Summary
Целью данной статьи является демонстрация метод для оптимизации иммунофлуоресцентного обнаружения рецептора эстрогена-α (ERα) у крыс пиальных артериальной ломтики с помощью цифрового иммунофлуоресцентного микроскопа.
Abstract
Многие из эффектов эстрогенов на сосудистую реактивность опосредуется через взаимодействие с рецепторами эстрогена 1, 2, 3. Хотя два подтипа существует (эстроген рецептор-α и β), эстроген рецептор-α была определена в обоих гладких мышц и в эндотелиальных клетках пиальных артериальных сегментов с помощью флуоресцентного окрашивания в сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 4. Кроме того, ЭР-α находится в ядрах и в цитоплазме крысы базилярной артерии 5. Рецепторы имеются в изобилии и ярко светиться, но четкой визуализации дискретных групп рецепторов трудно вероятно из-за номера расположены во многих слоев клеток пиальных сегментов судна. Кроме того, многие отчеты с помощью иммуногистохимических методов в паре с конфокальной микроскопии плохо подробно требования решающее значение для воспроизводства эксперименты 6. Наша цель этой статьи заключается в описании простой метод для оптимизации тон окрашивания и визуализации ER-α с использованием межсекторальных ломтиками пиальных артериол получить из женских мозгах крыс. Сначала заливать крыс с Эванса синего красителя легко определить поверхность мягкой мозговой оболочки артерий, которые мы выделяем при вскрытии микроскопом. Использование криостат нарезать 8 мкм сечения артерий позволяет получить тонкие срезы судна, с тем, что разные плоскости судна более четко визуализировать. Резка через сосуд, а не использование небольшой части судна имеет то преимущество, легче просмотра эндотелия и гладкой слоев мышц. Кроме того, использование цифровых иммунофлуоресцентного микроскопа с расширенным программным обеспечением глубины производит четкие изображения от десяти до двенадцати разных плоскостях судна и обходится дешевле, чем использование конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Protocol
1. Выделение и подготовка пиальных артерий
- В то время как крысы под наркозом вставить и безопасный катетер в артерию и заливать с 1% Эванса синего 1X PBS. Пиальных судов хорошо окрашиваются Эванса синего красителя делает их легче изолировать.
- Извлечение мозга и хранить при температуре -70 ° C до необходимости. Оптимально, мозги должны храниться не более 2 месяцев.
- Использование рассекает микроскопом удалить пиальных артериол (средний диаметр 35-50 мкм) от поверхности мозга. Аккуратно снять все сине-окрашенных артериол из спинной и боковой поверхности коры использования с острым концом щипцов. Удалите излишки приверженцем корковой ткани прежде, чем поместить в фиксатор.
- Fix собрано артериол в 2% холодная параформальдегида в 0,1 М PBS в течение 30 мин.
- Для подготовки артериол для секционирования залить вложение среды на замораживание диск / патрон (установлен на уровне -20 ° С).
- Место артериол разделе квартиры на патронея ждать, пока она замерзает. Твердо место судна вверх прямо на диск криостат замораживания о вложении средств массовой информации с кончика артерии к себе. Держите его с помощью пинцета, пока он прочно заморожена.
- Место замораживания диск с судна в криостате головы и вырезать 8 мкм пиальных артериол кольца с криостата.
- Горы артериол разделы по хрома-калия-желатин subbed слайдов.
- Магазин подготовлены слайды в режиме слайд-окно в холодильнике при температуре 4 ° С в течение ночи.
2. ER-α иммунофлуоресцентного окрашивания
День 1
- Удалить слайды из холодильника, довести каждое до комнатной температуры.
- Для мытья слайды влить 1-1,5 мл 0,1 М PBS (достаточно, чтобы охватить все разделы) дайте постоять 10 минут, процедить и повторите процедуру еще дважды. Каждое ребро слайд гидрофобные маркером. Следовательно, жидкость остается на поверхности слайда. С каждого мытья жидкость заливаетсяи заменить свежим 0,1 М PBS.
- Инкубируйте слайды в 1 мл 50 мМ хлорида аммония в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы уменьшить эндогенное флуоресценции.
- Вымойте слайдов в 0,1 мин PBS 3х10. как описано в пункте 2.2
- Блок слайдов в 0,1% Triton-X 100 плюс 1% нормальной козьей сывороткой (NGS) в PBS в течение 30 мин. уменьшить неспецифическое связывание.
- Инкубируйте образцы с первичными антителами (кролик поликлональных анти-ER-α, 1:500) в PBS + 0,1% Triton-X + 1% NGS ночи при 4 ° C.
День 2
- Удалить слайды из холодильника, довести каждое до комнатной температуры.
- Вымойте слайдов в 0,1 мин PBS 3х10. как описано в пункте 2.2
- Инкубируйте с Орегон Зеленый 488 вторичном анти-кролик в 1% NGS 0,1% Triton-X100 + PBS в течение 2 часов в темном месте при комнатной температуре. С этого шага, следующие шаги должны быть сделаны в темное время суток.
- Вымойте слайдов в 0,1 мин PBS 3х10. как описано в пункте 2.2
- Под веntilated капот, 1 место капли 4 ', 6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI), а также монтаж средств массовой информации на судах, а затем поместить покровным стеклом по образцу.
- Применить ясно лак для ногтей, чтобы запечатать края покрытия скольжения. Не перемещайте слайды до полного высыхания, который длится примерно 24 часов.
3. Цифровой флуоресценции
- Для изображений ER-α в мягкой мозговой оболочки судна ломтик мы используем Nikon Eclipse 80i цифровой флуоресцентный микроскоп с фильтрами для 3-х цветов (синий, зеленый и красный), оснащенных цифровой камерой.
- Вставьте подготовленные слайды с окрашенных пиальных сегментов судно под микроскопом и приспосабливаться к себе флуоресцентно меченных областях, представляющих интерес. Начало x100 увеличении затем увеличится до x600 увеличении.
- Использование камеры для съемки изображений в DAPI (синий) и FITC (зеленый) каналов для клеточных ядер (DAPI) и ЭР-α (Орегон Зеленый) с помощью программного обеспечения Nikon Расширенный фокус Глубина конвертировать несколько зренияс судна сегментов в 2-D изображения.
4. Представитель Результаты:
Мы локализованных эстроген рецептор-α в пиальных артериальных сосудов использованием флуоресцентных зондов и оптимизировали свой визуализации рецепторов с использованием цифровой флуоресцентной микроскопии. Чтобы определить наличие рецепторов, кролик поликлональных первичных антител и Орегон Зеленый 488 меченых вторичных антител был использован для изображения рецепторов в мягкой мозговой оболочки артерий изолированы от поверхности мозга. Кроме того, ядерное пятна (DAPI) была использована для выявления клеточных ядер и определить, если бы мы могли обнаружить рецепторы, расположенные в ядре с ER-α, как сообщается, должны присутствовать в cyotosol клетки и ядра. Кроме того, мы провели эксперименты подтверждающее для проверки специфичности первичных антител и проверить связывания вторично по отношению к первичным антителом.
Рисунок 1. Иммунофлуоресцентного окрашивания для ER-α (зеленый) и counterstaining с DAPI (синий) в пиальных кольцом артерия изолированы от женский мозг крысы. Рис 1А показывает объединены образы предполагая наличие некоторых внутриядерных эстроген рецептор (стрелка). Рис 1B и 1C сфокусированного изображения ER-α, который является сочетанием Z-стека изображений. Изображения были приняты на увеличение x600, и из разреза кольцо того же судна в разных плоскостях. Стрелки указывают рецептора эстрогена-α.
Рисунок 2. Иммунофлуоресцентного окрашивания для контрольных групп в пиальных кольцом артерия изолированы от женский мозг крысы. Рис 2D показывает судна без первичных антител. Рис 2E показывает судна без вторичными антителами (обратите внимание различные аутофлюоресценция вдоль эндотелия стороны). Изображения были приняты на увеличение x600, и из разреза кольцо того же судна в differeп плоскостях.
Discussion
Ранее мы показали, что после переходного глобального ишемического повреждения мозга пиальных мощность артерии изменять диаметр в ответ как вазодилататоры 7, 8 и 9 вазоконстрикторов заметно депрессии у молодых крыс с удаленными яичниками. Хронический пресыщения эстрогенов восстанавливает вазомоторных ответов 7-9. Кроме того, задержка замены эстрогена меняет положительное влияние эстрогенов на мягкой мозговой оболочки артерии сосудорасширяющее мощностью 10 ведущих нас вопрос о том, долгосрочных эстроген влияет на истощение ER-α плотности в cerebrovasculature. Мы планировали использовать иммунофлуоресцентного маркировка в сочетании с западной промокательной для оценки изменений в ER-α выражение в ответ на хроническое истощение эстрогена. Потому что у нас были некоторые трудности в визуализации дискретных групп рецепторов мы модифицировали метод, который мы демонстрируем здесь. Таким образом, наша основная задача в данном исследовании было сначала разработать относительно простой метод для оптимизации визуальныхзации рецепторов в пиальных артериол. По договоренности с несколькими отчетами 6,11,12 мы сочли необходимым внести коррективы для данного типа ткани мы зондирования толщины образца, распределение ER-α в сосуде, а также степень неспецифического связывания .
Наш метод очень эффективен для визуализации присутствие ER-α в пиальных ломтиками судна. Но, как другие уже было отмечено успешное использование этих методов во многом зависит от специфики и концентрации антител, внутриклеточной локализации белков интереса, фиксации и блокирование протоколов и обработке тканей 12. До визуализации наших препаратов судна мы провели время, чтобы отработать все эти переменные. Мы выявили, как мы, необходимых для корректировки некоторых наших подход в данной работе.
Мы задались целью оптимально визуализировать ER-α в пиальных артериол и это представлено несколько задач.Во-первых, средний размер крысы пиальных артерии между 35-50 мкм решений изоляции и удаления с поверхности мозга несколько сложнее. Мы обнаружили, что перфузии с Эванса синего красителя до жертву делает вскрытие артерии легче. Синий Эван может влиять флуоресценции, но мы чувствуем, что преимуществом использования этого красителя перевешивают ее незначительные недостатки. В нашем протоколе суда промывают несколько раз. Это сводит к минимуму остаточные красителя в сосуды и уменьшает возможные последствия красителя на флуоресценцию. Еще одна трудность, мы столкнулись, был, что толщина пиальных сегментов судно ясно визуализации рецепторов сложно. Кроме того, мы не могли получить четкое изображение в частности, вероятно, связано с тем, что ER-α была разбросана на протяжении нескольких слоев клеток. Мы старались работать с продольными ломтиками судна (как и другие), но из-за небольшого размера пиальных было трудно справиться сосуды и предотвратить скручивание судов при монтажена слайдах даже с помощью микроскопа. Наконец, мы успешно модифицировать нашу технику с помощью криостата и резки судна крест-накрест в до 8 мкм колец. Кольца более просты в обращении и несколько может быть установлен на одном слайде.
После того как мы приобрели судов мы сочли необходимым проверить эффективность первой вспышки замораживания тканей затем фиксация суда как это было предложено Danseshatalb и партнеров 11. Хотя мы обнаружили, незначительно меньше фонового иммунофлюоресценции, мы также отметили, что рецепторы менее интенсивно окрашенных решений визуализации рецепторов сложнее. Следовательно, мы предпочитаем первый заморозить весь мозг и хранить до необходимости (как правило, от 1-2 месяцев). Затем снять судов, как это описано и исправить судов до нарезки с криостата. как мы демонстрируем здесь.
Необходимым шагом является запуск контроля как с первичными и вторичными антителами отдельноопределить специфику и фоновые иммунофлюоресценции. Эстроген-рецептор α антитела могут быть трудно работать. На самом деле, мы старались 3 различных первичных антител (1 моноклональных и поликлональных 2), прежде чем мы остались довольны успех наших рецепторов окрашивания. Как часть нашего управления мы сначала проверить специфики первичного антитела на бездействие добавления первичного антитела. Рис 2D показывает судна без первичных антител. Существует не окрашивание и немного фонового сигнала. Так как первичные антитела поликлональные, есть некоторые диффузные неспецифические фоне окрашивание. Во-вторых, мы добавили первичных антител, но не вторичными антителами (рис. 2Е). Видно, хороший запас представляющих autofluoresence вдоль границы эндотелия сосудов. Это согласуется с работой Дана и партнеров 5. Однако, ни маленьких точек иммунофлюоресценции, которые представляют ER-α, ни ссылка гранулированный видсобирая присутствии многочисленных рецепторов могут быть обнаружены без сочетания первичных и вторичных антител. Мы отметили, различные структуры autofluoresence вдоль эндотелия кулуарах суда. Эти независимые тесты на антитела специфики важны, поскольку они подтверждают специфичность антител для ER-α и вторичные антитела связываются с первичным.
В заключение, о чем свидетельствуют другие 4, 5 сосудов головного мозга кровью содержат многочисленные ER-α подтип рецепторов. В наших руках, готовя 8 мкм поперечного сечения ломтики из изолированных пиальных артерий повышает окрашивания и визуализации рецепторов. Традиционные методы использования конфокальной микроскопии для изучения образцов. Имея возможность просмотра серийного оптических срезов из толстых образцов важным преимуществом конфокальной микроскопии. Тем не менее, приобретение хорошей конфокальной микроскопии могут быть очень дорогими. С помощью расширенных Глубина (EDF) программного обеспечения, мы обнаружили, чтосможем сократить наши затраты на оборудование. Использование флуоресцентного микроскопа с EDF мы получили четкое изображение и способны визуализировать пиальных артериальной ER-α на нескольких уровнях с использованием Z-стеки. Значительные преимущества программного обеспечения EDF является то, что она позволяет захватывать изображение таким образом, чтобы эффективно создавать 3-D картинки из изображений. Для лабораторий, которые не имеют доступа к конфокальной микроскопии или средств на приобретение один цифровой флуоресцентный микроскоп с присвоили программное обеспечение может быть практичным и менее дорогостоящим вариантом в зависимости от целей исследователя.
Disclosures
Мнения принадлежат авторам и не отражают официальную политику или позицию силовых структур университета Услуги медицинских наук, Министерства обороны или правительства Соединенных Штатов.
Acknowledgments
Работы для этого проекта была поддержана грантами от Национального института здоровья R01-NR5339 и силовых структур университета Услуги медицинских наук, R061LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Smiley, D. A., Khalil, R. A. Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels. Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).
- Miller, V. M., Duckles, S. P. Vascular actions of estrogens: functional implications. Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).
- Duckles, S. P., Krause, D. N. Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action. Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).
- Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).
- Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).
- Fritschy, J. M. Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).
- Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation. Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).
- Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP. Microcirculation. 16, 403-413 (2009).
- Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery. Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).
- Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity. FASEBJ Abstracts. , (2007).
- Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies. J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).
- Lorincz, A., Nusser, Z.
