Correlated With Therapeutic Outcome. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 80, 574-581 (2011).
