Summary
Målet med denna artikel är att visa en metod för att optimera immunofluorescens detektion av östrogenreceptor-α (ERα) i råtta pial arteriella skivor med hjälp av en digital immunofluorescens mikroskop.
Abstract
Många av östrogenets effekter på vaskulära reaktivitet förmedlas genom interaktion med östrogenreceptorer 1, 2, 3. Även två subtyper finns (östrogen receptor-α och β) har östrogenreceptorn-α identifierats i såväl den glatta muskulaturen och i endotelceller i pial arteriell segment med hjälp av fluorescerande infärgning i kombination med konfokala laserskanning mikroskopi 4. Dessutom är ER-α som ligger i kärnan och i cytoplasman av artärerna råtta basilaris 5. Receptorerna finns i överflöd och fluorescerar starkt, men tydlig visualisering av diskreta grupper av receptorer är svårt sannolikt på de nummer som finns i många cellager av pial fartygssegment. Dessutom har många rapporter med hjälp av immunhistokemiska tekniker paras ihop med konfokalmikroskopi dåligt detalj de krav kritiska för reproduktion av experiment 6. Vårt syfte för denna artikel är att beskriva en enkel teknik för att optimera tHan färgning och visualisering av ER-α med tvärsnittsstudier skivor av pial arterioler få från kvinnliga råttors hjärnor. Vi BEGJUTA first råttor med Evans blå färg för att enkelt identifiera ytan pial artärer som vi isolera under ett dissekera mikroskop. Användning av en kryostat att skära 8 ìm tvärsnitt av artärerna ger oss möjlighet att få tunna kärl sektioner så att olika fartyg plan tydligare visualiseras. Spänner över fartyget istället för att använda ett litet fartyg segment har fördelen av enklare visning av endotel-och glatta muskelceller lager. Dessutom används en digital immunofluorescens mikroskop med utökad djup programvara ger tydliga bilder av tio till tolv olika fartyg flygplan och är billigare än användningen av en konfokala laserskanning mikroskop.
Protocol
1. Isolering och Beredning av Pial artärerna
- Medan råttan är sövda in och säkra en kateter i en artär och BEGJUTA med 1% Evans blå i 1X PBS. Pial fartyg fläcken väl med Evans blå färg vilket gör dem enklare att isolera.
- Utdrag hjärnan och förvara vid -70 ° C tills det behövs. Optimalt ska hjärnor lagras längre än 2 månader.
- Med hjälp av en dissekera mikroskop bort pial arterioler (genomsnittlig diameter 35-50 mikrometer) från ytan av hjärnan. Dra försiktigt av alla blå-färgade arterioler från rygg-och laterala ytan av hjärnbarken med spetsig pincett. Ta bort överflödig anhängare kortikal vävnad innan det placeras i fixativ.
- Fäst den skördade arterioler hos 2% kallt paraformaldehyd i 0,1 miljoner PBS i 30 min.
- För att förbereda arterioler för sektionering häll bädda medium på att frysa skivan / chuck (inställd på -20 ° C).
- Placera arteriole avsnitt platt på chucken ennd vänta på att frysa. Fast plats på fartyget upp till höger på kryostat frysa skivan på bädda media med spetsen i artären mot dig. Håll den med pincett tills den är fast frusen.
- Placera frysa skivan med fartyget i kryostat huvudet och skär 8 ìm pial arteriole ringer med kryostat.
- Montera arteriole avsnitten om krom-kalium-gelatin Subbed diabilder.
- Förvara beredd bilder i ett bildspel ruta i kylskåp vid 4 ° C över natten.
2. ER-α immunofluorescens färgning
Dag 1
- Ta bort bilder från kylskåpet, ta med varje till rumstemperatur.
- Att tvätta objektglasen häll 1-1,5 ml 0,1 M PBS (tillräckligt för att täcka alla avsnitt) låt sitta i 10 minuter, avlopp och upprepa proceduren ytterligare två gånger. Varje kant av bilden har en hydrofob markör. Följaktligen förblir flytande på ytan av bilden. Med varje tvätt vätskan hällsut och ersätts med nya 0,1 M PBS.
- Inkubera objektglasen i 1 ml 50 mM ammoniumklorid i 30 min i rumstemperatur för att minska endogen fluorescens.
- Tvätta bilder i 0,1 miljoner PBS 3x10 min. som beskrivs i 2,2
- Blockera bilder i 0,1% Triton-X 100 plus 1% normala get serum (NGS) i PBS i 30 min. att reducera icke-specifik bindning.
- Inkubera prov med den primära antikroppen (kanin polyklonala anti-ER-α, 1:500) i PBS + 0,1% Triton-X + 1% NGS över natten vid 4 ° C.
Dag 2
- Ta bort bilder från kylskåpet, ta med varje till rumstemperatur.
- Tvätta bilder i 0,1 miljoner PBS 3x10 min. som beskrivs i 2,2
- Inkubera med Oregon Grön 488 sekundärt anti-kanin i 1% NGS 0,1% Triton-X100 + PBS för 2 timme i mörker vid rumstemperatur. Från detta steg måste nästa steg göras i mörker.
- Tvätta bilder i 0,1 miljoner PBS 3x10 min. som beskrivs i 2,2
- Enligt en ventilated huven, placera en droppe 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) plus montering media på fartyg och sedan placera ett täckglas över provet.
- Applicera klart nagellack att försegla kanterna på locket halka. Flytta inte glider fram helt torr, vilket tar cirka 24 timmar.
3. Digital fluorescens avbildning
- För avbildning ER-α i pial fartyget slice vi använder en Nikon Eclipse 80i digitala fluorescerande mikroskop med filter för 3 färger (blå, grön och röd) utrustad med en digitalkamera.
- Sätt in den förberedda bilderna med färgade pial fartygssegmenten under mikroskop och justera för att visualisera fluorescerande intresseområden. Start kl X100 förstoring sedan öka till X600 förstoringen.
- Använda kameran för att ta bilder i DAPI (blå) och FITC (grön) kanaler för cellkärnor (DAPI) och ER-α (Oregon Grön) med Nikon Extended Djup Fokus för att konvertera flera ses av fartygssegment i 2-D bilder.
4. Representativa resultat:
Vi lokaliserade östrogenreceptor-α i pial arteriella fartyg som använder fluorescerande prober och optimerat vår visualisering av receptorn med hjälp av digital fluorescensmikroskopi. Att upptäcka förekomst av receptorn, en kanin polyklonala primära antikroppar och ett Oregon Grön 488 som heter sekundär antikropp användes för att bilden av receptorer i pial artärer isolerade från ytan av hjärnan. Också en nukleär fläck (DAPI) användes för att identifiera cellkärnor och avgöra om vi kunde upptäcka receptorer i kärnan eftersom ER-α har rapporterats att vara närvarande i cellen cyotosol och kärnan. Dessutom genomförde vi bekräftande experiment för att verifiera specificiteten för den primära antikroppen och för att kontrollera bindning av sekundärt till den primära antikroppen.
Figur 1. Immunofluorescerande färgning för ER-α (grön) och motfärgning med DAPI (blå) i en pial artär ring isolerade från kvinnliga råtta hjärnan. Fig 1a visar det sammanslagna bilderna på förekomst av vissa intranuclear östrogenreceptor-en (pil). Fig. 1B och 1C är fokuserad bild av ER-α som är en kombination av Z-stack bilder. Bilderna togs vid X600 förstoring och är från den skurna ring samma fartyg i olika plan. Pilarna anger östrogenreceptorn-α.
Figur 2. Immunofluorescerande färgning för kontroll grupper i en pial artär ring isolerade från kvinnliga råtta hjärnan. Fig. 2D visar fartyget utan primär antikropp. Fig 2E visar fartyget utan sekundär antikropp (observera olika autofluorescens längs endothelial sida). Bilderna togs vid X600 förstoring och är från den skurna ring i samma fartyget i different plan.
Discussion
Tidigare visade vi att efter transitorisk global ischemisk hjärnskada i pial artären förmåga att ändra diametern som svar på båda vasodilaterare 7, 8 och kärlsammandragande 9 markant är deprimerad hos unga ovariektomerade råttor. Kronisk östrogen fylla upp återställer vasomotoriska reaktioner 7-9. Vidare vänder försenat östrogen de gynnsamma effekterna av östrogen på pial artär vasodilaterande kapacitet 10 leder oss till frågan om långsiktiga östrogen utarmning påverkar ER-α täthet i cerebrovasculature. Vi planerade att använda immunofluorescens märkning i kombination med Western blotting för att utvärdera förändringarna i ER-α uttryck som svar på kronisk östrogen utarmning. Eftersom vi hade vissa svårigheter att visualisering av diskreta grupper av receptorer vi ändrade den metod som vi visar här. Därför var vårt främsta mål i denna studie att först utveckla en relativt enkel metod för att optimera den visuellasering av de receptorer i pial arterioler. I samförstånd med flera rapporter 6,11,12 vi fann det nödvändigt att göra justeringar för den typ av vävnad var vi sondera, prov tjocklek, fördelningen av ER-α i fartyget, liksom graden av icke-specifik bindning .
Vår metod är mycket effektiv för att visualisera förekomst av ER-α i pial fartyget skivor. Men som andra har tidigare påpekat en framgångsrik användning av dessa metoder är starkt beroende av specificitet och koncentrationer av antikroppar, subcellulära platsen för proteiner av intresse, fixering och blockera protokoll och vävnad hantering 12. Innan visualisering av vårt fartyg förberedelser vi tillbringade tid att räkna ut alla dessa variabler. Vi har visat hur vi behövs för att anpassa några av våra förhållningssätt i detta dokument.
Vi bestämde oss för att optimalt i pial arterioler visualisera ER-α och detta presenteras några utmaningar.För det första är den genomsnittliga storleken på en råtta pial pulsåder mellan 35-50 ìm gör isolering och borttagande från hjärnan ytan lite knepigt. Vi fann att perfusion med Evans blå färg innan offra gör dissekering av artärerna lättare. Evan blå kan påverka fluorescens, men vi anser att fördelen med att använda denna färg uppväger de små nackdelarna. I våra protokoll kärlen tvättas flera gånger. Detta minimerar Restfärg i kärlen och minskar de möjliga effekterna av färgen på fluorescensen. En annan svårighet vi stötte på var att tjockleken på pial fartygssegmenten klargjort visualisering av receptorer svårt. Dessutom kan vi få inte särskilt tydliga bilder förmodligen beror på att ER-α var utspridda i flera cellager. Vi försökte att arbeta med längsgående fartyg skivor (som andra har), men på grund av den lilla pial storlek var det svårt att hantera fartyg och förhindra vridning av fartygen medan monteringpå bilder även med hjälp av ett mikroskop. Slutligen ändrade vi framgångsrikt vår teknik med hjälp av en kryostat och skära fartyget korsvis i till 8 ìm tjocka ringar. Ringarna är lättare att hantera och flera kan monteras på en bild.
När vi förvärvade fartygen vi ansåg det nödvändigt att testa effektiviteten av första blixten frysa vävnaden så om fastställande av fartyg som föreslagits av Danseshatalb och medarbetare 11. Även om vi hittade marginellt mindre bakgrunden immunofluorescens, noterade vi också att receptorerna färgade mindre intensivt vilket gör visualisering av receptorer svårare. Därför föredrar vi att först frysa hela hjärnan och lagra tills det behövs (i regel mellan 1-2 månader). Vi drar då av de fartyg som beskrivs och fixa fartygen innan skivning med kryostat. som vi visar här.
Ett nödvändigt steg är att köra kontroller med både den primära och den sekundära antikroppen separatatt bestämma specificitet och bakgrund immunofluorescens. Östrogenreceptor-α-antikroppar kan vara svårt att arbeta med. I själva verket försökte vi 3 olika primära antikroppar (1 monoklonala och polyklonala 2) innan vi var nöjda med framgången för vår receptorn färgning. Som en del av våra kontroller har vi verifierat först specificitet den primära antikroppen genom utelämnandet av tillägget av den primära antikroppen. Figur 2D visar fartyget utan primär antikropp. Det finns ingen färgning och bara en liten bakgrund signal. Eftersom den primära antikroppen är polyklonala det finns någon diffus icke-specifik bakgrundsfärgning. För det andra har vi lagt den primära antikroppen, men inte sekundär antikropp (bild 2E). Man kan se en fin marginal representerar autofluoresence längs endothelial gränser fartyg. Detta är förenligt med arbetet Dan och medarbetare 5. Men varken de små punkter immunofluorescens som representerar ER-α, eller granulat utseende reflecting närvaron av många receptorer kan upptäckas utan att en kombination av både primära och sekundära antikroppar. Vi noterade ett tydligt mönster av autofluoresence längs endothelial utkanten av fartyg. Dessa oberoende tester för antikroppar specificitet är viktiga eftersom de bekräftar specificiteten av antikroppen för ER-α och sekundär antikropp binder till den primära.
Sammanfattningsvis, vilket framgår av andra 4, 5 hjärnans blodkärl innehåller många ER-α subtyp receptorer. I våra händer, förbereda 8μm tvärsnittsarea skivor från enstaka pial artärer ökar färgning och visualisering av receptorer. Traditionella metoder använder konfokalmikroskopi att undersöka proverna. Att ha förmågan att se seriell optisk avsnitt från tjocka prover är en viktig fördel med konfokalmikroskopi. Dock kan köpa en bra konfokalmikroskop vara mycket dyrt. Genom att använda Extended Djup (EDF) programvara, fann vi attskulle kunna minska våra kostnader för utrustning. Med hjälp av en fluorescerande mikroskop med EDF vi fått tydliga bilder och kan visualisera pial arteriell ER-α på flera nivåer med hjälp av Z-stackar. En betydande fördel av EUF programvara är att det tillåter ta bilder på ett sätt att effektivt skapa en 3-D bild från bilderna. För laboratorier som inte har tillgång till en konfokalmikroskop eller medel för att köpa en digital fluorescerande mikroskop med disponeras programvara kan vara en praktisk och mindre kostsamt alternativ beroende på målen för utredaren.
Disclosures
De synpunkter som är författarnas egna och speglar inte den officiella politiken eller ställning i den uniformerade Services University of the Health Sciences, Department of Defense, eller USA: s regering.
Acknowledgments
Arbetet för detta projekt har finansierats med bidrag från National Institutes of Health R01-NR5339 och den uniformerade Services University of the Health Sciences-R061LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Smiley, D. A., Khalil, R. A. Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels. Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).
- Miller, V. M., Duckles, S. P. Vascular actions of estrogens: functional implications. Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).
- Duckles, S. P., Krause, D. N. Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action. Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).
- Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).
- Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).
- Fritschy, J. M. Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).
- Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation. Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).
- Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP. Microcirculation. 16, 403-413 (2009).
- Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery. Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).
- Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity. FASEBJ Abstracts. , (2007).
- Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies. J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).
- Lorincz, A., Nusser, Z. Specificity of immunoreactants. J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).
