Summary
इस लेख के लक्ष्य के लिए एक विधि का प्रदर्शन करने के लिए एस्ट्रोजन रिसेप्टर α immunofluorescent चूहे pial धमनी में एक डिजिटल immunofluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग स्लाइस में (ERα) का पता लगाने का अनुकूलन है.
Abstract
संवहनी जेट पर एस्ट्रोजन के प्रभाव के कई एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स 1, 2, 3 के साथ बातचीत के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं. हालांकि दो उप - प्रकार (एस्ट्रोजन रिसेप्टर α और β) मौजूद हैं, एस्ट्रोजन रिसेप्टर α दोनों चिकनी मांसपेशियों और pial धमनी फ्लोरोसेंट लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग 4 के साथ संयुक्त धुंधला का उपयोग क्षेत्रों के endothelial कोशिकाओं में पहचान की गई है . इसके अलावा, ईआर-α और चूहे आधारी धमनियों 5 के cytoplasm में नाभिक में स्थित है. रिसेप्टर्स और चमकीले प्रतिदीप्ति प्रचुर मात्रा में हैं, लेकिन रिसेप्टर्स की असतत समूहों का स्पष्ट दृश्य मुश्किल होने की संभावना है pial पोत क्षेत्रों के कई सेल परतों में स्थित संख्या के कारण. इसके अतिरिक्त, कई immunohistochemical तकनीक का उपयोग कर रिपोर्ट confocal माइक्रोस्कोपी खराब विस्तार से 6 प्रयोगों के प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताओं के साथ जोड़ा. इस लेख के लिए हमारे उद्देश्य के लिए एक सरल तकनीक का वर्णन करने के लिए टी का अनुकूलन हैवह धुंधला हो जाना और ईआर α दृश्य pial arterioles के पार के अनुभागीय स्लाइस का उपयोग महिला चूहे के दिमाग से प्राप्त. हम पहले इवांस नीले रंग के साथ चूहों छिड़कना आसानी से सतह pial धमनियों है जो हम एक विदारक खुर्दबीन के नीचे अलग पहचान है. 8 धमनियों की सुक्ष्ममापी पार वर्गों टुकड़ा cryostat का प्रयोग हमें पतली पोत वर्गों को प्राप्त करने के लिए इतना है कि विभिन्न पोत विमानों और अधिक स्पष्ट रूप से कल्पना कर रहे हैं अनुमति देता है. एक छोटे पोत खंड के उपयोग के बजाय पोत भर काटना endothelial और चिकनी मांसपेशियों की परतों के आसान देखने का लाभ है. इसके अलावा, एक डिजिटल के साथ immunofluorescent खुर्दबीन विस्तारित गहराई सॉफ्टवेयर दस बारह अलग पोत विमानों के स्पष्ट छवियों का उत्पादन और कम एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग की तुलना में महंगा है का उपयोग करें.
Protocol
1. अलगाव और Pial धमनियों की तैयारी
- जबकि चूहे anesthetized डालने और एक और के साथ 1X पीबीएस में 1% इवांस नीले धमनी छिड़कना में एक कैथेटर सुरक्षित. Pial वाहिकाओं इवांस नीले डाई उन्हें अलग करने के लिए आसान बनाने के साथ अच्छी तरह से दाग.
- मस्तिष्क और -70 में दुकान डिग्री सेल्सियस जब तक जरूरत निकालें. बेहतर, दिमाग अब कोई 2 महीने की तुलना में संग्रहित किया जाना चाहिए.
- एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग मस्तिष्क की सतह से pial arterioles (औसत व्यास 35-50 सुक्ष्ममापी) को हटाने. ध्यान पृष्ठीय और पार्श्व ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग प्रांतस्था की सतह से सभी नीले दाग arterioles खींच. लगानेवाला में रखने से पहले अधिक अनुयायी cortical ऊतक निकालें.
- ठीक 30 मिनट के लिए 2% 0.1M पीबीएस में ठंड paraformaldehyde में काटा arterioles.
- सेक्शनिंग लिए arterioles तैयार करने के लिए डिस्क ठंड / चक (-20 डिग्री सेल्सियस पर सेट) पर एम्बेड मध्यम डालना.
- प्लेस चक पर धमनिका फ्लैट अनुभागएन डी के लिए यह फ्रीज करने के लिए इंतजार. मजबूती cryostat ठंड डिस्क पर आप का सामना धमनी की टिप के साथ एम्बेड मीडिया पर पोत सही जगह है. यह चिमटी के साथ पकड़ो जब तक यह मजबूत जमे हुए है.
- पोत के साथ cryostat सिर में ठंड डिस्क प्लेस और cryostat के साथ 8 सुक्ष्ममापी pial धमनिका छल्ले में कटौती.
- क्रोमियम पोटेशियम जिलेटिन subbed स्लाइड्स पर धमनिका वर्गों माउंट.
- स्टोर फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर एक स्लाइड बॉक्स में तैयार स्लाइड.
2. ईआर α Immunofluorescent धुंधला
दिवस 1
- फ्रिज से स्लाइड्स निकालें, प्रत्येक कमरे के तापमान पर लाने के.
- स्लाइड्स धो डालना 1-1.5 मिलीलीटर 0.1M पीबीएस (करने के लिए पर्याप्त सभी वर्गों को कवर) जाने के लिए 10 मिनट के लिए बैठते हैं, नाली और प्रक्रिया को और अधिक दो बार दोहराने. प्रत्येक स्लाइड के किनारे एक hydrophobic मार्कर है. नतीजतन, तरल स्लाइड की सतह पर बनी हुई है. प्रत्येक धोने के साथ तरल डाल दिया हैबाहर और ताजा 0.1 एम पीबीएस के साथ बदल दिया.
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 50mm अमोनियम क्लोराइड का 1 मिलीलीटर में स्लाइड्स सेते अंतर्जात प्रतिदीप्ति कम.
- 0.1M पीबीएस 3x10 मिनट में स्लाइड्स को धो लें. के रूप में 2.2 में वर्णित
- 0.1% 100 Triton एक्स प्लस 1% पीबीएस में सामान्य बकरी (NGS) 30 मिनट के लिए सीरम में ब्लॉक स्लाइड. गैर विशिष्ट बंधनकारी कम.
- पीबीएस में 0.1 +% ट्राइटन - एक्स सी + 1% 4 में रातोंरात NGS °, प्राथमिक (1:500 खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी ईआर-α) एंटीबॉडी के साथ नमूने सेते
2 दिन
- फ्रिज से स्लाइड्स निकालें, प्रत्येक कमरे के तापमान पर लाने के.
- 0.1M पीबीएस 3x10 मिनट में स्लाइड्स को धो लें. के रूप में 2.2 में वर्णित
- 1% 0.1% ट्राइटन-X100 + कमरे के तापमान पर अंधेरे में 2 घंटे के लिए पीबीएस NGS में ओरेगन ग्रीन 488 माध्यमिक विरोधी खरगोश के साथ सेते हैं. इस कदम से, अगले कदम के अंधेरे में किया जाना चाहिए.
- 0.1M पीबीएस 3x10 मिनट में स्लाइड्स को धो लें. के रूप में 2.2 में वर्णित
- Ve के तहतntilated डाकू, 4 'की जगह 1 बूंद, (DAPI) 6 - diamidino-2 - phenylindole से अधिक जहाजों पर बढ़ते मीडिया और तब नमूना पर एक कवर पर्ची जगह.
- स्पष्ट कवर पर्ची के किनारों सील नेल पॉलिश लागू करें. जब तक पूरी तरह से सूखे स्लाइड्स ले जाते हैं, जो लगभग 24 घंटे लगते हैं मत करो.
3. डिजिटल प्रतिदीप्ति इमेजिंग
- के लिए pial बर्तन में ईआर α इमेजिंग टुकड़ा है कि हम 3 (नीले, हरे और लाल) रंग एक डिजिटल कैमरा के साथ सुसज्जित के लिए फिल्टर के साथ एक Nikon ग्रहण 80i डिजिटल फ्लोरोसेंट खुर्दबीन उपयोग.
- खुर्दबीन के नीचे दाग pial पोत क्षेत्रों के साथ तैयार स्लाइड्स सम्मिलित करना और ब्याज की fluorescently लेबल क्षेत्रों कल्पना करने के लिए समायोजित. X100 बढ़ाई प्रारंभ फिर बढ़ाई X600 को बढ़ाने के लिए.
- कैमरे का उपयोग करें DAPI (नीला) और सेल (DAPI) नाभिक और ईआर-α (ओरेगन ग्रीन) Nikon विस्तारित गहराई फोकस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के लिए FITC (हरा) चैनल में छवियों पर कब्जा करने के लिए एकाधिक दृश्य कन्वर्टपोत क्षेत्रों के 2 डी छवियों में.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
हम स्थानीयकृत pial धमनी फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग वाहिकाओं में एस्ट्रोजन रिसेप्टर α और डिजिटल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रिसेप्टर के हमारे दृश्य अनुकूलित. रिसेप्टर, एक खरगोश पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी और एक ओरेगन 488 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी pial मस्तिष्क की सतह से अलग धमनियों में रिसेप्टर्स छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था ग्रीन की उपस्थिति का पता लगाने के लिए. इसके अलावा, एक परमाणु दाग (DAPI) के लिए सेल नाभिक की पहचान करने और निर्धारित अगर हम नाभिक में स्थित रिसेप्टर्स का पता लगाने के बाद ईआर α सेल cyotosol नाभिक में उपस्थित होना करने के लिए सूचित किया गया है हो सकता है इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा, हम पुष्टि प्रयोगों का आयोजन प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता को मान्य करने के लिए और प्राथमिक एंटीबॉडी माध्यमिक के बंधन सत्यापित.
1 चित्रा ईआर α के लिए Immunofluorescent धुंधला (हरा) और एक pial धमनी महिला चूहे के दिमाग से अलग अंगूठी में DAPI (नीला) के साथ counterstaining. चित्र 1A मर्ज किए गए कुछ intranuclear एस्ट्रोजन की उपस्थिति सुझाव छवियों रिसेप्टर (तीर). दिखाता है चित्र 1B और 1C ईआर α ध्यान केंद्रित छवि, जो जेड ढेर छवियों का एक संयोजन है. छवियाँ आवर्धन X600 पर ले जाया गया और विभिन्न विमानों में एक ही पोत की कटौती की अंगूठी से हैं. तीर एस्ट्रोजन रिसेप्टर α संकेत मिलता है.
चित्रा 2 pial धमनी महिला चूहे के दिमाग से अलग अंगूठी में नियंत्रण समूहों के लिए Immunofluorescent धुंधला हो जाना . छवि 2D प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना पोत से पता चलता है. चित्र 2E माध्यमिक एंटीबॉडी (नोट endothelial पक्ष के साथ अलग autofluorescence) के बिना पोत से पता चलता है. छवियाँ आवर्धन X600 पर ले जाया गया और differe में वही पोत की कटौती की अंगूठी से हैंNT के विमानों.
Discussion
इससे पहले, हम पता चला है कि क्षणिक वैश्विक ischemic मस्तिष्क की चोट के बाद pial धमनी दोनों vasodilators के 7, 8 और 9 vasoconstrictors के जवाब में व्यास बदलने की क्षमता स्पष्ट रूप से युवा ovariectomized चूहों में उदास है. जीर्ण एस्ट्रोजन भरा होना vasomotor 7-9 प्रतिक्रियाओं restores. इसके अलावा, देरी एस्ट्रोजन प्रतिस्थापन pial धमनी vasodilatory 10 क्षमता हमें सवाल है कि लंबी अवधि के एस्ट्रोजन रिक्तीकरण cerebrovasculature में ईआर-α घनत्व को प्रभावित करता है प्रमुख पर एस्ट्रोजन का लाभकारी प्रभाव उलट जाती है. हम immunofluorescent पश्चिमी सोख्ता पुरानी एस्ट्रोजन रिक्तीकरण के जवाब में ईआर α अभिव्यक्ति में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के साथ संयुक्त लेबलिंग का उपयोग की योजना बनाई. क्योंकि हम रिसेप्टर्स की असतत समूहों के दृश्य में कुछ मुश्किल था हम तरीका है कि हम यहाँ का प्रदर्शन संशोधित. इसलिए, हमारे प्राथमिक लक्ष्य के लिए इस अध्ययन में पहली बार एक अपेक्षाकृत सरल दृश्य अनुकूलन पद्धति विकसित किया गया थाpial arterioles में रिसेप्टर्स की ization. कई रिपोर्टों के साथ समझौते 6,11,12 में हम ऊतक के प्रकार के लिए समायोजन, हम जांच कर रहे थे नमूना मोटाई, पोत में ईआर α वितरण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर विशिष्ट बंधनकारी की डिग्री करने के लिए यह आवश्यक पाया .
हमारे विधि pial पोत स्लाइस में ईआर α की उपस्थिति की कल्पना के लिए बहुत प्रभावी है. लेकिन के रूप में दूसरों को पहले से बाहर बताया है इन तरीकों के सफल उपयोग विशिष्टता और एंटीबॉडी की सांद्रता, ब्याज निर्धारण, और अवरुद्ध प्रोटोकॉल और ऊतक 12 से निपटने के प्रोटीन की subcellular स्थान पर अत्यधिक निर्भर है . हमारे पोत तैयारी के दृश्य से पहले हम इन सभी चर के लिए बाहर काम करने का समय बिताया. हम कैसे हम इस पत्र में हमारे दृष्टिकोण में से कुछ को समायोजित करने की जरूरत पर प्रकाश डाला है.
हम बाहर सेट के लिए बेहतर pial arterioles में ईआर α कल्पना और यह कुछ चुनौतियां पेश की.सबसे पहले, एक चूहे pial धमनी की औसत आकार 35-50 सुक्ष्ममापी के बीच अलगाव और मस्तिष्क की सतह से हटाने के कुछ पेचीदा बनाने है. हम इवांस नीले बलिदान करने के लिए पहले डाई धमनियों का विच्छेदन आसान बनाता है के साथ पाया है कि छिड़काव. इवान नीले रंग प्रतिदीप्ति को प्रभावित कर सकते हैं, लेकिन हमें लगता है कि इस डाई का उपयोग करने का लाभ मामूली नुकसान पल्ला झुकना. हमारे प्रोटोकॉल में जहाजों कई बार धोया जाता है. यह वाहिकाओं में अवशिष्ट डाई minimizes और प्रतिदीप्ति पर डाई के संभावित प्रभावों को कम कर देता है. हम एक और कठिनाई का सामना करना पड़ा था कि pial पोत क्षेत्रों की मोटाई मुश्किल रिसेप्टर्स की स्पष्ट दृश्य बनाया. इसके अतिरिक्त, हम शायद तथ्य यह है कि ईआर α कई सेल परतों भर में बिखरे हुए किया गया था की वजह से विशेष रूप से स्पष्ट छवियों को प्राप्त नहीं कर सका. हम अनुदैर्ध्य पोत स्लाइस (के रूप में दूसरों) के साथ काम करने की कोशिश की, लेकिन छोटे pial आकार के कारण यह मुश्किल था वाहिकाओं को संभालने और जहाजों की घुमा रोकने जबकि बढ़तेपर भी स्लाइड एक खुर्दबीन का उपयोग कर. अंत में, हम सफलतापूर्वक एक cryostat का उपयोग और 8 सुक्ष्ममापी मोटी छल्ले में वार पार काटने पोत द्वारा हमारी तकनीक को संशोधित. छल्ले को संभालना आसान हैं और एक स्लाइड पर कई घुड़सवार किया जा सकता है.
एक बार जब हम वाहिकाओं हम पहले ऊतक तो ठंड वाहिकाओं फिक्सिंग Danseshatalb और 11 सहयोगियों द्वारा सुझाए गए के रूप में फ्लैश की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए यह आवश्यक लगा हासिल कर ली. हालांकि हम मामूली कम पृष्ठभूमि immunofluorescence पाया, हम यह भी कहा कि रिसेप्टर्स कम तीव्रता रिसेप्टर्स के दृश्य और अधिक कठिन बना दाग. नतीजतन, हम करने के लिए पहली पसंद करते हैं पूरे मस्तिष्क को स्थिर और स्टोर जरूरत जब तक (आम तौर पर बीच 1-2 महीने). हम फिर से के रूप में वर्णित वाहिकाओं को खींचने के लिए और जहाजों cryostat के साथ टुकड़ा करने की क्रिया से पहले ठीक है. के रूप में हम यहाँ प्रदर्शित करता है.
एक आवश्यक कदम के लिए दोनों को प्राथमिक और माध्यमिक अलग एंटीबॉडी के साथ नियंत्रण को चलाने के लिए हैविशिष्टता और पृष्ठभूमि immunofluorescence निर्धारित. एस्ट्रोजन रिसेप्टर α एंटीबॉडी के साथ काम करने के लिए मुश्किल हो सकता है. वास्तव में, हम 3 अलग प्राथमिक एंटीबॉडी (1 मोनोक्लोनल और 2 पॉलीक्लोनल) की कोशिश की इससे पहले कि हम हमारे रिसेप्टर धुंधला की सफलता से संतुष्ट थे. हमारे नियंत्रण के हिस्से के रूप में हम पहले प्राथमिक एंटीबॉडी के अलावा की चूक द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता सत्यापित. चित्रा 2 डी प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना पोत से पता चलता है. वहाँ कोई धुंधला हो जाना और सिर्फ एक छोटी सी पृष्ठभूमि संकेत है. चूंकि प्राथमिक एंटीबॉडी पॉलीक्लोनल है, वहाँ कुछ फैलाना गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना है. दूसरे, हम प्राथमिक एंटीबॉडी कहा, लेकिन माध्यमिक (छवि 2E) नहीं एंटीबॉडी. एक अच्छा मार्जिन वाहिकाओं के endothelial सीमाओं के साथ autofluoresence का प्रतिनिधित्व देख सकते हैं. इस दान और 5 सहयोगियों के साथ काम अनुरूप है. हालांकि, न तो छोटे अंक immunofluorescence की, कि ईआर α का प्रतिनिधित्व करते हैं और न ही बारीक उपस्थिति रेफरीकई रिसेप्टर्स की उपस्थिति lecting दोनों प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन के बिना पता लगाया जा सकता है. हम वाहिकाओं के endothelial मार्जिन के साथ autofluoresence के एक विशिष्ट स्वरूप का उल्लेख किया. एंटीबॉडी विशिष्टता के लिए इन स्वतंत्र परीक्षण महत्वपूर्ण हैं के रूप में वे ईआर α के लिए एंटीबॉडी की विशिष्टता की पुष्टि और माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक बांध.
अंत में, के रूप में 4 अन्य लोगों द्वारा प्रदर्शन, 5 मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं कई ईआर α उप प्रकार रिसेप्टर्स होते हैं. हमारे हाथ में, पृथक pial धमनियों से 8μm पार अनुभागीय स्लाइस की तैयारी धुंधला हो जाना और रिसेप्टर्स के दृश्य को बढ़ाता है. पारंपरिक तरीकों confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए नमूनों की जांच. मोटी नमूनों से धारावाहिक ऑप्टिकल वर्गों को देखने की क्षमता होने confocal माइक्रोस्कोपी का एक महत्वपूर्ण लाभ है. हालांकि, एक अच्छा confocal सूक्ष्मदर्शी की खरीद बहुत महंगा हो सकता है. विस्तारित गहराई (EDF) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, हम में पाया गया किहमारे उपकरणों की लागत को कम कर सकता है. EDF के साथ एक फ्लोरोसेंट सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग हम स्पष्ट चित्र प्राप्त की और Z-ढेर का उपयोग कर कई स्तरों पर pial धमनी ईआर-α कल्पना करने में सक्षम हैं. EDF सॉफ्टवेयर का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह एक तरीके को प्रभावी ढंग से छवियों से एक 3 - डी तस्वीर बनाने में छवि पर कब्जा परमिट. प्रयोगशालाओं है कि एक confocal खुर्दबीन या एक विनियोजित सॉफ्टवेयर के साथ एक डिजिटल फ्लोरोसेंट खुर्दबीन खरीद के लिए धन के लिए उपयोग नहीं है के लिए एक व्यावहारिक और कम महंगा विकल्प अन्वेषक के लक्ष्यों के आधार पर हो सकता है.
Disclosures
विचार व्यक्त उन लेखकों की हैं और सरकारी या वर्दीधारी सेवाओं स्वास्थ्य विज्ञान विश्वविद्यालय, रक्षा विभाग, या संयुक्त राज्य अमेरिका की सरकार की नीति की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं.
Acknowledgments
इस परियोजना के लिए काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य R01-NR5339 संस्थान से अनुदान और स्वास्थ्य विज्ञान - R061LD के वर्दीधारी सेवाओं विश्वविद्यालय के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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