Summary
この記事の目的は、デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラットの軟膜動脈のスライスにエストロゲン受容体α（ERα）の免疫蛍光検出を最適化する方法を示すことです。
Abstract
血管反応性に対するエストロゲンの影響の多くは、エストロゲン受容体1、2、3との相互作用を介して媒介される。 2つのサブタイプ（エストロゲン受容体αとβ）が存在するが、エストロゲン受容体-αは平滑筋の両方で、共焦点レーザー走査顕微鏡4と組み合わせて蛍光染色を使用して軟膜動脈セグメントの内皮細胞で同定されている。さらに、ER -αは核にし、ラットの脳底動脈5の細胞質に位置しています。受容体が豊富で鮮やかな蛍光を発するが、受容体の個別のグループの明確な可視化が困難な可能性軟膜血管セグメントの多くの細胞層にある数字によるものです。さらに、免疫組織化学的手法を用いて多くの報告が不十分な共焦点顕微鏡詳細実験6の再現のための重要な要件とペア。この記事の私達の目的は、tを最適化するために単純な手法を説明することです彼は、染色とER -αの可視化雌ラットの脳から取得軟膜細動脈の断面スライスを使用して。まず、簡単に我々は解剖顕微鏡下で分離面軟膜動脈を識別するために、エバンスブルー色素のラットを灌流。動脈の8μmの断面をスライスするクライオスタットの使用は、その別の船の面がより明確に可視化するので、私たちは、薄い血管のセクションを取得することができます。容器を横断するのではなく、小血管のセグメントを使用すると内皮細胞と平滑筋層の見易さの利点があります。さらに、奥行きを拡張したソフトウェアとデジタル免疫蛍光顕微鏡の使用は10〜12種類の容器の平面の鮮明な画像を生成し、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用するよりも低コストです。
Protocol
1。軟膜動脈の分離と準備
- ラットは麻酔の挿入であり、1X PBSで1％エバンスブルーと動脈と浸み込ませるにカテーテルを固定しながら。軟膜血管は、エバンスブルー色素がそれらを簡単に分離することでうまく染まる。
- 必要になるまで-70℃で脳や店舗を抽出します。最適に、脳はもう2ヶ月以上保管しないようにしてください。
- 解剖顕微鏡を使用すると、脳の表面から軟膜細動脈（平均直径35〜50μm）を取り外します。慎重に先の細いピンセットを用いて皮質の背側および側面からのすべて青に染色された細動脈をやってのける。固定液に入れる前に余分な接着皮質組織を削除します。
- 30分間、0.1M PBS中2％冷パラホルムアルデヒドで収穫した細動脈を修正。
- 切片のために動脈を準備するにはディスク凍結/チャック（-20℃で設定）に埋め込む培地を注ぐ。
- チャック上に平らな場所の細動脈のセクションそれは凍結するためにNDを待つ。しっかりとあなたが直面している動脈の先端でメディアを埋め込むにクライオスタットの冷凍のディスク上に、右の容器を置きます。それがしっかりと凍結されるまで、ピンセットでそれを保持する。
- クライオスタットのヘッドに容器を凍結ディスクを置き、クライオスタットで8μmの軟膜細動脈のリングをカット。
- クロム酸カリウム、ゼラチンsubbedスライド上の細動脈のセクションをマウントします。
- 4℃で一晩冷蔵庫でスライドボックスに準備されたスライドを保管してください。
2。 ER -α免疫蛍光染色
日1
- 冷蔵庫からスライドを外し、室温にそれぞれをもたらす。
- スライドを洗浄するには1〜1.5ミリリットル0.1M PBSは（十分なすべてのセクションをカバーする）、10分間座ってドレインを聞かせてさらに2回の手順を繰り返し注ぐ。スライドの各エッジには、疎水性のマーカーを持っています。その結果、液体は、スライドの表面上に残ります。各洗浄に液体が注がれていますアウトと新鮮0.1 M PBSで置き換え。
- 内因性の蛍光を減らすために、室温で30分間50mmの塩化アンモニウム1ml中のスライドをインキュベートする。
- 0.1M PBS 3 × 10の分でスライドを洗浄します。 2.2で説明するよう
- 0.1％トリトンX - 100に加え、30分間、PBS中の1％正常ヤギ血清（NGS）のブロックスライド。非特異的結合を低減する。
- 一晩4 PBS + 0.1％トリトン- X + 1％NGSで℃、一次抗体（1:500ウサギポリクローナル抗ER -α）でサンプルをインキュベートする
日2
- 冷蔵庫からスライドを外し、室温にそれぞれをもたらす。
- 0.1M PBS 3 × 10の分でスライドを洗浄します。 2.2で説明するよう
- 1％NGS、暗所、室温で2時間のための0.1パーセントトリトン- X100 + PBSでオレゴングリーン488二次抗ウサギでインキュベートする。この段階から、次のステップは、暗所で行う必要があります。
- 0.1M PBS 3 × 10の分でスライドを洗浄します。 2.2で説明するよう
- VEの下でntilatedフード、4'の代わりに1滴、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）を加えた後、マウント船舶上のメディアとサンプルにカバースリップを配置。
- カバースリップの端を密封するために研磨明確な釘を適用します。約24時間かかりますれ、完全に乾燥するまで、スライドを移動しないでください。
3。デジタル蛍光イメージング
- 軟膜血管内イメージングER -αのために我々はデジタルカメラを搭載した3色（青、緑と赤）のためのフィルタを使用してニコンEclipseの組み合わせ例デジタル蛍光顕微鏡を使用してスライス。
- 顕微鏡下で染色された軟膜血管のセグメントを持つ準備されたスライドを挿入し、関心の蛍光標識の領域を可視化するために調整する。 X600倍率に増加してX100倍率で起動します。
- 複数のビューを変換するためにDAPI（青）と細胞核（DAPI）とニコン拡張奥行きのフォーカスのソフトウェアを使用して、ER -α（オレゴングリーン）のFITC（緑）のチャンネルで画像をキャプチャするためにカメラを使用して、2次元画像への血管セグメントのの。
4。代表的な結果：
我々は、ローカライズされた蛍光プローブを使用して軟膜動脈血管におけるエストロゲン受容体-αとデジタル蛍光顕微鏡を用いた受容体の私達の可視化を最適化。受容体の存在を検出するために、ウサギポリクローナル一次抗体およびオレゴングリーン488標識二次抗体は、軟膜動脈の受容体は脳の表面から分離されたイメージに使用されていました。また、核染色（DAPI）細胞核を特定し、ER -αは細胞cyotosolと核に存在することが報告されているので、我々が核にある受容体を検出できるかどうかを判断するために使用された。さらに、我々は一次抗体の特異性を検証し、一次抗体に対する二次の結合を確認するために確証実験を行った。
図1。免疫ER -αの染色（緑）とメスのラットの脳から単離された軟膜動脈のリングにDAPI（青）と対比。図1Aは、いくつかの核内エストロゲン受容体- A（矢印）の存在を示唆してマージされた画像を示しています。図1B及び1Cは、Z -スタック画像の組合せであるER -αの焦点画像です。画像は、X600倍率で撮影し、別の面で同じ容器のカットリングからですした。矢印は、エストロゲン受容体-αを示している。
図2。雌ラットの脳から単離された軟膜動脈のリングでの対照群のための免疫蛍光染色。図2Dは、一次抗体のない容器を示しています。図2Eは、二次抗体（血管内皮側に沿って個別の自家蛍光を注意してください）することなく容器を示しています。画像は、X600倍率で撮影してdiffereで同じ容器のカットリングからですられたNTプレーン。
Discussion
以前、我々は一時的なグローバルな虚血性脳損傷後の血管拡張薬7,8および血管収縮剤9の両方に対応して直径を変更するには軟膜動脈の能力が著しく若い卵巣摘出ラットに押されていることを示した。慢性的なエストロゲンの補充は血管運動応答7-9を復元します。さらに、遅延エストロゲン補充は、私たちは長期的なエストロゲンの枯渇がcerebrovasculatureのER -α濃度に影響を与えるかどうか疑問につながる軟膜動脈血管拡張容量10エストロゲンの有益な効果を逆転。我々は、西部は慢性的なエストロゲンの枯渇に応答して、ER -α発現の変化を評価するためにブロッティングと組み合わせた免疫蛍光ラベルを使用する予定です。我々は受容体の離散群の可視化にいくつかの困難があったので、我々はここで発揮する方法を変更。したがって、本研究で私たちの主な目標は、最初のビジュアルを最適化するために比較的簡単な方法を開発することでした軟膜細動脈における受容体の化。いくつかの報告と一致し6,11,12で私たちがプロービングされた組織の種類、試料の厚さ、容器内のER -αの分布だけでなく、非特異的結合の程度を調整することが必要があると認める。
我々の手法は軟膜血管スライスのER -αの存在を可視化する非常に効果的です。しかし、他の人として以前に、興味、固定、ブロッキングプロトコルと組織の処理12のタンパク質の細胞内局在抗体の特異性と濃度に大きく依存するこれらのメソッドの使用が成功して指摘している。私たちの船の準備の可視化の前に我々はすべてのこれらの変数を動作するように時間を費やしました。我々はこの論文で我々のアプローチのいくつかを調整するために必要な方法強調している。
我々は最適軟膜細動脈にER -αを視覚化するために着手し、これにはいくつかの課題を提示。最初に、ラット軟膜動脈の平均サイズはややトリッキーな脳の表面から分離し、除去すること35から50ミクロンの間である。我々は前にエバンスブルー色素とその灌流犠牲にすることが動脈の解離が容易に発見。エバンスブルーは蛍光影響を与える可能性がありますが、我々はこの染料を使用する利点は、そのマイナーな欠点を上回ると感じている。我々のプロトコルでは船が数回洗浄されています。これは、血管内の残留色素を最小限に抑え、蛍光で染色した場合の影響を低減します。我々が遭遇した別の難しさは、軟膜血管セグメントの厚さは、困難な受容体の明確な可視化を行ったということでした。さらに、我々は、ER -αは、いくつかの細胞層全体に分散されたという事実におそらく原因で、特に明確な画像を得ることができなかった。我々は、長手方向の血管のスライス（他の人が持っているとして）で作業しようとしたが、マウント中のため小さい軟膜サイズには、血管を処理し、血管のねじれを防止することは困難であった顕微鏡を使用していても上をスライドします。最後に、我々が正常にクライオスタットを用いて、8μm厚のリングにクロス賢明な容器を切断することにより私たちのテクニックを変更しました。リングは、扱いやすいといくつかのスライドに取り付けることができます。
かつて我々はDanseshatalbと関連付けます（11）で提案された船を固定して組織を凍結最初のフラッシュの効果をテストすることが必要だと感じたの船舶を取得しました。我々はわずかに少ない背景の免疫蛍光法を見つけたが、我々はまた、受容体が少ない激しく受容体の可視化をより困難に染色したと指摘した。その結果、我々は（一般的に1〜2カ月の間に）必要な時まで先制脳全体および店舗を凍結することを好む。我々は、その後、前述のように船をやってのけるし、クリオスタットでスライスする前に船を固定してください。我々はここに示すように。
一必要なステップは別々に一次と二次抗体の両方でコントロールを実行することです特異性とバックグラウンドの免疫蛍光法を決定する。エストロゲン受容体-α抗体は扱いが困難になる可能性があります。私達は私達の体の染色の成功に満足される前に実際には、我々は3つの異なる一次抗体を（1モノクローナルと2ポリクローナル）を試みた。弊社のコントロールの一環として、まず一次抗体の添加の省略によって一次抗体の特異性を検証する。図2Dは、一次抗体なしで容器を示しています。は染色とほんの少しのバックグラウンドシグナルはありません。一次抗体はポリクローナルであるため、一部のびまん性非特異的なバックグラウンド染色があります。第二に、我々は、一次抗体を加え、ではなく、二次抗体（図2E）。一つは、血管の内皮の境界線に沿ってautofluoresenceを表す素敵なマージンを見ることができます。これは、ダンと関連付けます5の仕事と一貫性があります。しかし、どちらのER -αを表す免疫の小さな点、また粒状の外観を参照数多くの受容体の存在ぶ必要がすることは、プライマリとセカンダリの両方の抗体の組み合わせに検出できます。我々は、血管の内皮縁に沿ってautofluoresenceの異なるパターンを指摘した。彼らはER -αに対する抗体の特異性を確認し、二次抗体が一次的に結合すると抗体の特異性のためのこれらの独立したテストは重要です。
結論では、他の4で示すように、5脳の血管は、多数のER -αサブタイプ受容体が含まれています。私たちの手では、分離された軟膜動脈から8μm断面スライスを準備する染色と受容体の可視化を強化。伝統的な方法は、サンプルを検査する共焦点顕微鏡を使用。厚い標本から連続光学切片を表示する能力を持つことは、共焦点顕微鏡の重要な利点です。しかし、良好な共焦点顕微鏡の購入は非常に高価になることができます。拡張奥行き（EDF）ソフトウェアを使用することにより、我々は、ことがわかった当社の機器のコストを減らすことができる。 EDFと蛍光顕微鏡を用いて、我々は、クリアな画像を取得し、Z -スタックを使用して複数のレベルで軟膜動脈のER -αを視覚化することができます。 EDFのソフトウェアの大きな利点は、それが効果的に画像から3次元画像を作成する方法で、画像キャプチャを可能にするということです。 oneの充当ソフトウェアとデジタル蛍光顕微鏡を購入する共焦点顕微鏡へのアクセスや資金を持っていない研究室のために研究者の目標に応じて実践的かつ低コストのオプションがあります。
Disclosures
見解は著者のものであり、健康科学の制服サービス大学、国防総省、または米国政府の公式政策や立場を反映するものではありません。
Acknowledgments
このプロジェクトのための作業は、保健R01 - NR5339の国立研究所からの補助金と健康科学 - R061LDの制服サービス大学によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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