La valutazione longitudinale di perdita dell'arto posteriore ossea del mouse dopo la lesione del midollo spinale tramite Novel, In vivo, Metodologia

Summary

Un esame longitudinale di perdita ossea nel femore e la tibia di topi adulti è stata eseguita dopo un trauma al midollo spinale con sequenziale a basso dosaggio di raggi X scansioni. Perdita di massa ossea della tibia è stato rilevato nel corso dello studio, mentre la perdita ossea nel femore non è stata rilevata fino a 40 messaggi lesioni giorni.

Abstract

Lesioni del midollo spinale (SCI) è spesso accompagnata da osteoporosi nelle regioni sublesional del bacino e degli arti inferiori, portando ad una maggiore frequenza di fratture ^1. Poiché queste fratture si verificano spesso in regioni che hanno perso la normale funzione sensoriale, il paziente è a un maggior rischio di patologie frattura-dipendenti, compresa la morte. SCI-dipendente la perdita sia della densità minerale ossea (BMD, g / cm ²⁾ e il contenuto minerale osseo (BMC, grammi) è stata attribuita a disuso meccanica ^{2, 3} neuronale aberrante di segnalazione e di cambiamenti ormonali ^4. L'uso di modelli di roditori di SCI-osteoporosi indotta può fornire preziose informazioni riguardo i meccanismi alla base dello sviluppo di osteoporosi dopo SCI, nonché un ambiente di test per la generazione di nuove terapie ^5-7 (e rivisto in ^8). Modelli murini di SCI sono di grande interesse in quanto consentono un approccio riduzionistico di meccanismo-bavalutazione sed attraverso l'utilizzo di topi nullo e transgenici. Mentre tali modelli hanno fornito dati importanti, c'è ancora bisogno di mini-invasiva, metodi affidabili, riproducibili, e quantificabili nel determinare l'entità della perdita di tessuto osseo a seguito di SCI, in particolare nel tempo e all'interno della stessa coorte di animali da esperimento, per migliorare la diagnosi , metodi di trattamento e / o la prevenzione di SCI-osteoporosi indotta.

Un metodo ideale per misurare la densità ossea nei roditori permetterebbe esposizioni multiple, sequenziali (nel tempo) a bassi livelli di raggi X. Questo studio descrive l'uso di un nuovo intero animale scanner, il IVIS Lumina XR (Caliper Instruments) che può essere utilizzato per fornire a bassa energia (1-3 milligray (mGy)) ad alta risoluzione, ad alto ingrandimento immagini ai raggi X delle ossa degli arti posteriori del mouse nel corso del tempo a seguito SCI. Significativa perdita di densità ossea è stato visto nel tibie di topi di 10 giorni post-spinale transection rispetto a illeso, di pari età di controllo (ingenuo) i topi (13% di diminuzione, p <0,0005). Perdita di densità ossea nel femore distale è stato anche rilevabile da 10 giorni dopo la lesione, mentre una perdita di densità del femore prossimale Non è stato rilevato fino a 40 giorni dopo infortuni (7% di diminuzione, p <0,05). SCI-dipendente la perdita di densità del mouse femore è stata confermata post mortem attraverso l'utilizzo del dual-energy X-ray Absorptiometry (DXA), l'attuale "gold standard" per le misurazioni della densità ossea. Si rileva una perdita del 12% di BMC nel femori di topi a 40 giorni post-SCI utilizzando il IVIS Lumina XR. Questo il confronto con una perdita riportato in precedenza BMC del 13,5% da Picard e colleghi che hanno usato l'analisi DXA al passaggio del mouse femori post-mortem di 30 giorni successiva SCI ^9. I nostri risultati suggeriscono che la IVIS Lumina XR offre un romanzo, high-resolution/high-magnification metodo per l'esecuzione di lungo termine, le misure longitudinali della densità delle ossa degli arti posteriori nel topo seguenti SCI.

Protocol

1. Spinale di topo transection modello

1. Adulto, maschio, C57BL6 topi (circa 20-25 g) sono anestetizzati utilizzando una combinazione di ketamina (200 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Tutte le procedure chirurgiche eseguite in un istituzionali, IACUC approvato sala operatoria in condizioni sterili.
2. Una volta profondamente anestetizzati, la pelliccia della schiena è tagliato con cesoie elettriche. La schiena rasata viene prima rimosso con una soluzione di iodio seguito dal 70% di etanolo.
3. Prima l'incisione iniziale, la zona della schiena per essere inciso viene prima infiltrata con un anestetico locale (Marcaine) ad una concentrazione del (0,25%, <1ml/kg) per ridurre al minimo dolore postoperatorio.
4. Utilizzando piccole forbici, una piccola apertura è realizzata in pelle al intorno alla zona L2. Questa apertura si espande con lo stesso set di forbici, che si estende longitudinalmente alla zona T2. I bordi della pelle sono poi tenute a parte attraverso l'uso di fascette bulldog.
5. Micro-forbici vengono poi utilizzatiper cancellare tessuto muscolare dalla lamina dorsale spinale a livello toracico 8 (T8). T8 possono essere identificate come descritto nella Kuh e Wrathall (1998) ^10. In breve, T13 può essere identificato dal suo processo spinoso dorsale. Utilizzando una coppia di pinze # 5 Dumont, l'ultima costola può essere palpato / identificato e calcolato a ritroso, a T8. Una volta eliminato, Rongeurs ossa vengono utilizzati per eseguire una laminectomia dorsale a T8.
6. Resezione completa della lesione spinale: Una volta che il midollo spinale è esposto a T8, una serie aggiuntiva di sterilizzato micro-forbici vengono utilizzate per recidere il midollo spinale nel piano perpendicolare all'asse lungo del cavo sotto un microscopio chirurgico. Noi usiamo # 5 forcipe Dumont per sollevare delicatamente un polo del midollo spinale per confermare la completezza della lesione.
7. In seguito a resezione della colonna vertebrale, un piccolo pezzo di Gelfoam sterili, imbevute di soluzione salina sterile (0,9%) è accuratamente inserito nella cavità della lesione per promuovere l'emostasi.
8. Un pezzo aggiuntivo di Gelfoam viene poi posizionato sopra lo spin espostial cavo. La pelle viene poi chiuso con sterili, graffette chirurgico in acciaio inox. I soggetti sono poi tornati alle loro gabbie a casa, posta su un tovagliolo di carta per evitare l'aspirazione di materiale di biancheria da letto e riscaldato con una piastra elettrica per un periodo di circa 12 ore. I soggetti sono inoltre dotati di confezioni Hydrogel (ClearH2O) e pellet di cibo sul pavimento delle loro gabbie durante recuperare presto. Soggetti feriti sono in grado di accedere cibo / acqua nelle loro gabbie a casa una volta recuperato l'anestesia.
9. Tutti i soggetti feriti ricevono due volte al giorno evacuazioni vescica manuale (a intervalli di circa 12 ore) con una modifica del metodo manuale della Crede per tutta la durata dello studio (40 giorni).
10. Topi feriti sono forniti anche con iniezioni intraperitoneali due volte al giorno dello 0,9% soluzione salina per tre giorni (0,5 cc) per aiutare a mantenere l'idratazione, e due volte iniezioni giornaliere di oppiacei buprenorfina (0,05 mg / kg) per controllare il dolore post-chirurgico per un periodo di 5 giorni. Se gli animali mostrano segni of dolore dopo l'iniziale periodo di 5 giorni, avrebbero ricevuto buprenorfina aggiuntivo (0,05 mg / kg) al giorno fino a quando i segni del dolore (mobilità ridotta, statura curve, il mancato sposo, vocalizzazione quando vengono maneggiati) hanno risolto.

2. Valutazione longitudinale della densità ossea con la IVIS Lumina XR sulla stessa coorte di transected-spinale nei topi

1. A partire dal 10 ° giorno post-SCI e continua a intervalli di 10 giorni fino a giorno 40, abbiamo valutato femore destro e sinistro e tibie in vita, i soggetti anestetizzati (transezione SIC e illeso controlli appaiati per età).
2. Il giorno della scansione, i soggetti sono stati trasferiti nelle loro gabbie a casa dalla zona Vivarium dell'istituzione per la stanza in cui è ospitato il Caliper IVIS Lumina XR. Tutti i soggetti sono poi anestetizzati utilizzando la stessa ketamina / xylazina cocktail precedentemente utilizzato nella consegna dei SIC. Questo cocktail assicura uno stato di anestesia per un periodo di 1 a 1,5 ore, sufficienti per la durata del scannING procedura.
3. L'investigatore inizializza il dispositivo Lumina XR e permette alla fotocamera interna per raggiungere la temperatura di esercizio (-90 ° C) (~ 10 minuti).
4. Una volta anestetizzato, il soggetto (resezione o controllo) si posa delicatamente sulla piattaforma degli animali nella XR Lumina. Una lente di ingrandimento è inserita nel dispositivo per consentire concentrarsi sia femore e delle regioni tibiale (Campo di vista 2.4X2.4cm con lenti ad alto ingrandimento). Se il soggetto è posizionato in modo improprio al di fuori del campo di vista, la porta è aperta e il soggetto riposizionato fino l'arto sinistro o destro posteriore è centrato (vedi Figura 2a per il corretto posizionamento degli arti posteriori).
5. Una volta posizionato correttamente, i raggi X funzione può essere eseguita. Effettuare una selezione dalla lista Energia discesa adatte per animali (soggetto vivente, 35 Kv 100uA, filtrati i raggi X)
6. Una volta che l'animale è nella giusta posizione, attivare la funzione di raggi X da parte del check-marchio X-Ray nelpannello di controllo. Acquisire le immagine radiografica. Assicurarsi che l'intero femore e la tibia sono visibili (vedi Figura 2b). Dati di immagine RAW viene automaticamente salvato sul disco rigido. Rappresentante. TIFF sono anche salvati. Il mouse è poi tornò a casa sua gabbia e ha permesso di recuperare sotto osservazione investigatore. Il processo viene quindi ripetuto con il mouse successiva.
   Nota: il software visualizza immagine vivente trasformata immagini a raggi X di default. Per visualizzare le prime immagini a raggi X, rimuovere il segno di spunta accanto alla X-Ray Absorption nel Correzioni / strumenti di filtraggio. Quando i raggi X i dati sono stati corretti per l'assorbimento, è possibile valutare la densità ossea, confrontando l'intensità del segnale del ROI misura. L'intensità ROI aumenta con l'aumentare della densità dei tessuti.

3. Analisi delle immagini di IVIS scansioni a raggi X

1. Aprire il software facendo doppio clic sull'icona immagine vivente.
2. Caricare un immagine radiografica cliccando sul OK. Il browser immagine vivente visualizza i dati selezionati insieme con l'ID utente, informazioni sull'etichetta e le informazioni di configurazione della fotocamera. Per aprire i dati, effettuare una delle seguenti operazioni: Fare doppio clic sulla riga di dati, destro del mouse sul nome dati e selezionare Carica dal menu contestuale, selezionare la riga di dati e fare clic su Load, o doppio clic sulla miniatura. La tavolozza delle immagini e degli strumenti vengono mostrate. Apri dati è evidenziato in verde nel browser.
3. Fare clic su Strumenti ROI nella tavolozza degli strumenti. In Strumenti ROI, Misurazione del ROI selezionare il tipo di discesa. Per caricare i 3 ROI utilizzato in questo esperimento, fare clic sull'icona della Piazza e del carico 3 quadrati.
4. Utilizzando un righello, misurare la lunghezza del femore. Regolare la lunghezza di due delle piazze da ^° 1 / 8 della lunghezza del femore totale. Regolare la larghezza di queste due piazze a 1/24th essere la lunghezza totale del femore. Con il righello, misura 1 / 8 ^° della distanza dalla estremità prossimale del femore, e situare il quadrato in modo che sia centrato all'interno del femore. Situare la seconda piazza in modo che si trova 1/4th della lunghezza del femore totale a partire dalla fine distale del femore (Fig. 3). Queste ROI può essere utilizzato per misurare le regioni femore sia prossimale che distale.
5. Utilizzando il righello, misurare la lunghezza della tibia. Regolare la lunghezza del terzo quadrato da ^° 1 / 8 della lunghezza totale della tibia. Regolare la larghezza a 1 / 30 ^esimo della lunghezza totale della tibia. Situare la piazza in modo che sia centrato e 1 / 8 ^° la lunghezza totale della tibia distanza dalla estremità prossimale della tibia (vedi Figura 3).
6. Fare clic sull'icona di Misura (una matita e righello). Le misurazioni dell'intensità ROI appaiono nella immagine radiografica e la tabella del ROI misura appare. Esporta questa tabella to la posizione desiderata come un file. csv. Questo vi permetterà di aprire la tabella con Excel.
7. Ripetere questa operazione con tutte le immagini salvate.
8. Consolidare tutti i dati su un unico foglio excel. La significatività statistica è stata determinata attraverso studente t-test utilizzando Microsoft Excel o SigmaPlot 11,0 software (Software SYSTAT).

4. Post-mortem analisi della densità ossea:

1. A seguito dell'acquisizione della finale longitudinale scansione a raggi X all'interno della Lumina IVIS XR, i topi sono poi profondamente anestetizzati con Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). Una volta che l'anestesia profonda è stato raggiunto, i topi sono transcardially perfusi con freddo-freddo PBS con heparain (40 mg / litro) al exsanguinate.
2. Una volta dissanguato, accise entrambi i femori. Prestare particolare attenzione a rimuovere il più possibile i tessuti molli, per questo è stato dimostrato di influenzare misure di densità ^11. Avvolgere i femori con una garza imbevuta d'acqua e conservare a-20C fino a quando si è pronti ad analizzarli.

5. DXA analisi utilizzando un Hologic QDR 4000 densitometro osseo

1. Scongelare garza imbevuta di femori e trasferimento privato densitometro osseo.
2. Calibrare l'apparato secondo il protocollo del fabbricante; garantire che i valori di BMC e BMD rientrare nei limiti accettabili.
3. Posto un collimatore in ottone all'interno della macchina. Questo consente all'utente di limitare le dimensioni e l'angolo del fascio di raggi X di concentrarsi su un obiettivo specifico.
4. Immergere il femore scongelato in una capsula di Petri riempite con acqua (condili a sinistra, con il femore parallelo al letto), e la posizione è appena a destra del laser.
5. Immettere una biografia (un titolo descrittivo che include le informazioni di identificazione degli animali, trattamento, ecc) per il femore che si sta per eseguire la scansione.
6. Inserisci Scansione dal menu Opzioni, quindi selezionare regionA hi-res. Indicare i parametri di scansione: Una scansione regione di 2 x 0,7489 pollici, con interlinea 0,01 pollici e risoluzione di punto di 0,00499 pollici.
   Nota: Monitorare la scansione mentre è in corso. Mentre il fascio di raggi X raster esegue la scansione del campione, monitor per garantire che vi sia acqua sufficiente nella camera da coprire completamente il campione osseo.
7. Analizzare entrare nel menu di selezione Analysis. Seguire le istruzioni per evidenziare il femore intero come un ROI. Una pagina del rapporto verrà calcolato con il BMC (grammi) e la BMD (gms / cm ^2).
8. Ripetere questa procedura per analizzare i femori rimanenti.
9. Consolidare tutti i dati su un unico foglio excel e effettuare analisi statistiche (t-test).

6. Rappresentante dei risultati:

La relativa perdita di densità ossea di un topo tibia e il femore dopo la lesione del midollo spinale rispetto ai topi naive è rilevabile con il metodo di cui sopra. Vi è una diminuzione rilevabile significativa della densità ossea doposoli 10 giorni (12%, p <0,0005), con fino a 15% la perdita di densità ossea a 40 giorni (p <0,0005, Figura 4). La perdita di densità ossea nel femore è stata osservata a 40 dopo lesioni giorni (7% di diminuzione, p <0,05, figura 5). Questi risultati forniscono prove per l'uso di non-invasive di imaging a raggi X per l'osservazione longitudinale del cambiamento della densità ossea dopo la lesione del midollo spinale.

Al fine di confrontare l'efficacia di questo metodo per quello che è attualmente disponibile, abbiamo analizzato i femori escisse di questi topi 40 giorni dopo la lesione mediante DXA imaging. Una rappresentazione dei dati in uscita può essere visto in Figura 6. Abbiamo scoperto che c'è stata una significativa perdita di contenuto minerale osseo nei topi SCI rispetto alle ingenuo (12% di diminuzione, p <0,05, Figura 7). La densità minerale ossea non è cambiata significativamente, ma ha seguito un andamento simile (Figura 8). Questi risultati sono simili a quelli trovati in letteratura; Picard et al hanno osservato una diminuzione del 13,5% (p <0,001) in BMC, ma non Decr significativefacilità di BMD (Picard 2008).

Figura 1. Timeline sperimentale.

Figura 2 orientamento Rappresentante della sinistra arti posteriori:. A) fotografia e b) x-ray.

Figura 3. ROI dimensioni e l'orientamento nelle regioni del femore prossimale e della tibia.

Figura 4. Perdita di densità ossea dopo SCI nella tibia prossimale 10, 20, 30 e 40 giorni dopo la lesione (n = 5) rispetto ai pari età ingenui (n = 5). Le barre di errore rappresentano SEM; ** p <0,005, *** p <0,0005.

Figura 6. Perdita di densità ossea dopo SCI nel femore distale giorni 10, 20, 30 e 40 dopo l'infortunio (n = 5) rispetto ai controlli appaiati per età naïve (n = 5). Le barre di errore rappresentano SEM; * p <0,01-0,05; ** p <0,001-0,01; *** p <0,0001-,001; **** p <0,0001.

Figura 7. Un'immagine rappresentativa di dati che mostrano DXA BMC e BMD uscita.

Figura 8. DXA analisi del contenuto minerale osseo (grammi) in femori di topi SIC 40 giorni dopo infortunio (n = 5) vs pari età ingenui (n = 5).Le barre di errore rappresentano SEM; * p <0,05.

Figura 9. DXA analisi della densità minerale ossea (mg / cm ²⁾ in femori di topi SIC 40 giorni dopo l'infortunio (n = 5) vs pari età ingenui (n = 5). Le barre di errore rappresentano SEM, senza differenze significative.

Discussion

Questo studio presenta un romanzo, metodo non invasivo per valutare variazioni di densità all'interno di singole ossa (tibie e femori) longitudinalmente, all'interno di una singola coorte di topi, utilizzando la pinza IVIS Lumina XR sistema di imaging. SCI ha prodotto una diminuzione della densità ossea in entrambi i femori e tibie, quando ha studiato in una coorte di singolo-spinale sezionato topi in un periodo di test di 40 giorni rispetto ai pari età, illeso, topi di controllo. I nostri risultati nel femore sono stati confermati, post-mortem, attraverso l'utilizzo di DXA, suggerendo che l'applicazione degli strumenti Caliper IVIS Lumina XR può servire come strumento di misura sensibile per valutare gli effetti a lungo termine e progressivo della SCI sulla perdita di massa ossea .

Un beneficio potenziale per gli investigatori utilizzando questo sistema è la capacità di seguire longitudinalmente lo sviluppo di alterazioni patologiche delle ossa degli arti posteriori di animali a seguito SCI. La capacità di valutare una coorte sola lunghi periodi di tempo fornisce °Rong vantaggi al ricercatore in termini di: 1) i costi associati con l'acquisto di animali e assistenza a lungo termine. Invece di uno studio che richiedono un gran numero di animali che devono essere sacrificati in punti temporali specifici al fine di valutare i cambiamenti dipendenti dal tempo, questi risultati patologici possono essere seguiti all'interno della stessa coorte in quel periodo stesso tempo, 2) la variabilità: oltre alle confronto con coorti di controllo, i risultati generati all'interno della singola coorte di soggetti infortunati possono essere valutati e confrontati tra i punti di tempo per gli animali stessi in tutta l'estensione dello studio, ancora una volta, riducendo sia la variabilità intra-così come la necessità per i più grandi coorti di soggetti sperimentali.

Mentre la pinza IVIS Lumina XR ci ha fornito importanti informazioni longitudinali in merito allo sviluppo di SCI-osteoporosi indotta, ci sono delle limitazioni che dovrebbero essere considerati: 1) mentre questa piattaforma ci ha permesso di generare ad alta risoluzione a raggi X datuno nelle ossa degli arti posteriori di topi a seguito SCI, la sua utilità può essere limitata a piccoli roditori come topi. L'altezza massima consentita soggetto all'interno della XR Lumina è di 2,8 cm. Nulla sopra di tale altezza non può essere ripreso con successo utilizzando raggi X componente del XR Lumina. Nelle nostre mani, questo ha precluso la nostra capacità di studiare i ratti del peso 200-250 grammi. Mentre può essere possibile ratti immagine sotto questa fascia di peso o di altri roditori come i criceti o gerbilli, questo richiederà ulteriori test da parte del PI. 2) orientamento comune. E 'fondamentale che il ricercatore attentamente organizzare gli arti in un orientamento che facilmente riproducibile da consentire il confronto di successo tra le sessioni di imaging. Standardizzazione del posizionamento degli arti consentirà al ricercatore di generare e applicare standard ROI che possono essere salvate e applicate in entrambi i soggetti e il tempo.

Nel complesso, riteniamo che la IVIS Lumina XR offre un'eccellente piattaforma con cui il modellolo sviluppo di SCI-dipendente osteoporosi nei topi. La possibilità di studiare la perdita ossea longitudinalmente all'interno della coorte del mouse stesso ci permetterà di: 1) a comprendere meglio la natura temporale della perdita ossea e demineralizzazione dopo SCI, 2) determinare se questi cambiamenti stabilizzare nel tempo, 3) esplorare, con la disponibilità di entrambe le linee transgeniche e mouse null, la capacità di studiare i meccanismi molecolari alla base di questi cambiamenti patologici in maniera riduzionista, e 4) molto probabilmente il vantaggio più importante, cominciano a testare nuovi interventi per prevenire sia lo sviluppo di osteoporosi nelle prime fasi di lesioni, o, per invertire tali modifiche una volta che l'osteoporosi ha già sviluppato. Infine, l'XR Lumina, oltre a fornire ottime raggi X potenziale delle immagini, può essere utilizzato anche per studiare entrambi i segnali e bioluminescenti fluorescenti negli animali viventi. Si potrebbe facilmente immaginare che incorporano la altre modalità offerti all'interno di questo sistema per guardare una multitude di fattori che determinano le dinamiche osso meccanicisticamente seguenti SCI o qualsiasi altro processo di malattia che provoca l'osteoporosi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beuthanasia	Butler Animal Health Supply	001848
Ketathesia (Ketamine Hydrochloride)	Butler Animal Health Supply	023061
Xylazine	Butler Animal Health Supply	037849
Bupivicaine	Butler Animal Health Supply	021801
Gelfoam; 7MM	Fisher Scientific	NC0085178	To promote hemostasis during surgery
IVIS Lumina XR	Caliper Life Sciences	135400
ZFOV, 2.5 cm field of view lens	Caliper Life Sciences	127285	Absolutely necessary to generate high magnification X-ray images of bone structure
QDR Bone Densitometer	Hologic		Model used no longer in production