Summary
缺氧诱导因子-1α活动的生物发光成像是用于监测在乳腺癌脑转移瘤小鼠模型的颅内肿瘤缺氧发展。
Abstract
众所周知，肿瘤的缺氧起着促进恶性进展和治疗反应产生负面影响重要作用。有一点知识在原地，在体内 ，在缺氧的发展，因为缺乏有效的手段来监测这些深层次的原位肿瘤恶性脑肿瘤的颅内肿瘤，。生物发光成像（劳保局），表达的荧光素酶基因的活细胞所发出的光检测的基础上，已迅速采用为癌症研究，特别是评估肿瘤的生长或应对，在临床前动物研究治疗肿瘤的大小变化。此外，通过一个控制下的一个子序列的记者基因表达，特定的基因表达是可以被监测的非侵入性劳保局。缺氧压力下，主要通过缺氧诱导因子-1α（HIF -1α）介导的信号反应，以驱动各种基因的转录。因此，我们必须使用一个记者HIF -1α建设，5HRE多- LUC，稳定转染人乳腺癌MDA - MB231 细胞在体外HIF -1α的生物发光检测（MDA-MB231/5HRE-ODD-luc）是由孵化在低氧室，24小时前劳保局（0.1％O 2）转染的细胞，而细胞在常氧（21％O 2）作为一个控制。显着较高的光子通量细胞缺氧条件下的观察表明其启动的增加HIF -1α结合（HRE元素），比在常氧。细胞是直接注射到老鼠大脑建立一个乳腺癌脑转移瘤模型，在体内的肿瘤乏氧动力学生物发光成像。植入后2周开始，并反复每周一次。劳保局揭示增加脑肿瘤进展的光信号，表明增加了颅内肿瘤缺氧。组织学及免疫组织化学研究，以确认在体内成像结果。在这里，我们将介绍在体外 HIF -1α的生物发光检测，乳腺癌裸鼠和应用，在体内的生物发光成像技术来监测颅内肿瘤缺氧的脑转移瘤的手术建立的方法。
Protocol
机构动物护理和使用委员会的得克萨斯大学西南医学中心的所有动物的程序获得批准。
在体外 HIF -1α的生物发光检测1 。
- 材料和方法：
- 一种新型的HIF - 1依赖记者基因转染的人类转移性乳腺癌细胞株MDA - MB231，5HRE多 - 吕克博士原田生成。
- 在缺氧条件下，氧依赖性降解域（ODD）荧光素酶融合蛋白的表达增强是由5份缺氧反应元件（5HRE）。奇的存在，导致奇 - 吕克在极低的背景荧光素酶活性在常氧条件下产生的蛋白质的降解。因此，这种新颖的系统可用于检测实时成像在肿瘤缺氧地区。有报道原田等1,2本5HRE多- LUC表达载体的建设。
- 在常氧或缺氧培养细胞：
- 重组的MDA - MB231细胞保持在10％胎牛血清（FBS），DMEM培养基中含有1％谷氨酰胺，400微克/毫升的G418抗生素和1％青霉素/链霉素。
- 在体外 HIF -1α的生物发光检测，板3 × 10 5 MDA - MB231细胞表达在每两个六以及菜以及5HRE多- LUC载体。
- 允许附加孵育过夜后的碟壁细胞，然后转移到缺氧的研究低氧室（比卢普斯罗森堡，公司德尔马，加利福尼亚州）一盘，而保持在常氧条件下（21％O 2）下的其他盘。
- 重组与气瓶连接的进气口管与0.1％O 2的和气体的腔室。
注：在此过程中，必须打开进气口和出气口夹具。 - 断开气源后室已被清除和关闭塑料夹具密封腔。
- 将用5％的CO 2在37℃培养箱中培养室。
注：商会必须加湿，以防止水分蒸发过快文化。这可以通过配售10 - 20毫升无菌水在会议厅内。
- 生物发光检测：
- 孵育24小时后，取出培养基，用冰冷的PBS（2X）的细胞迅速。
- 添加1毫升冷PBS 100μL荧光素（金生物技术，圣路易斯，密苏里州）。
- 获得不同的曝光时间（1，30，60，180秒）BL成像（IVIS频谱系统，卡尺生命科学，霍普金顿马）。
- 测量光的强度在每口井使用的生活图像软件（卡尺生命科学版）。
2。乳腺癌脑转移瘤模型的建立
- MDA-MB231/5HRE-ODD-luc细胞的制备
- 检索和文化DEME培养基中含有10％FBS，1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素MDA-MB231/5HRE-ODD-luc细胞。
- 更换介质每2-3天。 Tripsinize和清洗细胞，当他们达到80％汇合。
- 计数适当数量的细胞，重悬在无血清DEME介质中，他们与4μL 体积的10 5细胞终浓度25％的基质胶（BD公司，加利福尼亚州圣何塞）。
- 细胞颅内注射前置于冰上。
- 手术植入
- 在4-6周龄雌性裸鼠（BALB / C NU / NU;，马里兰州贝塞斯达国立癌症研究所）在这项研究中使用。
- 麻醉（3％异氟醚/感应室中的氧气，异氟醚从巴克斯特国际公司，迪尔菲尔德，IL，USA），并保持与异氟醚（1％），氧（1 DM 3 / 分 ）在手术过程3中的动物。
- 右顶叶皮肤应prepped优碘，然后前70％的酒精切口。
- 使用高速钻，毛刺冠状缝和矢状缝合横向到2毫米的头骨，1毫米前右半球在1毫米的孔。
- 绘制4μL细胞的混合物（10 5细胞）使用10μL注射器汉密尔顿（汉密尔顿公司，内华达州里诺市）。权尾椎间脑，硬脑膜下1.5毫米，使用一个特制的32G汉密尔顿针直接注入到细胞。在保持前撤出约30小号针。一个32G的细针的使用，最大限度地减少组织损伤。
- 用骨蜡填充的毛刺孔和关闭与可吸收缝合线头皮。
- 准备用70％酒精的切口地区。
- 应用丁丙诺啡镇痛两天，每12小时。
（3） 在体内的生物发光成像在乳腺癌脑转移的肿瘤缺氧动态
- 8颅内植入和每周一次的重复启动纵向生物发光成像（IVIS频谱系统）两个星期后-10周。
- 一次麻醉三个小鼠（3％异氟醚/ O 2的感应室）
- 管理解决方案的D -荧光素（120毫克/公斤，在80μL总体积的PBS，黄金生物技术），皮下注射，每只小鼠的颈部区域， 详细介绍了此前4。
D -荧光素是无毒的，并已被证明是能够穿透完整的血脑屏障（BBB）和细胞膜 3,5 。
- 3小鼠放置在成像室，并保持与异氟醚（1％），氧（1 DM 3 /分）在成像。
- 荧光素注射后5分钟，获得“基本法”的成像阵列与一个不同的曝光时间（1，30，60，180秒）。
我们的观察表明，峰值光发射时间约5分钟后皮下注射的荧光素， 在颈部3,4。
- 分析与生活成像软件（卡尺生命科学版）数据使用绝对光子计数（光子/秒），在感兴趣的区域（ROI），手工绘制的轮廓的大脑劳保局信号。
- 剧情时间当然光子计数曲线，表明肿瘤缺氧动态。
- 后立即去年劳保局，管理pimonidazole，缺氧标记和1小时后，牺牲小鼠，解剖的大脑。嵌入最佳切削温度（OCT）的中期和冻结在-80 ° C冰箱的整个大脑。随后的病理甲酚紫染色法和对荧光素酶，缺氧标记pimonidazole免疫组织化学染色，与HIF -1α进行验证成像观测。
4。代表性的成果：
如图1所示，劳保局信号显著较高的转染细胞在缺氧（1％O 2）室24小时孵育后观察。常氧条件下的对照组细胞观察到微弱的光发射。这可能会导致拥挤的细胞群从3 × 10 5细胞应力信号，从而诱发细胞过度表达HIF -1α后24小时文化。然而， 在体内劳保局结果进行了验证通过免疫组织化学染色显示肿瘤的缺氧和荧光素酶表达的共定位。
自动化阵列的曝光时间，使连续收购的一系列图像，这有利于用较长的曝光时间捕捉微弱信号和强有力的信号，使用更短的时间内没有饱和的CCD。
图1体外 HIF -1α的生物发光检测的顶行：3 × 10 5 24 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc以及在缺氧室6以及盘（0.1％O 2）在每个培养细胞中期小时前取出，洗净，用1 ml PBS代替。立即加入到每孔100μL荧光素后，劳保局收购阵列的曝光时间（1，30，60，180秒）。强发光代表井底部行：作为对照，3 × 10 5细胞培养下发出微弱的光常氧（21％O 2）。
A）从鼠脑右侧的微弱的光信号，在体内的肿瘤乏氧动力学生物发光成像图 2。颅内植入第一个可视化的5个星期后的MDA-MB231/5HRE-ODD-luc乳腺癌细胞。观察到的光信号增加额外的6个星期，表明增加肿瘤缺氧B）的情节表明定量光信号的光子计数的时间过程曲线。
图3免疫组织化学染色检测到的荧光素酶和缺氧 Colocaliztion。轴承在OCT包埋的乳腺癌MDA-MB231/5HRE-ODD-luc的转移一个冷冻小鼠大脑切片。一个10微米的部分免疫染色标记，pimonidazole缺氧，发现瘤内的异质性缺氧，该产品被发现与抗荧光素酶染色检测的荧光素酶的表达空间的相关性。比例尺，100微米。
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Discussion
乳腺癌脑转移发生在IV期乳腺癌患者的30％。这是与高发病率和死亡率，并有一个中位生存期13个月6。是需要有合适的动物模型，模仿这种破坏性疾病，在临床上为了便于我们了解其颅内的启动和进展，以及病理生理型材。在这里，我们已经开发注入人类乳腺癌细胞，直接进入鼠脑，原位乳腺癌脑转移模型。我们以前的经验表明，一个放射学可视化（MRI）的颅内病变植入约2周后出现。这个直喷模型以外，我们最近实施创建另一个原位乳腺癌脑转移瘤模型的癌细胞注射到小鼠左心室腔内细胞注射的方法。然而，脑转移瘤易发生乳腺癌细胞的预选是要实现在此模型中 7的多灶性脑病变。我们最近推出了相同的HRE - LUC建设成小鼠乳腺癌4T1细胞能够通过腔内注射到鼠脑转移。
生物发光成像是高度敏感和有效的，不同的是，荧光成像，不需要光激发。这有利于在这项研究中的深层次的肿瘤成像，在啮齿类动物模型 ，例如，颅内脑肿瘤的小鼠。在同一时间，三个甚至五鼠可成像。然而，为了提高灵敏度，特别是当信号弱的全身图像，设置动物的位置更接近相机将是必要的。在这种情况下，只有一个或两个动物可以每一次成像。劳保局限制之一是低空间分辨率的解剖，虽然有一些方法来生成断层图像。联合登记与微CT或磁共振成像，将有助于正确识别解剖。
寻求广泛的努力已开发非侵入性的方法来监测在 体内 8,9的肿瘤缺氧。通过引入癌细胞的基因组缺氧记者基因，肿瘤缺氧演变的纵向监测， 可以监测光学成像10,11。同样，肿瘤乏氧动力学治疗后可以使用这种方法进行监测。
除了荧光素酶及其底物，荧光素，氧和ATP在荧光素的荧光素酶反应中不可缺少的元素，产生光。在缺氧的环境，提供氧气和ATP的生产可能会显著有限，这可能导致减少的光发射。然而，我们的结果显示，MDA-231/HRE-luc细胞在体外劳保局检测排放显著更多的光线，在常氧条件相比（<0.1％O 2）在缺氧条件下培养。此外，肿瘤组织的免疫组数据显示了良好的空间之间的荧光素酶的表达和pimonidazole的相关性。这些意见是一个好协议与以前的研究，表明高效的轻型生产所需的氧气浓度和ATP远低于生活哺乳动物细胞中找到了自己的水平。我们还结合功能磁共振成像方法，大胆（血氧水平依赖），并告诉（组织血氧水平依赖）MRI检查，以评估此模型的肿瘤缺氧。可比数据已获得多式联运成像方法（未发表数据）。此外，免疫组化染色证实缺氧的肿瘤细胞和荧光素酶的表达colocaliztion。基线肿瘤缺氧和动态变化的准确评估，对治疗的反应，应该允许合理的治疗组合12。
总之，廉价，快速和高度敏感的劳保局可以成为一个有用的工具，以非侵入性评估在体内的肿瘤乏氧动力学。虽然原位脑肿瘤模型已在这项研究中使用，该方法可以肯定会在啮齿类动物中深层次的原位肿瘤的其他类型的应用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是支持部分由国防部乳腺癌IDEA奖W81XWH - 08 - 1 - 0583和NIH / NCI CA141348 - 01A1（DZ）和FAMRI临床科学家奖（DS）。成像的基础设施是由西南部分小动物成像研究支持计划（U24 CA126608）和西蒙斯癌症中心（P30 CA142543）和NIH 1S10RR024757 - 01。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | L-123 | 120 mg/kg in PBS in a total volume of 80 μl for in vivo study |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 1701 | |
| 32G Hamilton needle | Hamilton Co | 7803-04 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| Bioluminescence imaging system | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum system | |
| G418 | Fisher Scientific | SV3006901 |
References
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