Avaliação longitudinal do rato Perda Hind Limb óssea após lesão medular usando Novel, In vivo Metodologia,

Summary

Um exame longitudinal de perda óssea nos fêmures e tíbias de ratos adultos foi realizada após uma lesão da medula espinhal usando seqüencial de baixa dose de raios-X scans. Tibia perda óssea foi detectada ao longo do estudo, enquanto a perda óssea no fêmur não foi detectado até 40 dias após a lesão.

Abstract

Lesão da medula espinal (SCI) é muitas vezes acompanhada de osteoporose nas regiões sublesional da pelve e membros inferiores, levando a uma maior freqüência de fraturas ^1. À medida que essas fraturas ocorrem frequentemente em regiões que perderam função sensorial normal, o paciente está em um risco maior de patologias fratura-dependente, incluindo a morte. SCI-dependente perda na densidade mineral óssea (DMO, gramas / cm ²⁾ e conteúdo mineral ósseo (BMC, gramas) tem sido atribuída ao desuso mecânicos ^{2, 3} neuronal aberrante sinalização e alterações hormonais ^4. O uso de modelos de roedores da SCI osteoporose induzida pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de osteoporose após uma lesão medular, bem como um ambiente de teste para a geração de novas terapias ^5-7 (e revisto em ^8). Modelos de mouse da SCI são de grande interesse uma vez que permitem uma abordagem reducionista ao mecanismo de ba-avaliação sed através do uso de camundongos nulos e transgênicos. Embora tais modelos têm fornecido dados importantes, ainda há uma necessidade de minimamente invasiva, métodos fiáveis, reprodutíveis e quantificáveis ​​na determinação da extensão da perda óssea após uma lesão medular, particularmente ao longo do tempo e dentro do mesmo grupo de animais de experimentação, para melhorar o diagnóstico , métodos de tratamento e / ou prevenção de osteoporose induzida por SCI.

Um método ideal para medir a densidade óssea em roedores permitiria várias exposições, seqüencial (ao longo do tempo) para baixo os níveis de radiação de raios X. Este estudo descreve o uso de um scanner de todo o novo animal, o IVIS Lumina XR (Caliper Instruments) que podem ser usados ​​para fornecer baixa energia (miligray 1-3 (mGy)) de alta resolução e de alta ampliação radiografias dos ossos do mouse hind membro ao longo do tempo após uma lesão medular. Perda de densidade óssea significativa foi vista no tíbias de ratos por 10 dias pós-espinhal transecção quando comparado ao não lesionado, controle pareados por idade (naïve) ratos (13% de redução, p <0,0005). Perda de densidade óssea no fêmur distal também foi detectável por 10 dias pós-SCI, enquanto que uma perda de densidade no fêmur proximal não foi detectado até 40 dias após a lesão (diminuição de 7%, p <0,05). SCI-dependente perda de densidade do fêmur do rato foi confirmado post-mortem através do uso de Dual-energy X-ray Absorciometria (DXA), "padrão ouro" a corrente para medições de densidade óssea. Nós detectamos uma perda de 12% do BMC nos fêmures de ratos aos 40 dias pós-SCI usando o IVIS Lumina XR. Isso se compara favoravelmente com uma perda BMC anteriormente relatados de 13,5% por Picard e colegas que usaram a análise DXA no mouse fêmures post-mortem 30 dias pós-SCI ^9. Nossos resultados sugerem que o IVIS Lumina XR fornece um romance, o método high-resolution/high-magnification para a realização de longo prazo, medidas longitudinal da densidade óssea em membros posteriores do rato após uma lesão medular.

Protocol

1. Rato modelo transecção da coluna vertebral

1. Adultos, machos, C57BL6 ratos (aproximadamente 20-25 g) são anestesiados com uma combinação de quetamina (200 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados em um Institucionais, suite IACUC-aprovado cirúrgica em condições estéreis.
2. Uma vez anestesiados profundamente, a pele das costas é cortado usando cortadores elétricos. A parte de trás raspada é primeiro limpo com uma solução de iodo seguida de etanol 70%.
3. Antes da incisão inicial, a área das costas a ser incisada é o primeiro infiltrado com um anestésico local (Marcaine) a uma concentração de (0,25%, <1ml/kg) para minimizar a dor pós-operatória.
4. Com uma tesoura pequena, uma pequena abertura é feita na pele em torno da área de L2. Esta abertura é ampliada com o mesmo conjunto de tesouras, estendendo-se longitudinalmente para a área de T2. As bordas da pele são, então, realizada à parte através do uso de grampos bulldog.
5. Micro-tesoura são então usadospara limpar o tecido muscular a partir da lâmina dorsal espinhal a nível torácico 8 (T8). T8 pode ser identificado como descrito no Kuh e Wrathall (1998) ^10. Resumidamente, T13 pode ser identificado pelo seu processo espinhoso dorsal. Usando um par de fórceps # 5 Dumont, a última costela pode ser palpada / identificadas e contadas de volta para T8. Uma vez liberado, Rongeurs ossos são usados ​​para executar uma laminectomia dorsal em T8.
6. Lesão Transecção completa da Coluna Vertebral: Uma vez que a medula espinhal é exposta em T8, um conjunto adicional de micro-tesoura esterilizada são usados ​​para cortar a medula espinhal no plano perpendicular ao eixo longitudinal do cabo sob um microscópio cirúrgico. Nós usamos uma pinça # 5 Dumont para levantar delicadamente um pólo da medula espinhal para confirmar a integridade da lesão.
7. Após transecção da coluna vertebral, um pequeno pedaço de gelfoam estéril, embebida em solução salina estéril (0,9%) é cuidadosamente colocado na cavidade lesão para promover a hemostasia.
8. Uma peça adicional de gelfoam é então colocado sobre o spin expostoscabo de al. A pele é então fechada com estéril, em aço inoxidável grampos cirúrgicos. Temas são, então, voltou para suas gaiolas de casa, colocado em uma toalha de papel para evitar a aspiração do material de cama e aquecido com uma almofada de aquecimento por um período de aproximadamente 12 horas. Assuntos também são fornecidos com pacotes de hidrogel (ClearH2O) e grãos de ração no chão de suas jaulas durante a recuperação precoce. Assuntos feridos são capazes de acesso a alimentos / água em suas gaiolas de casa uma vez recuperado da anestesia.
9. Todos os indivíduos feridos recebem duas vezes por dia evacuações bexiga manual (em aproximadamente 12 horas), utilizando uma modificação do método manual de Crede para a duração do estudo (40 dias).
10. Camundongos feridos também são fornecidos com duas vezes por dia injeções intraperitoneal de 0,9% por três dias (0,5 cc) para ajudar a manter a hidratação, e duas vezes injeções diárias da buprenorfina opiáceos (0,05 mg / kg) para controlar a dor pós-operatória por um período de 5 dias. Se os animais apresentam sinais of dor após o período inicial de cinco dias, eles receberiam adicional buprenorfina (0,05 mg / kg) por dia até que os sinais de dor (mobilidade reduzida, estatura arqueada, a incapacidade de vocalização noivo, quando manuseados) ter resolvido.

2. Avaliação longitudinal da densidade óssea utilizando o IVIS Lumina XR sobre o mesmo grupo de subaracnóidea-transeccionados ratos

1. Início no dia 10 pós-SCI e continuando em intervalos de 10 dias até o dia 40, foram avaliados fêmures direito e esquerdo e tíbias na vida, os indivíduos anestesiados (transecção SCI e ileso controles pareados por idade).
2. No dia da varredura, os indivíduos foram transferidos em suas gaiolas de casa da área da Instituição Biotério para a sala em que a Caliper IVIS Lumina XR está alojado. Todos os indivíduos são, então, anestesiados com o coquetel de cetamina / xilazina mesmo utilizado anteriormente na entrega de SCI. Este cocktail garante um estado de anestesia por um período de 1 a 1,5 horas; suficiente para a duração do espiaprocedimento ing.
3. O investigador inicializa o dispositivo Lumina XR e permite que a câmera interna para atingir a temperatura de funcionamento (-90 ° C) (~ 10 minutos).
4. Uma vez anestesiados, o sujeito (transecção ou controle) é suavemente colocado na plataforma dos animais na XR Lumina. Uma lente de alta ampliação é inserido no dispositivo para permitir que o foco de ambos fêmur e da tíbia regiões (Campo de visão 2.4X2.4cm com ampliação alta lente). Se o assunto for indevidamente posicionado fora do campo de visão, a porta é aberta eo tema re-posicionado até a perna esquerda ou traseira direita está centrado (Veja Figura 2a para a colocação adequada do membro posterior).
5. Uma vez posicionada corretamente, a função de raios-X pode ser executado. Fazer uma seleção a partir da Energia lista drop-down adequado para Animal (sujeito vivo, 35 Kv 100uA, filtrado X-Rays)
6. Uma vez que o animal está na posição correta, ativar o recurso de raios-X por X-Ray check-marcação napainel de controle. Adquirir a imagem de raios-X. Certifique-se que o fêmur ea tíbia inteira são visíveis (ver Figura 2b). Dados de imagem raw é salvo automaticamente para o disco rígido. Representante. TIFF arquivos também são salvos. O mouse é, então, retornou à sua gaiola e permitiu recuperar sob observação investigador. O processo é então repetido com o mouse em seguida.
   Nota: O software exibe imagem viva transformou radiografias por padrão. Para mostrar-prima radiografias, remover a marca de seleção ao lado de X-Ray Absorção na Correcções / As ferramentas de filtragem. Quando os dados de raios-X foi corrigido para a absorção, você pode avaliar a densidade óssea relativa, comparando a intensidade de sinal de ROIs de medição. A intensidade aumenta com o ROI densidade do tecido aumentando.

3. Análise de imagem de raios-X IVIS scans

1. Abra o software, clicando duas vezes no ícone da imagem Living.
2. Carregar uma imagem de raios-X, clicando no OK. O navegador exibe a imagem viva de dados selecionado, juntamente com o ID do usuário, informações do rótulo e informações de configuração da câmera. Para abrir os dados, faça o seguinte: Dê um duplo clique na linha de dados, direito do mouse no nome de dados e selecione Carregar no menu de atalho, selecione a linha de dados e clique em Load, ou duplo clique na miniatura. Paleta de imagem e ferramentas são exibidos. Dados abertos é destaque em verde no navegador.
3. Clique em Ferramentas ROI na Paleta Tool. Nas ferramentas ROI, selecione ROI Medição do tipo drop-down list. Para carregar o ROI 3 é usado neste experimento, clique no ícone quadrado e carregar 3 quadrados.
4. Usando uma régua, medir o comprimento do fêmur. Ajustar o comprimento de dois dos quadrados a serem ^º 08/01 do comprimento fêmur total. Ajustar a largura dessas duas praças de ser 1/24th o comprimento do fêmur total. Com a sua régua, meça ^º 08/01 da distância entre a extremidade proximal do fêmur, e situar a praça para que seja centrado no fêmur. Situar o segundo quadrado de modo que ela se encontra 1/4th do comprimento fêmur total da extremidade distal do fêmur (Fig. 3). Estes ROI pode ser usado para medir as regiões do fêmur proximal e distal.
5. Usando a régua, medir o comprimento da tíbia. Ajustar o comprimento do terceiro quadrado a serem ^º 08/01 do comprimento total da tíbia. Ajustar a largura de 1 / 30 ^º do comprimento total da tíbia. Situar o quadrado de modo que é centrado e 08/01 ^º o comprimento total da distância a partir do final da tíbia proximal da tíbia (ver Figura 3).
6. Clique no ícone Medida (um lápis e régua). As medições de intensidade ROI aparecem na imagem de raios-X eo ROI tabela medições aparece. Export esta tabela to seu local desejado como um arquivo csv.. Isto permitirá que você para abrir a tabela usando o Excel.
7. Repita este procedimento com todas as suas imagens salvas.
8. Consolidar todos os seus dados para uma folha excel. Significância estatística foi determinada através de teste t de Student, utilizando o Microsoft Excel ou 11,0 SigmaPlot software (Software Systat).

4. Post-mortem análise da densidade óssea:

1. Após a aquisição da final longitudinal X-ray scan dentro do Lumina IVIS XR, os ratos são posteriormente profundamente anestesiados com Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). Uma vez que a anestesia profunda foi alcançado, os ratos são transcardially perfundidos com gelado-frio tampão fosfato com heparain (40 mg / litro) para desangrar.
2. Uma vez que sangrar, impostos ambos fêmures. Preste atenção especial para remover o máximo possível de tecido mole, por isso tem sido demonstrado que afetam medições de densidade ^11. Enrole os fêmures com gaze embebida de água e armazenar em-20C até que esteja pronto para analisá-los.

5. DXA Análise usando um densitômetro Hologic QDR 4000 óssea

1. Gaze encharcada de descongelar o fémur ea transferência para conjunto densitômetro ósseo.
2. Calibrar o aparelho de acordo com o protocolo do fabricante; garantir que os valores BMC e BMD estar dentro dos limites aceitáveis.
3. Coloque um colimador de bronze na máquina. Isso permite ao usuário limitar o tamanho eo ângulo do feixe de raios X para se concentrar em um alvo específico.
4. Submergir o fêmur descongelado em uma placa de Petri com água (côndilos para a esquerda, com o fêmur paralelamente à cama), e posicioná-lo logo à direita do laser.
5. Digite uma Biografia (um título descritivo que inclui informações de identificação dos animais, tratamento, etc) para o fêmur você está prestes a digitalização.
6. Digite Digitalização a partir do Menu de Seleções, em seguida, selecione regionalização oi-res. Indicam os parâmetros de digitalização: A varredura da região de 2 x 0,7489 polegadas, com espaçamento de linha 0,01 polegadas e resolução de 0,00499 ponto polegadas.
   Nota: Monitorar o scan enquanto ele está em andamento. À medida que o feixe de raios X raster scans da amostra, monitor para garantir que não há água suficiente na câmara para cobrir completamente a amostra de osso.
7. Analisar entrar no menu de seleção de análise. Siga as instruções para destacar o fêmur inteiro como um ROI. A página do relatório virá com o BMC calculado (gramas) e DMO (gms / cm ^2).
8. Repita essas etapas para analisar os fêmures restantes.
9. Consolidar todos os seus dados para uma folha excel e análise estatística (t-test).

6. Resultados representativos:

A perda de densidade relativa de um osso da tíbia e do fêmur do rato após a lesão medular quando comparado com camundongos ingênuos é detectável usando o método acima. Há uma diminuição significativa detectáveis ​​na densidade óssea apósapenas 10 dias (12%, p <0,0005), com até 15% perda de densidade óssea em 40 dias (p <0,0005, Figura 4). Perda de densidade óssea no fêmur foi observada em 40 dias após a lesão (diminuição de 7%, p <0,05, Figura 5). Estes resultados fornecem evidências para o uso de recursos não-invasivos de imagem de raios-x para a observação longitudinal de mudança de densidade óssea após lesão medular.

A fim de comparar a eficácia deste método para o que está atualmente disponível; analisamos os fêmures excisadas desses ratos 40 dias após a lesão usando DXA imagem. Uma representação da saída de dados pode ser visto na Figura 6. Descobrimos que houve uma significativa perda de conteúdo mineral ósseo nos ratos SCI quando comparado com naïve (12% de redução, p <0,05, Figura 7). Densidade mineral óssea não se alterou significativamente, mas seguiu uma tendência semelhante (Figura 8). Estes resultados são semelhantes aos encontrados na literatura; Picard et al observaram uma diminuição de 13,5% (p <0,001) no BMC, mas não decr significativafacilidade em BMD (Picard 2008).

Figura 1. Timeline Experimental.

Figura 2 orientação Representante do membro posterior esquerdo:. Uma fotografia) e b) x-ray.

Figura 3. ROI dimensões e orientação nas regiões do fêmur proximal e tíbia.

Figura 4. Perda de densidade óssea após a LM na tíbia proximal 10, 20, 30 e 40 dias após a lesão (n = 5) em comparação com pareados por idade naives (n = 5). Barras de erro representam SEM; ** p <0,005, *** p <0,0005.

Figura 6. Perda de densidade óssea após a LM no fêmur distal dias 10, 20, 30 e 40 após a lesão (n = 5) em comparação com controles pareados por idade naïve (n = 5). Barras de erro representam SEM; * p <0,01-0,05; ** p <0,001-0,01; *** p <0,0001-,001; **** p <0,0001.

Figura 7. Imagem representativa de dados DXA mostrando BMC e saída de BMD.

Figura 8. DXA análise do conteúdo mineral ósseo (gramas) nos fêmures de camundongos SCI 40 dias pós-lesão (n = 5) versus pareados por idade naives (n = 5).Barras de erro representam SEM; * p <0,05.

Figura 9. DXA análise da densidade mineral óssea (mg / cm ²⁾ nos fêmures de camundongos SCI 40 dias após a lesão (n = 5) versus pareados por idade naives (n = 5). Barras de erro representam SEM, sem diferença significativa.

Discussion

Este estudo apresenta um romance, método não-invasivo para avaliar as alterações densidade dentro dos ossos individual (tíbias e fêmures) longitudinalmente, dentro de uma única coorte de ratos, usando a Caliper IVIS Lumina XR sistema de imagem. SCI produziu uma diminuição na densidade óssea em ambos os fêmures e tíbias quando estudados dentro de uma única coorte de subaracnóidea-transeccionados ratos durante um período de ensaio de 40 dias em comparação com pareados por idade, sem ferimentos ratos, controle. Nossos resultados no fêmur foram confirmados, post-mortem, através do uso de DXA, sugerindo que a aplicação dos instrumentos Caliper IVIS Lumina XR pode servir como uma ferramenta de medição sensíveis para avaliar os efeitos a longo prazo e progressiva da SCI sobre a perda óssea .

Um benefício potencial para os investigadores usando este sistema é a capacidade de acompanhar o desenvolvimento longitudinal de alterações patológicas nos ossos dos membros posteriores dos animais após uma lesão medular. A capacidade de avaliar uma única coorte mais longos períodos de tempo fornece strong vantagens para o pesquisador em termos de: 1) os custos associados com a compra de animais e cuidados de longa duração. Em vez de um estudo que requerem um grande número de animais que precisam ser sacrificados em momentos específicos, a fim de avaliar o tempo-dependente mudanças, esses resultados patológicos podem ser seguidas dentro do mesmo grupo ao longo desse mesmo período de tempo, 2) variabilidade: além de comparação com grupos de controle, os resultados gerados dentro da única coorte de indivíduos feridos podem ser avaliados e comparados entre os pontos de tempo para os mesmos animais ao longo da extensão do estudo, uma vez mais, reduzindo tanto a variabilidade intra-animal, bem como a necessidade de maiores coortes de sujeitos experimentais.

Enquanto a Caliper IVIS Lumina XR nos forneceu informações importantes longitudinal sobre o desenvolvimento de osteoporose induzida por SCI, há limitações que devem ser considerados: 1) enquanto esta plataforma nos permitiu gerar alta resolução de raios-X datum dos ossos dos membros posteriores de ratos após uma lesão medular, a sua utilidade pode ser limitada a pequenos roedores, como ratos. A altura máxima permitida assunto dentro da XR Lumina é de 2,8 cm. Qualquer coisa acima desse nível não pode com sucesso ser fotografada usando o componente de raios-X da XR Lumina. Em nossas mãos, isso tem impedido a nossa capacidade de estudar ratos na grama de peso 200-250. Embora possa ser possível a ratos imagem sob essa faixa de peso ou outros roedores, como hamsters ou gerbos, isso vai exigir testes adicionais pelo PI. 2) a orientação conjunta. É fundamental que o investigador cuidadosamente organizar os membros em uma orientação facilmente reproduzível que irá permitir a comparação de sucesso entre as sessões de imagem. Padronização da colocação dos membros permitirá que o investigador para gerar e aplicar padronizados ROI é que podem ser salvas e aplicadas em ambos os assuntos e tempo.

No geral, acreditamos que o IVIS Lumina XR fornece uma excelente plataforma com a qual a modeloo desenvolvimento da SCI-dependente osteoporose em ratos. A possibilidade de estudar a perda óssea longitudinal dentro da coorte do mouse mesmo nos permitirá: 1) compreender melhor a natureza temporal da perda óssea e após a desmineralização SCI, 2) determinar se essas mudanças estabilizar ao longo do tempo, 3) explorar, com a disponibilidade de ambos os transgênicos e as linhas de mouse null, a possibilidade de estudar os mecanismos moleculares subjacentes a estas alterações patológicas de forma reducionista, e 4), possivelmente a vantagem mais importante, começar a testar novas intervenções destinadas a prevenir tanto o desenvolvimento da osteoporose nos estágios iniciais de lesão, ou, para inverter tais alterações uma vez que a osteoporose já desenvolveu. Finalmente, a XR Lumina, além de proporcionar excelente potencial de imagem de raios-X, também pode ser usado para estudar ambos os sinais bioluminescente e fluorescente em animais vivos. Pode-se facilmente imaginar incorporando as outras modalidades oferecidas dentro deste sistema de olhar para uma multitude de fatores que determinam a dinâmica do osso mecanicamente após uma lesão medular ou outra doença qualquer processo que resulta em osteoporose.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beuthanasia	Butler Animal Health Supply	001848
Ketathesia (Ketamine Hydrochloride)	Butler Animal Health Supply	023061
Xylazine	Butler Animal Health Supply	037849
Bupivicaine	Butler Animal Health Supply	021801
Gelfoam; 7MM	Fisher Scientific	NC0085178	To promote hemostasis during surgery
IVIS Lumina XR	Caliper Life Sciences	135400
ZFOV, 2.5 cm field of view lens	Caliper Life Sciences	127285	Absolutely necessary to generate high magnification X-ray images of bone structure
QDR Bone Densitometer	Hologic		Model used no longer in production