Summary
Imagem de bioluminescência de hipóxia induzida a atividade do fator-1α é aplicada para monitorar o desenvolvimento hipóxia intracraniana tumor em um câncer de mama modelo de cérebro de rato metástase.
Abstract
É bem reconhecido que a hipóxia tumor desempenha um papel importante na promoção da progressão maligna e afetando negativamente a resposta terapêutica. Há pouco conhecimento sobre in situ, em hipóxia, vivo tumor intracraniano durante o desenvolvimento de tumores cerebrais malignos por causa da falta de meios eficientes para monitorá-lo nestes tumores profundos ortotópico. Imagem de bioluminescência (BLI), baseado na detecção de luz emitida por células vivas expressando um gene da luciferase, foi rapidamente adotado para a investigação do cancro, em particular, para avaliar o crescimento do tumor ou mudanças tamanho do tumor em resposta ao tratamento em estudos com animais pré-clínicos. Além disso, ao expressar um gene repórter sob o controle de uma seqüência promotora, a expressão de genes específicos podem ser monitorados de forma não invasiva por BLI. Sob estresse hipóxico, as respostas de sinalização são mediadas principalmente através da indução de hipóxia factor-1α (HIF-1α) para dirigir a transcrição de vários genes. Portanto, temos utilizado uma construção repórter HIF-1α, 5HRE-ODD-luc, estavelmente transfectadas em câncer de mama humano MDA-MB231 células (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro ensaio HIF-1α bioluminescência é realizada por incubando as células transfectadas em uma câmara de hipóxia (0,1% O 2) por 24 horas antes de BLI, enquanto as células em normóxia (21% O 2) servir como controle. Significativamente maior fluxo de fótons observados para as células em hipóxia sugere uma ligação de HIF-1α aumentou para seu promotor (elementos HRE), em comparação com aqueles em normóxia. As células são injetadas diretamente no cérebro de camundongo para estabelecer um modelo de câncer de mama metástase cerebral. Na imagem de bioluminescência vivo da dinâmica hipóxia tumor é iniciado 2 semanas após o implante e repetido uma vez por semana. BLI revela aumento sinais de luz a partir do cérebro como o tumor progride, indicando aumento da hipóxia tumor intracraniano. Estudos histológicos e imunohistoquímicos são usados para confirmar a no resultado de imagem in vivo. Aqui, vamos introduzir abordagens de ensaio in vitro HIF-1α bioluminescência, criação cirúrgica de uma metástase cerebral de câncer de mama em camundongos nude e aplicação de imagem de bioluminescência em vivo para monitorar hipóxia tumor intracraniano.
Protocol
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Uso de University of Texas Southwestern Medical Center.
1. In vitro ensaio HIF-1α bioluminescência
- Materiais e Métodos:
- Humana de mama metastático linhagem de células MDA-MB231 câncer transfectadas com um gene repórter romance HIF-1-dependente, 5HRE-ODD-luc foi gerado pelo Dr. Harada.
- Em condições de hipóxia, a expressão aumentada de oxigênio-dependente de domínio degradação (ODD)-luciferase proteína de fusão é impulsionado por 5 cópias de hipóxia-resposta elemento (5HRE). A presença de ODD causas da degradação de ODD-Luc proteína, resultando em muito baixa atividade de fundo luciferase em condições normóxica. Portanto, este novo sistema pode ser usado para detectar regiões hipóxica em um tumor por imagem em tempo real. A construção deste vetor de expressão 5HRE-ODD-luc tem sido relatada por 1,2 Harada et al.
- Células de cultura em normóxia ou hipóxia:
- Manter o MDA-MB231 recombinante células em 10% de soro fetal bovino (FBS), DMEM contendo 1% de glutamina, antibióticos de 400 mcg / ml de G418 e 1% de penicilina / estreptomicina.
- Para o ensaio in vitro HIF-1α bioluminescência, placa de 3 x 10 5 MDA-MB231 células que expressam 5HRE-ODD-luc vetor em cada poço de dois prato seis também.
- Permitem que as células para anexar o prato de parede após incubação overnight e depois transferir um prato em uma câmara de hipóxia (Billups-Rothenberg, Inc. Del Mar, CA) para estudos de hipóxia, enquanto que manter o outro prato sob condição normóxica (21% O 2).
- Remontar a câmara ea câmara de gás com 0,1% do O 2, ligando o tubo porta de entrada com um cilindro de gás.
Nota: Ambos entrada e abraçadeiras porta de saída devem ser abertas durante este procedimento. - Desconecte a fonte de gás após a câmara foi purgado e câmara de vedação, fechando braçadeiras de plástico.
- Coloque a câmara em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2.
Nota: A câmara deve ser umidificado para evitar a evaporação excessiva de culturas. Isso pode ser feito colocando 10-20 ml de água estéril na câmara.
- Ensaio de bioluminescência:
- Depois de 24 hr de incubação, remova o meio e lavar as células rapidamente com gelado PBS (2X).
- Adicionar 1 ml de PBS frio com 100 l de luciferina (Gold Biotecnologia, St Louis, MO).
- Adquirir BL imagem (IVIS sistema Spectrum, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) com vários tempos de exposição (1, 30, 60, 180 s).
- Medir a intensidade de luz em cada poço usando o software Image Living (Caliper Life Sciences).
2. Estabelecimento de um modelo de metástase de câncer de mama cérebro
- Preparação das células MDA-MB231/5HRE-ODD-luc
- Recuperar e cultura as células MDA-MB231/5HRE-ODD-luc em meio DEME contendo 10% FBS, 1 glutamina% e 1% de penicilina / estreptomicina.
- Substituir média a cada 2-3 dias. Tripsinize e lavar as células quando atingirem confluência de 80%.
- Contar o número adequado de células e ressuspender-los em meio isento de soro DEME com Matrigel 25% (BD Biosciences, San Jose, CA) com uma concentração final de 10 5 células em 4 mL de volume.
- Células colocar no gelo antes da injeção intracraniana.
- Implantação cirúrgica
- Feminino camundongos nude (BALB / c nu / nu; National Cancer Institute, Bethesda, MD), 4-6 semanas de idade são usadas neste estudo.
- Anestesiar (3% isoflurano / O2 em uma câmara de indução; isoflurano da Baxter International Inc., Deerfield, IL, EUA) e manter os animais com isoflurano (1%) em oxigênio (1 dm 3 / min) durante o procedimento cirúrgico 3.
- A pele parietal direito deve ser preparado com betadine e depois álcool 70% antes da incisão.
- Utilizando uma broca de alta velocidade, burr um buraco de 1 mm no hemisfério direito do crânio, 1mm anterior à sutura coronal e 2 mm lateral à sutura sagital.
- Draw 4 mistura de células mL (10 5 células) usando um seringa 10 ml Hamilton (Hamilton Company, Reno, NV). Injetar as células diretamente no direito caudal diencéfalo, 1,5 mm abaixo da dura-máter usando um custom-made agulha 32G Hamilton. Mantenha a agulha no local por cerca de 30 s antes da retirada. Uso de uma agulha fina 32G minimiza dano tecidual.
- Preencher o buraco com cera de osso rebarbas e fechar o couro cabeludo com suturas absorvíveis.
- Preparar a região da incisão com álcool a 70%.
- Aplicar buprenorfina analgesia a cada 12 horas durante dois dias.
3. Na imagem de bioluminescência in vivo de tumor na mama dinâmica hipóxia metástase do câncer de cérebro
- Iniciado imagem de bioluminescência longitudinal (IVIS sistema Spectrum) duas semanas após o implante intracraniana e repetir uma vez por semana durante 8-10 Semanas.
- Anestesiar três ratos em um momento (3% isoflurano / O 2 em uma câmara de indução)
- Administrar uma solução de D-luciferina (120 mg / kg em PBS em um volume total de 80 mL; Biotecnologia Gold) por via subcutânea na região do pescoço de cada rato, como descrito em detalhes anteriormente 4.
D-luciferina não é tóxico e tem se mostrado capaz de penetrar barreira hemato-encefálica intacta (BBB) e membranas celulares 3,5.
- Coloque os 3 ratos na câmara de imagem e mantida com isoflurano (1%) em oxigênio (1 dm 3 / min) durante o exame.
- Cinco minutos após a injeção de luciferina, adquirir BL imagem com uma matriz de tempo de exposição diversas (1, 30, 60, 180 s).
Nossas observações mostram que o tempo de emissão de pico de luz é de cerca de 5 minutos após a administração subcutânea de luciferina na região do pescoço 3,4.
- Analisar os dados com o software de imagem Living (Caliper Life Sciences) usando contagem absoluta de fótons (fótons / s) em uma região de interesse (ROI), manualmente desenhados para traçar o sinal BLI do cérebro.
- Plot curva curso de tempo de contagem de fótons para indicar a dinâmica hipóxia tumor.
- Imediatamente após a última BLI, administrar pimonidazole, o marcador de hipóxia e 1 hr depois, o sacrifício dos camundongos e dissecar o cérebro. Incorporar o cérebro inteiro na temperatura ideal de corte (OCT) de médio e congelar em freezer -80 ° C. Coloração violeta cresil histológicas subseqüentes e coloração imuno-histoquímica contra a luciferase, hipóxia marcador pimonidazole e HIF-1α realizada para validar observações de imagem.
4. Resultados representativos:
Como mostrado na Fig.1, significativamente maior sinal de BLI foi observada após as células transfectadas incubados na câmara hipóxica (1% O 2) durante 24 horas. Emissão de luz fraca foi observada a partir de células controle sob normóxia. Isto pode resultar da população cela superlotada após 24 h de cultura 3 x 10 5 células, o que induziu um sinal de estresse para as células a HIF-1α superexpressam. No entanto, os resultados in vivo BLI foram validados por coloração imuno-histoquímica mostrando co-localização entre hipóxia tumor e expressão luciferase.
Um array automatizada de tempos de exposição permite aquisições contínua de uma série de imagens, o que facilita a captura de um sinal fraco, com maior tempo de exposição, e sinais de forte usando um tempo mais curto sem saturar o CCD.
Figura 1 ensaio in vitro HIF-1α bioluminescência linha Top:. 3 x 10 5 células MDA-MB231/5HRE-ODD-luc incubadas em cada poço de uma 6-bem-prato em uma câmara de hipóxia (0,1% O 2) para 24 hr antes do meio foi retirado, lavado, substituído com 1 ml de PBS. Imediatamente após 100 mL luciferina foi adicionado em cada poço, BLI foi adquirido com uma série de tempos de exposição (1, 30, 60, 180 s). Luminescência forte foi observada a partir de poços representante Linha inferior:. Como controle, 3 x 10 5 células incubados em normóxia (21% O 2) a luz emitida fraco.
Figura 2 Na imagem de bioluminescência vivo da dinâmica hipóxia tumor. A) Um sinal de luz fraca do lado direito do cérebro do rato foi visualizada 5 semanas após o implante de células de câncer intracraniano MDA-MB231/5HRE-ODD-luc mama. Aumento do sinal óptico foi observada ao longo de seis semanas adicionais, indicando hipóxia tumor aumentou. B) O enredo mostrou a curva de evolução no tempo da contagem quantitativa fóton de sinal luminoso.
Colocaliztion figura 3 do luciferase e hipóxia detectados pela imuno-químico de coloração. Um cérebro de camundongo congelado tendo uma metástase de câncer de mama MDA-MB231/5HRE-ODD-luc embutidos em outubro foi seccionado. Uma seção de 10 mM imunocoradas com encefalopatia hipóxico marcador, pimonidazole, revelou heterogeneidade intratumoral de hipóxia, que foi encontrado para correlacionar espacialmente com expressão luciferase detectado pelo anti-luciferase coloração. Barra de escala, 100 mm.
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Discussion
De mama câncer de metástase cerebral ocorre em 30% dos pacientes com câncer de mama no estágio IV. Ela está associada com alta morbidade e mortalidade, com sobrevida mediana de 13 meses 6. Há uma necessidade de ter modelos animais apropriados para imitar esta doença clinicamente devastadora, a fim de facilitar a nossa compreensão da sua iniciação intracraniana e progressão, bem como perfis fisiopatológicos. Aqui, temos desenvolvido um modelo ortotópico de câncer de mama metástase cerebral através da injeção de células de câncer de mama humano, diretamente no cérebro de camundongos. Nossas experiências anteriores têm demonstrado que uma lesão radiologicamente visualizado (por MRI) intracraniana aparece cerca de duas semanas após o implante. Alternativa a este modelo de injeção direta, que recentemente implementou uma abordagem injeção intracardíaca de células para criar outro modelo ortotópico de câncer de mama metástase cerebral através da injeção de células cancerosas para o ventrículo esquerdo de ratos. No entanto, pré-selecção de metástases cerebrais propensas células de câncer de mama é necessário para atingir lesões multi-focal cerebral neste modelo 7. Introduzimos recentemente o mesmo HRE-luc construir o mouse em células de câncer de mama 4T1 que são capazes de metástase no cérebro do rato através de injeção intracardíaca.
Imagem de bioluminescência é altamente sensível e eficiente, que, ao contrário de imagens de fluorescência, não precisa de excitação de luz. Isso facilita a imagem de profundas tumores em modelos de roedores, por exemplo, os tumores cerebrais intracranianas de mouse neste estudo. Três ou até cinco ratos podem ser visualizados ao mesmo tempo. No entanto, para aumentar a sensibilidade, especialmente quando um sinal fraco foi visto na imagem de corpo inteiro, definir a posição de animais mais perto da câmera serão necessários. Neste caso, apenas um ou dois animais pode ser trabalhada a cada vez. Uma limitação do BLI é baixa resolução espacial da anatomia, embora existam métodos para gerar imagens tomográficas. Co-registo com micro-CT ou imagens MR iria ajudar a identificar corretamente a anatomia.
Grandes esforços têm sido procurado desenvolver abordagens não-invasivas para monitorar hipóxia tumor in vivo 8,9. Com a introdução de um gene repórter hipóxia no genoma de células de câncer, o monitoramento longitudinal da evolução hipóxia tumor pode ser monitorado por imagem óptica 10,11. Da mesma forma, o tratamento do tumor hipóxia dinâmicas a seguir podem ser monitorados usando essa abordagem.
Além de luciferase e seu substrato, a luciferina, oxigênio e ATP são elementos indispensáveis na reação luciferina-luciferase para produzir luz. Em ambiente hipóxico, a disponibilidade de oxigênio e produção de ATP pode ser significativamente limitada, o que poderia resultar na emissão de luz reduzida. No entanto, o nosso ensaio in vitro BLI mostraram que as células MDA-231/HRE-luc incubados sob condições de hipóxia (<0,1% O 2) emitida significativamente mais leve, em comparação com aqueles em condição normóxica. Além disso, os dados imuno-histoquímica de tecidos tumorais revelou uma boa correlação espacial entre a expressão da luciferase e pimonidazole. Essas observações estão em um bom acordo com estudos anteriores por outros, sugerindo que a concentração de oxigênio e ATP necessário para a produção de luz eficiente estão bem abaixo dos níveis encontrados em células vivas de mamíferos. Também combinamos abordagens funcionais de ressonância magnética, BOLD (nível de oxigênio no sangue dependente) e disse (nível de oxigênio tecidual dependente) ressonância magnética para avaliar a hipóxia tumor neste modelo. Dados comparáveis foram obtidos a partir das abordagens de imagem multimodal (dados não publicados). Além disso, coloração imuno-histoquímica confirmou colocaliztion de células tumorais hipóxicas e luciferase células que expressam. Avaliação precisa de hipóxia base do tumor e as mudanças dinâmicas na resposta ao tratamento deve permitir que 12 combinação terapêutica racional.
Em conclusão, a BLI, barato rápido e altamente sensível pode ser uma ferramenta útil para avaliar de forma não invasiva tumor dinâmica hipóxia in vivo. Enquanto o modelo de tumor cerebral ortotópico foi usado neste estudo, a metodologia pode certamente ser aplicada para outros tipos de tumores profundos ortotópico em roedores.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este estudo é apoiado em parte pelo DOD Prêmio IDEA Câncer de Mama W81XWH-08-1-0583 e NIH / NCI CA141348-01A1 (DZ) e FAMRI prêmio cientista clínico (DS). Infra-estrutura de imagem é fornecido pelo Southwestern Programa de Pequenas Pesquisa Animal de imagem suportados em parte pela U24 CA126608 e Câncer Simmons Center (P30 CA142543) e NIH 1S10RR024757-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | L-123 | 120 mg/kg in PBS in a total volume of 80 μl for in vivo study |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 1701 | |
| 32G Hamilton needle | Hamilton Co | 7803-04 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| Bioluminescence imaging system | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum system | |
| G418 | Fisher Scientific | SV3006901 |
References
- Harada, H. The combination of hypoxia-response enhancers and an oxygen-dependent proteolytic motif enables real-time imaging of absolute HIF-1 activity in tumor xenografts. Biochem Biophys Res Commun. 360, 791-796 (2007).
- Ou, G. Usefulness of HIF-1 imaging for determining optimal timing of combining bevacizumab and radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75, 463-467 (2009).
- Zhou, H. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, e8051-e8051 (2009).
- Contero, A., Richer, E., Gondim, A., Mason, R. P. High-throughput quantitative bioluminescence imaging for assessing tumor burden. Methods Mol Biol. 574, 37-45 (2009).
- Zhao, D., Richer, E., Antich, P. P., Mason, R. P. Antivascular effects of combretastatin A4 phosphate in breast cancer xenograft assessed using dynamic bioluminescence imaging and confirmed by MRI. FASEB J. 22, 2245-2451 (2008).
- Chang, E. L., Lo, S. Diagnosis and management of central nervous system metastases from breast cancer. Oncologist. 8, 398-410 (2003).
- Palmieri, D. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clin Cancer Res. 15, 6148-6157 (2009).
- Mason, R. P. Multimodality imaging of hypoxia in preclinical settings. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54, 259-280 (2010).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Moeller, B. J. Pleiotropic effects of HIF-1 blockade on tumor radiosensitivity. Cancer Cell. 8, 99-110 (2005).
- Lu, X. In vivo dynamics and distinct functions of hypoxia in primary tumor growth and organotropic metastasis of breast cancer. Cancer Res. 70, 3905-3914 (2010).
- Zhao, D., Chang, C. H., Kim, J. G., Liu, H., Mason, R. P. In vivo Near-Infrared Spectroscopy and Magnetic Resonance Imaging Monitoring of Tumor Response to Combretastatin A-4-Phosphate Correlated With Therapeutic Outcome. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 80, 574-581 (2011).
