Summary
L'obiettivo di questo articolo è quello di dimostrare un metodo per ottimizzare la rilevazione immunofluorescenza del recettore degli estrogeni-α (ERα) nel ratto fette piale arteriosa utilizzando un microscopio digitale immunofluorescenza.
Abstract
Molti degli effetti degli estrogeni sulla reattività vascolare sono mediati attraverso l'interazione con i recettori degli estrogeni 1, 2, 3. Anche se due sotto-tipi esistenti (recettore-α e β), il recettore degli estrogeni α è stato identificato sia nella muscolatura liscia e nelle cellule endoteliali dei piale segmenti arteriosi con colorazione fluorescente in combinazione con la microscopia confocale a scansione laser 4. Inoltre, ER-α si trova nel nucleo e nel citoplasma delle arterie basilare ratto 5. I recettori sono abbondanti e reagiscono brillantemente, ma chiara visualizzazione di gruppi distinti di recettori è difficile, probabilmente a causa del numero situato in molti strati di cellule di segmenti di flotta piale. Inoltre, molte relazioni con tecniche di immunoistochimica in coppia con microscopia confocale mal dettaglio i requisiti fondamentali per la riproduzione di esperimenti 6. Il nostro scopo per questo articolo è quello di descrivere una tecnica semplice per ottimizzare le tha colorazione e la visualizzazione di ER-α utilizzando sezioni trasversali delle arteriole piale ottenere dal cervello dei topi femmina. Per prima cosa profumato ratti con il blu di Evans colorante per identificare con facilità le arterie superficie piale che isoliamo sotto un microscopio da dissezione. L'utilizzo di un criostato per tagliare 8 sezioni trasversali micron delle arterie ci permette di ottenere sezioni sottili nave in modo che gli aerei nave differenti sono visualizzati in modo più chiaro. Tagliando la nave piuttosto che l'uso di un segmento piccolo vaso ha il vantaggio di facilitare la visualizzazione degli strati muscolari endoteliali e liscia. Inoltre, l'uso di un microscopio digitale immunofluorescenza con il software di profondità estesa produce immagini chiare di 10-12 aerei nave diversa ed è meno costosa rispetto all'uso di un microscopio confocale a scansione laser.
Protocol
1. Isolamento e preparazione delle arterie Pial
- Mentre il topo è anestetizzato e sicuro inserimento di un catetere in un'arteria e profumato con l'1% blu di Evans in PBS 1X. Vasi piale macchia bene con il colorante blu Evans rendendoli più facili da isolare.
- Estrarre il cervello e conservare a -70 ° C fino al momento dell'uso. In modo ottimale, i cervelli devono essere conservati non più di 2 mesi.
- Utilizzando un microscopio da dissezione rimuovere piale arteriole (diametro medio di 35-50 micron) dalla superficie del cervello. Sfilare delicatamente tutti i blu macchiato arteriole da dorsale e laterale la superficie della corteccia con punta fine pinze. Rimuovere l'eccesso di tessuto aderente corticale prima di mettere nel fissativo.
- Fissare le arteriole raccolte nel 2% paraformaldeide freddo in 0,1 M PBS per 30 min.
- Per preparare il arteriole di sezionamento versare mezzo di inclusione sul congelamento disco / mandrino (fissato a -20 ° C).
- Luogo sezione arteriola piatta sul mandrino uno° attendere che congelare. Saldamente posto la nave in alto a destra sul disco criostato congelamento su mezzi di inclusione con la punta dell'arteria rivolto verso l'alto. Tenerlo con una pinzetta fino a quando non è solidamente congelato.
- Inserire il disco di congelamento con la nave nella testa criostato e tagliare 8 anelli arteriola piale micron con il criostato.
- Montare le sezioni sui vetrini arteriola subbed cromo-potassio gelatina.
- Memorizzare le slide preparate in una scatola di far scorrere in frigorifero a 4 ° C durante la notte.
2. ER-α colorazione immunofluorescenza
Giorno 1
- Rimuovere le diapositive dal frigorifero; portare ciascuno a temperatura ambiente.
- Per lavare le diapositive versare 1-1,5 ml 0,1 M PBS (sufficiente a coprire tutte le sezioni) lasciate riposare per 10 minuti, scolarle e ripetere la procedura altre due volte. Ogni bordo del vetrino è un marker idrofobo. Di conseguenza, il liquido rimane sulla superficie del vetrino. Ad ogni lavaggio il liquido viene versatoe sostituiti con prodotti freschi 0,1 M PBS.
- Incubare i vetrini in 1 ml di cloruro di ammonio 50mM per 30 minuti a temperatura ambiente per ridurre la fluorescenza endogena.
- Lavare i vetrini in PBS 0,1 M 3x10 min. come descritto al punto 2.2
- Diapositive in blocco 0,1% Triton-X 100 più 1% di siero normale di capra (NGS) in PBS per 30 min. per ridurre legame non specifico.
- Incubare i campioni con l'anticorpo primario (coniglio policlonale anti-ER-α, 1:500) in PBS + 0,1% Triton-X + NGS 1% durante la notte a 4 ° C.
Giorno 2
- Rimuovere le diapositive dal frigorifero; portare ciascuno a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini in PBS 0,1 M 3x10 min. come descritto al punto 2.2
- Incubare con verde Oregon 488 secondari anti-coniglio in 1% NGS +0,1% Triton-X100 + PBS per 2 ore al buio a temperatura ambiente. Da questo passo, i prossimi passi deve essere fatto al buio.
- Lavare i vetrini in PBS 0,1 M 3x10 min. come descritto al punto 2.2
- Sotto una ventilated cappuccio, metti 1 goccia di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e mezzi di montaggio a bordo delle navi e poi mettere un vetrino sopra il campione.
- Applicare smalto trasparente lucido per sigillare i bordi del vetrino. Non spostare le diapositive fino a completa asciugatura, che dura circa 24 ore.
3. Digital Imaging di fluorescenza
- Per l'imaging ER-α nel vaso piale fetta si usa una Nikon Eclipse 80i digitale microscopio a fluorescenza con filtri per 3 colori (blu, verde e rosso), dotato di una fotocamera digitale.
- Inserire le diapositive preparate con i segmenti colorati nave piale sotto il microscopio e regolare di visualizzare le aree fluorescente di interesse. Inizio con ingrandimento x100 poi aumentare fino a x600 ingrandimenti.
- Utilizzare la fotocamera per catturare immagini in DAPI (blu) e FITC (verde) canali per nuclei cellulari (DAPI) e ER-α (Oregon verde) utilizzando il software Nikon estesa profondità di messa a fuoco per convertire visualizzare piùs su segmenti di flotta in 2-D immagini.
4. Rappresentante dei risultati:
Abbiamo localizzato il recettore degli estrogeni α in piale vasi arteriosi utilizzando sonde fluorescenti e ottimizzato la nostra visualizzazione del recettore digitale utilizzando la microscopia a fluorescenza. Per rilevare la presenza del recettore, un coniglio anticorpo policlonale primario e di un verde Oregon 488 anticorpo marcato secondario è stato utilizzato per immagine i recettori nelle arterie piale isolato dalla superficie del cervello. Inoltre, un nucleare macchia (DAPI) è stato utilizzato per identificare i nuclei delle cellule e determinare se si potesse rilevare recettori situati nel nucleo dal ER-α è stato segnalato per essere presenti nel cyotosol cellulare e il nucleo. Inoltre, abbiamo condotto esperimenti di conferma per convalidare la specificità dell'anticorpo primario e per verificare vincolante del secondario per l'anticorpo primario.
Figura 1. Colorazione di immunofluorescenza per ER-α (verde) e controcolorazione con DAPI (blu) in un anello arteria piale isolato dal cervello di ratto femmina. Fig. 1A mostra le immagini fuse suggerendo la presenza di alcuni estrogeni intranucleari recettore-a (freccia). Fig. 1B e 1C sono l'immagine focalizzata di ER-α che è una combinazione di Z-stack immagini. Le immagini sono state prese a x600 ingrandimenti e sono l'anello dal taglio delle stessa nave su piani diversi. Le frecce indicano il recettore degli estrogeni α.
Figura 2. Colorazione immunofluorescenza per gruppi di controllo in un anello arteria piale isolato dal cervello di ratto femmina. Fig. 2D mostra la nave senza anticorpo primario. 2E figura mostra la nave senza l'anticorpo secondario (autofluorescenza nota distinta lungo il lato endoteliale). Le immagini sono state prese a x600 ingrandimenti e sono l'anello dal taglio della stessa nave nel different aerei.
Discussion
In precedenza, abbiamo dimostrato che dopo la lesione transitoria globale cerebrale ischemico dell'arteria piale la capacità di cambiare diametro in risposta ad entrambi vasodilatatori 7, 8 e 9 è vasocostrittori marcatamente depressa nei giovani ratti ovariectomizzati. Replezione estrogeni cronica ripristina risposte vasomotorie 7-9. Inoltre, la sostituzione degli estrogeni ritardato inverte gli effetti benefici degli estrogeni sulla capacità di vasodilatazione delle arterie piale 10 che ci porta a chiedersi se a lungo termine l'esaurimento degli estrogeni colpisce ER-α densità nel cerebrovasculature. Abbiamo pianificato di utilizzare l'etichettatura immunofluorescenza combinata con western blotting per valutare le variazioni ER-α espressione in risposta a esaurimento estrogeni cronica. Perché abbiamo avuto qualche difficoltà nella visualizzazione di gruppi distinti di recettori abbiamo modificato il metodo che noi dimostriamo qui. Pertanto, il nostro obiettivo primario in questo studio era quello di sviluppare prima un metodo relativamente semplice per ottimizzare la visualezazione dei recettori nelle arteriole piale. In accordo con diversi rapporti 6,11,12 abbiamo ritenuto necessario per effettuare le regolazioni per il tipo di tessuto siamo stati sondaggio, lo spessore del campione, la distribuzione di ER-α nel serbatoio, così come il grado di legame non specifico .
Il nostro metodo è molto efficace per visualizzare la presenza di ER-α a fette nave piale. Ma, come altri hanno già sottolineato il successo nell'uso di questi metodi è altamente dipendente dalla specificità e le concentrazioni degli anticorpi, la posizione subcellulare delle proteine di interesse, fissazione e protocolli di blocco e la manipolazione dei tessuti 12. Prima di visualizzazione dei nostri preparativi nave abbiamo trascorso il tempo di elaborare tutte queste variabili. Abbiamo evidenziato come abbiamo bisogno di regolare alcuni del nostro approccio in questo documento.
Abbiamo deciso di visualizzare in modo ottimale ER-α nelle arteriole piale e questo ha presentato alcune sfide.In primo luogo, la dimensione media di un'arteria ratto piale è compresa tra 35-50 micron rendendo l'isolamento e la rimozione dalla superficie del cervello un po 'difficile. Abbiamo scoperto che la perfusione con Evans colorante blu prima del sacrificio rende dissezione delle arterie più facile. Blu di Evan possono influenzare la fluorescenza, ma riteniamo che il vantaggio di utilizzare questo colorante superano gli svantaggi minori. Nel nostro protocollo i vasi vengono lavati più volte. Questo riduce al minimo il colorante residuo nei vasi e riduce i possibili effetti del colorante sulla fluorescenza. Un'altra difficoltà che abbiamo incontrato era che lo spessore dei segmenti nave piale reso chiara visualizzazione dei recettori difficile. Inoltre, non siamo riusciti a ottenere immagini particolarmente chiare, probabilmente dovuto al fatto che la ER-α era sparso per tutta strati di cellule diverse. Abbiamo provato a lavorare con fette vaso longitudinale (come altri hanno), ma a causa delle piccole dimensioni piale era difficile da gestire e prevenire i vasi torsione dei vasi durante il montaggiosu diapositive anche utilizzando un microscopio. Infine, siamo riusciti a modificare la nostra tecnica utilizzando un criostato e il taglio della nave trasversale in 8 anelli di micron di spessore. Gli anelli sono più facili da gestire e diverse possono essere montate su una diapositiva.
Una volta che abbiamo acquisito i vasi abbiamo sentito la necessità di testare l'efficacia del primo flash congelamento del tessuto poi fissa i vasi come suggerito da Danseshatalb e collaboratori 11. Anche se abbiamo trovato immunofluorescenza sfondo leggermente meno, abbiamo anche notato che i recettori colorati meno intensamente rendendo la visualizzazione dei recettori più difficile. Di conseguenza, preferiamo prima di congelare l'intero cervello e immagazzinare fino al momento (generalmente compresa tra 1-2 mesi). Abbiamo poi tirare fuori i vasi, come descritto e fissare i vasi prima di affettare con il criostato. come abbiamo dimostrato qui.
Un passo necessario è quello di eseguire i controlli sia con il primario e l'anticorpo secondario separatamenteper determinare la specificità e l'immunofluorescenza sfondo. Recettore α-anticorpi possono essere difficili da lavorare. In effetti, abbiamo provato tre diversi anticorpi primari (1 e 2 monoclonale policlonali) prima eravamo soddisfatti del successo della nostra colorazione recettore. Come parte dei nostri controlli abbiamo prima verificato la specificità dell'anticorpo primario per omissione l'aggiunta dell'anticorpo primario. La figura 2D mostra la nave senza anticorpo primario. Non ci sono macchie e solo un segnale po 'di storia. Dal momento che l'anticorpo primario è policlonale, vi è una certa diffusa non specifica colorazione di fondo. In secondo luogo, abbiamo aggiunto l'anticorpo primario, ma non l'anticorpo secondario (Fig. 2E). Si può vedere un bel margine che rappresenta il autofluoresence lungo i confini endoteliale dei vasi. Ciò è coerente con il lavoro di Dan e collaboratori 5. Tuttavia, né i piccoli punti di immunofluorescenza che rappresentano ER-α, né l'arbitro aspetto granularenando la presenza di numerosi recettori possono essere rilevati senza la combinazione di entrambi gli anticorpi primari e secondari. Abbiamo notato un modello distinto di autofluoresence lungo i margini endoteliale dei vasi. Questi test indipendente per la specificità degli anticorpi sono importanti in quanto confermano la specificità dell'anticorpo per ER-α e l'anticorpo secondario si lega al primario.
In conclusione, come dimostrato da altri 4, 5 vasi sanguigni del cervello contengono numerosi ER-α sottotipo di recettori. Nelle nostre mani, preparare 8μm fette trasversale da isolate arterie piale migliora colorazione e la visualizzazione dei recettori. I metodi tradizionali l'uso di microscopia confocale per esaminare i campioni. Avere la capacità di visualizzare seriale sezioni ottiche da campioni di spessore è un vantaggio importante della microscopia confocale. Tuttavia, l'acquisto di un buon microscopio confocale può essere molto costoso. Utilizzando estesa Profondità (FES) del software, abbiamo trovato chepotrebbero ridurre i nostri costi attrezzature. Utilizzando un microscopio a fluorescenza con EDF abbiamo ottenuto immagini chiare e sono in grado di visualizzare piale arteriosa ER-α su più livelli con Z-stack. Un vantaggio significativo del software EDF è che permette la cattura delle immagini in un modo efficace per creare un 3-D immagine dalle immagini. Per i laboratori che non hanno accesso a un microscopio confocale o i fondi per acquistare un microscopio digitale a fluorescenza con il software appropriato può essere una soluzione pratica e meno costoso a seconda degli obiettivi del ricercatore.
Disclosures
Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non riflettono la politica ufficiale o la posizione dell 'Università Uniformed Servizi di Scienze della Salute, il Dipartimento della Difesa, o il governo degli Stati Uniti.
Acknowledgments
Il lavoro per questo progetto è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health R01-NR5339 e l'Università Uniformed Servizi del Health Sciences-R061LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Smiley, D. A., Khalil, R. A. Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels. Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).
- Miller, V. M., Duckles, S. P. Vascular actions of estrogens: functional implications. Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).
- Duckles, S. P., Krause, D. N. Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action. Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).
- Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).
- Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).
- Fritschy, J. M. Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).
- Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation. Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).
- Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP. Microcirculation. 16, 403-413 (2009).
- Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery. Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).
- Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity. FASEBJ Abstracts. , (2007).
- Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies. J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).
- Lorincz, A., Nusser, Z.
