Summary
Het doel van dit artikel is om een methode aan te tonen immunofluorescentie detectie van oestrogeen receptor-α (ERα) in ratten pial arteriële plakken met behulp van een digitale immunofluorescentie microscoop te optimaliseren.
Abstract
Veel van de effecten van oestrogeen op vasculaire reactiviteit worden gemedieerd door de interactie met oestrogeen-receptoren 1, 2, 3. Hoewel de twee sub-types bestaan (oestrogeen receptor-α en β), heeft oestrogeen receptor-α geïdentificeerd in zowel de gladde spieren en in de endotheelcellen van pial arteriële segmenten met behulp van fluorescerende kleuren, gecombineerd met confocale laser scanning microscopie 4. Verder wordt ER-α in de kernen en in het cytoplasma van de rat basilaire slagaders 5. De receptoren zijn overvloedig en fluoresceren helder, maar heldere visualisatie van discrete groepen receptoren moeilijk is waarschijnlijk te wijten aan de cijfers in vele cellagen van pial schip segmenten. Bovendien zijn veel rapporten met behulp van immunohistochemische technieken gecombineerd met confocale microscopie slecht detail aan de eisen van cruciaal belang voor de voortplanting van experimenten 6. Ons doel voor dit artikel is om een eenvoudige techniek te beschrijven t te optimaliserenHij vlekken en visualisatie van ER-α met behulp van cross-sectionele plakjes pial arteriolen te verkrijgen van vrouwelijke rat hersenen. We hebben eerst perfuseren ratten met Evans blauwe kleurstof om gemakkelijk te bepalen oppervlak pial slagaders die we isoleren onder een dissectie microscoop. Het gebruik van een cryostaat tot 8 micrometer doorsnede van de slagaders slice laat ons toe om dunne vat secties te verkrijgen zodat de verschillende schepen vliegtuigen meer duidelijk gevisualiseerd. Dwars door het schip in plaats van het gebruik van een klein vaartuig segment heeft het voordeel van een betere weergave van de endotheel-en gladde spieren lagen. Daarnaast is het gebruik van een digitale microscoop immunofluorescentie met uitgebreide diepte-software produceert heldere beelden van tien tot twaalf verschillende schepen vliegtuigen en is minder kostbaar dan het gebruik van een confocale laser scanning microscoop.
Protocol
1. Isolatie en Voorbereiding van Pial slagaders
- Terwijl de rat is verdoofd plaatsen en zorgen voor een katheter in een slagader en perfuseren met 1% Evans blauw in 1X PBS. Pial schepen goed vlek met de Evans blauwe kleurstof waardoor ze makkelijker te isoleren.
- Pak de hersenen en bewaar bij -70 ° C totdat het nodig is. Optimaal dienen hersenen niet langer dan 2 maanden worden opgeslagen.
- Met behulp van een dissectie microscoop te verwijderen pial arteriolen (gemiddelde diameter 35-50 micrometer) van het oppervlak van de hersenen. Trek korting op alle de blauw-gekleurde arteriolen van de dorsale en laterale het oppervlak van de cortex met fijne punt tang. Verwijder overtollig aanhangend corticale weefsel voor plaatsing in het fixeermiddel.
- Bevestig de geoogste arteriolen in 2% koud paraformaldehyde in 0,1 M PBS gedurende 30 minuten.
- Ter voorbereiding op de arteriolen voor het snijden giet inbedding medium op de bevriezing disc / chuck (ingesteld bij -20 ° C).
- Plaats arteriole gedeelte plat op de boorkop eennd wachten tot het bevriezen. Stevig plaats van het schip up-rechts op de cryostaat bevriezing schijf op inbedding media met de punt van de slagader naar u toe. Houdt u ze met een pincet totdat het stevig bevroren.
- Plaats de schijf met het bevriezen van het schip in de cryostaat kop en snijd 8 um pial arteriole ringen met de cryostaat.
- Monteer de arteriole secties over chroom-kalium-gelatine subbed dia's.
- Bewaar de voorbereide dia's in een dia doos in de koelkast bij 4 ° C gedurende de nacht.
2. ER-α Immunofluorescente kleuring
Dag 1
- Verwijder de dia's uit de koelkast, breng elk op kamertemperatuur.
- Te wassen de dia's giet 1-1,5 ml 0,1 M PBS (genoeg is om alle afdelingen cover) te laten zitten voor 10 minuten, giet af en herhaal de procedure nog twee keer. Elke rand van de dia heeft een hydrofobe marker. Bijgevolg, de vloeistof blijft op het oppervlak van de dia. Met elke wassen van de vloeistof wordt gegotenen vervangen door verse 0,1 M PBS.
- Broed dia's in 1 ml van 50mm ammoniumchloride gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur de endogene fluorescentie te verminderen.
- Was de dia's in 0,1 M PBS 3x10 minuten. zoals beschreven in 2.2
- Block dia's in 0,1% Triton-X 100 plus 1% normaal geit serum (NGS) in PBS gedurende 30 minuten. om niet-specifieke binding te verminderen.
- Incubeer monsters met het primaire antilichaam (polyklonaal konijn anti-ER-α, 1:500) in PBS + 0,1% Triton-X + 1% NGS overnacht bij 4 ° C.
Dag 2
- Verwijder de dia's uit de koelkast, breng elk op kamertemperatuur.
- Was de dia's in 0,1 M PBS 3x10 minuten. zoals beschreven in 2.2
- Incubeer met Oregon Green 488 secundaire anti-konijn-in-1% NGS +0.1% Triton-X100 + PBS voor 2 uur in het donker bij kamertemperatuur. Vanaf deze stap moet de volgende stappen gedaan worden in het donker.
- Was de dia's in 0,1 M PBS 3x10 minuten. zoals beschreven in 2.2
- Onder een ventilated kap, plaats een druppel van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) plus montage media op de schepen en plaats een deksel glijden over het monster.
- Van toepassing zijn duidelijke nagellak aan de randen van het dekglas afdichting. Beweeg niet de dia's tot het volledig droog, dat duurt ongeveer 24 uur.
3. Digitale Fluorescentie Imaging
- Voor beeldvorming ER-α in de pial vat slice we een Nikon Eclipse 80i digitale fluorescentiemicroscoop gebruik met filters voor drie kleuren (blauw, groen en rood) uitgerust met een digitale camera.
- Plaats de voorbereide dia's met de gekleurde pial vaatsegmenten onder de microscoop en aan te passen aan de fluorescent gelabelde gebieden van belang te visualiseren. Begin bij x100 vergroting vervolgens te verhogen tot X600 vergroting.
- Gebruik de camera om beelden vast te leggen in DAPI (blauw) en FITC (groen) kanalen voor celkernen (DAPI) en ER-α (Oregon Green) met behulp van Nikon Extended diepte Focus software om meerdere te bekijken om te zettens van het schip segmenten in de 2-D beelden.
4. Representatieve resultaten:
We gelokaliseerde oestrogeen receptor-α in pial arteriële vaartuigen die vissen met fluorescerende probes en geoptimaliseerd onze visualisatie van de receptor het gebruik van digitale fluorescentiemicroscopie. Voor het detecteren van de aanwezigheid van de receptor, een konijn polyklonaal primair antilichaam en een Oregon Green 488 gelabelde secundaire antilichaam werd gebruikt om het imago van de receptoren in slagaders pial geïsoleerd van de oppervlakte van de hersenen. Ook een nucleaire vlek (DAPI) werd gebruikt om de celkernen te identificeren en als we konden detecteren receptoren die zich in de kern, omdat ER-α is gemeld aanwezig te zijn in de cel cyotosol en de kern te bepalen. Daarnaast voerden we bevestigende experimenten om de specificiteit van het primaire antilichaam te valideren en om de binding van de secundaire te controleren aan de primaire antilichaam.
Figuur 1. Immunofluorescente kleuring voor ER-α (groen) en tegenkleuring met DAPI (blauw) in een slagader pial ring geïsoleerd van vrouwelijke rat hersenen. Fig. 1A toont de gefuseerde beelden suggereert de aanwezigheid van enkele intranucleaire oestrogeen receptor-a (pijl). Fig. 1B en 1C zijn de gerichte imago van de ER-α, die een combinatie is van Z-stack beelden. Foto's werden genomen op X600 vergroting en zijn afkomstig uit de afgesneden ring van hetzelfde schip in verschillende vlakken. Pijlen geven oestrogeen receptor-α.
Figuur 2. Immunofluorescente kleuring voor controle groepen in een slagader pial ring geïsoleerd van vrouwelijke rat hersenen. Fig. 2D toont het schip zonder primaire antilichaam. Fig. 2E toont het schip, zonder het secundaire antilichaam (let op verschillende autofluorescentie langs het endotheel kant). Foto's werden genomen op X600 vergroting en zijn afkomstig uit de afgesneden ring van hetzelfde schip in different vliegtuigen.
Discussion
Eerder toonden we aan dat na de tijdelijke globale ischemische hersenschade de pial slagader vermogen om met een diameter veranderen als reactie op beide vaatverwijders 7, 8 en 9 vasoconstrictoren duidelijk is depressief bij jonge ratten ovariëctomie. Chronische oestrogeen repletie herstelt vasomotorische reacties 7-9. Verder vertraagde oestrogeen vervangende keert de gunstige effecten van oestrogeen op de pial slagader vaatverwijdende capaciteit van 10 die ons de vraag of op lange termijn oestrogeen uitputting ER-α dichtheid van invloed op in de cerebrovasculature. We waren van plan om immunofluorescentie etikettering gecombineerd met western blotting op veranderingen in de ER-α uitdrukking uit te werken in reactie op chronische uitputting oestrogeen gebruik. Want we hadden enige moeite visualisatie van discrete groepen van receptoren we wijzigde de methode die we zien hier. Daarom is onze primaire doel in deze studie was om eerst de ontwikkeling van een relatief eenvoudige methode om de visuele optimaliserenisering van de receptoren in pial arteriolen. In overleg met verschillende rapporten 6,11,12 vonden we het noodzakelijk om aanpassingen voor het type weefsel waren we sonderen, het monster dikte, de verdeling van de ER-α in het vat, evenals de mate van niet-specifieke binding te maken .
Onze methode is zeer effectief om de aanwezigheid van de ER-α in pial vat plakjes te visualiseren. Maar zoals anderen al eerder gewezen op het succesvol gebruik van deze methoden is sterk afhankelijk van de specificiteit en de concentraties van de antilichamen, de subcellulaire locatie van de eiwitten van belang, fixatie en het blokkeren van protocollen en weefsel handling 12. Voorafgaand aan de visualisatie van ons schip de voorbereidingen brachten we de tijd uit te werken al deze variabelen. We hebben aangetoond hoe wij nodig om sommige van onze aanpak aan te passen in deze krant.
We stellen om optimaal ER-α visualiseren pial arteriolen en dit zijn enkele nieuwe uitdagingen.Ten eerste is de gemiddelde grootte van een rat pial slagader ligt tussen de 35 tot 50 micrometer maken van isolatie en verwijdering uit de hersenen oppervlak enigszins lastig. Wij vonden dat perfusie met Evans blauwe kleurstof voor offer maakt dissectie van de slagaders makkelijker. Evan's blue kan invloed hebben op fluorescentie, maar voelen we dat het voordeel van het gebruik van deze kleurstof zijn kleinere nadelen opwegen tegen. In ons protocol de schepen zijn verschillende malen gewassen. Dit minimaliseert de resterende kleurstof in de vaten en vermindert de mogelijke gevolgen van de kleurstof op fluorescentie. Een andere moeilijkheid die we tegenkwamen was dat de dikte van de pial vaatsegmenten duidelijke visualisatie van de receptoren bemoeilijkt. Daarnaast konden we niet krijgen in het bijzonder heldere beelden waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de ER-α was verspreid over verschillende cellagen. We probeerden het werken met longitudinale schip plakken (zoals anderen al hebben), maar vanwege de kleine omvang pial was het moeilijk om de schepen handvat en het verdraaien van de schepen te voorkomen dat tijdens het monterenop dia's zelfs met behulp van een microscoop. Tot slot hebben we met succes gewijzigd onze techniek met behulp van een cryostaat en snijden van het schip dwars in om 8 urn dik ringen. De ringen zijn makkelijker te hanteren en meerdere kan worden gemonteerd op een dia.
Zodra we verwierf de schepen vonden we het noodzakelijk om de effectiviteit van de eerste flits bevriezen van de weefsel dan de vaststelling van de schepen zoals voorgesteld door Danseshatalb en geassocieerde deelnemingen 11 te testen. Hoewel we vonden iets minder achtergrond immunofluorescentie, hebben we ook opgemerkt dat de receptoren in lood minder intens te maken visualisatie van de receptoren moeilijker. Dus geven we de voorkeur om eerst de gehele hersenen te bevriezen en op te slaan tot het nodig is (over het algemeen tussen de 1-2 maanden). Vervolgens hebben we trekken uit de schepen zoals beschreven en voorafgaand vast de schepen te snijden met de cryostaat. zoals we zien hier.
Een noodzakelijke stap is om de controles uitgevoerd met zowel de primaire als het secundaire antilichaam afzonderlijkspecificiteit en achtergrond immunofluorescentie te bepalen. Oestrogeen receptor-α antilichamen kan het moeilijk zijn om mee te werken. In feite hebben we geprobeerd drie verschillende primaire antilichamen (1 monoklonale en polyklonale 2) voordat we waren tevreden met het succes van onze receptor vlekken. Als onderdeel van onze controles hebben we eerst geverifieerd de specificiteit van het primaire antilichaam door weglating van de toevoeging van het primaire antilichaam. Figuur 2D toont het vat zonder primaire antilichaam. Er is geen vlekken en een klein beetje achtergrond signaal. Omdat het primaire antilichaam is polyklonaal, is er wat diffuse niet-specifieke achtergrond kleuring. Ten tweede, voegden we het primaire antilichaam, maar niet het secundaire antilichaam (fig. 2E). Men kan een mooie marge die de autofluoresence langs de endotheliale grenzen van de schepen. Dit is consistent met het werk van Dan en medewerkers 5. Echter, noch de kleine punten van immunofluorescentie dat ER-α vertegenwoordigen, noch de korrelige uitstraling reflecting de aanwezigheid van een groot aantal receptoren kan worden opgespoord zonder dat de combinatie van zowel de primaire en secundaire antilichamen. We merkten een duidelijk patroon van autofluoresence langs de endotheliale marges van de schepen. Deze onafhankelijke tests voor antilichamen specificiteit zijn belangrijk omdat ze bevestigen dat de specificiteit van het antilichaam voor ER-α en de secundaire antilichaam bindt aan de primaire.
Tot slot, zoals wordt aangetoond door anderen vier, vijf de hersenen de bloedvaten bevatten tal van ER-α sub-type receptoren. In onze handen, het voorbereiden van 8μm dwarsdoorsnede segmenten van geïsoleerde pial slagaders verhoogt de kleuring en visualisatie van de receptoren. Traditionele methoden gebruiken confocale microscopie om de monsters te onderzoeken. Het hebben van de capaciteit om seriële optische secties uitzicht vanaf dikke exemplaren is een belangrijk voordeel van confocale microscopie. Toch kan de aankoop van een goede confocale microscoop zijn erg duur. Door het gebruik van Extended Diepte (EDF) software, vonden we datkunnen verminderen, onze apparatuur kosten. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop met EDF wij van heldere beelden en zijn in staat om pial arteriële ER-α zichtbaar op verschillende niveaus met behulp van Z-stacks. Een belangrijk voordeel van het EOF software is dat het beeld vast te leggen maakt op een manier om effectief creëren van een 3-D beeld van de beelden. Voor laboratoria die geen toegang hebben tot een confocale microscoop of de fondsen te kopen een een digitale fluorescentiemicroscoop met toegeëigend software kan een praktische en minder kostbare optie, afhankelijk van de doelstellingen van de onderzoeker te worden.
Disclosures
De standpunten zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet het officiële beleid of de positie van de geüniformeerde diensten Universiteit van de Health Sciences, het ministerie van Defensie, of de Verenigde Staten de overheid.
Acknowledgments
Het werk voor dit project werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health R01-NR5339 en de geüniformeerde diensten Universiteit van de Health Sciences-R061LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Smiley, D. A., Khalil, R. A. Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels. Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).
- Miller, V. M., Duckles, S. P. Vascular actions of estrogens: functional implications. Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).
- Duckles, S. P., Krause, D. N. Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action. Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).
- Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).
- Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).
- Fritschy, J. M. Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).
- Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation. Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).
- Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP. Microcirculation. 16, 403-413 (2009).
- Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery. Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).
- Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity. FASEBJ Abstracts. , (2007).
- Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies. J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).
- Lorincz, A., Nusser, Z.
