Langsgående Evaluering av Mouse Hind Limb Bone tap etter ryggmargsskade bruke Novel, In vivo Methodology

Summary

En longitudinell undersøkelse av bentap i femurs og tibiae av voksne mus ble utført etter ryggmargsskade bruke sekvensiell lavdose røntgen skanner. Tibia bentap ble oppdaget gjennom hele studien, mens bentap i femur ble ikke oppdaget før 40 dager etter skade.

Abstract

Ryggmargsskade (SCI) er ofte ledsaget av osteoporose i sublesional regioner i bekken og nedre ekstremiteter, fører til en høyere frekvens av frakturer ^1. Som disse brudd forekommer ofte i regioner som har mistet normal sensorisk funksjon, er pasienten i en større risiko for brudd-avhengige patologi, inkludert død. SCI-avhengige tap i begge benmineraltetthet (BMD, gram / ​​cm ²⁾ og bone mineral innhold (BMC, gram) har blitt tilskrevet mekaniske stillstandsperiode ^2, avvikende neuronal signalering ³ og hormonelle forandringer ^fire. Bruken av gnager modeller av SCI-indusert osteoporose kan gi uvurderlig informasjon om mekanismene bak utvikling av osteoporose følgende SCI samt et testmiljø for generering av nye behandlingsformer ^5-7 (og anmeldt i ^8). Mouse modeller av SCI er av stor interesse som de tillater en reduksjonistisk tilnærming til mekanisme-based vurdering gjennom bruk av null og transgene mus. Selv om slike modeller har gitt viktige data, er det fortsatt behov for minimalt-invasiv, pålitelig reproduserbar, og kvantifiserbare metoder i å bestemme omfanget av bentap etter SCI, spesielt over tid og innenfor samme kohort av forsøksdyr, for å bedre diagnostikk , behandlingsmetoder, og / eller forebygging av SCI-indusert osteoporose.

En ideell metode for måling av bentetthet hos gnagere ville tillate flere, sekvensiell (over tid) eksponeringer til lave nivåer av X-ray stråling. Denne studien beskriver bruk av en ny hel-dyr skanneren, IVIS Lumina XR (Caliper Instruments) som kan brukes til å gi lav-energi (1-3 milligray (mGy)) med høy oppløsning, høy forstørrelse røntgenbilder av mus hind lem bein over tid etter SCI. Betydelig bentetthet tapet ble sett i tibiae av mus med 10 dager post-spinal transection sammenlignet med friske, alder-matchet kontroll (naive) mus (13% reduksjon, p <0,0005). Tap av bentetthet i distale femur ble også påvist ved dag 10 post-SCI, mens et tap av tetthet i proksimale femur var ikke oppdages før 40 dager etter skaden (7% reduksjon, p <0,05). SCI-avhengige tap av mus femur tetthet ble bekreftet post-mortem gjennom bruk av Dual-energy X-ray absorpsjonsmetri (DXA), den nåværende "gullstandarden" for bentetthet målinger. Vi oppdager en 12% tap av BMC i femurs av mus på 40 dager etter SCI bruker IVIS Lumina XR. Dette sammenligner gunstig med et tidligere rapportert BMC tap på 13,5% av Picard og kolleger som har brukt DXA analyse på mus femurs post-mortem 30 dager etter SCI ^9. Våre resultater tyder på at IVIS Lumina XR gir en roman, high-resolution/high-magnification metode for å utføre langsiktig, langsgående målinger av hind lem beintettheten i musen følgende SCI.

Protocol

1. Mus spinal transection modell

1. Voksen, mannlig, C57BL6 mus (20-25 g) blir bedøvet ved hjelp av en kombinasjon av ketamin (200 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Alle kirurgiske prosedyrer er utført i en institusjonell, IACUC-godkjent kirurgisk suite under sterile forhold.
2. Når dypt bedøvet, er pelsen på ryggen trimmet bruker elektriske klippere. Den barbert ryggen er første skrubbes med en jod-løsning etterfulgt av 70% etanol.
3. Før den første snitt, er området av ryggen for å bli radert første infiltrert med lokalbedøvelse (Marcaine) ved en konsentrasjon på (0,25%, <1ml/kg) for å minimere postoperative smerter.
4. Bruk liten saks, er en liten åpning i huden på rundt L2-området. Denne åpningen er utvidet med det samme settet med saks, strekker lengderetningen til T2 området. Kantene av huden blir deretter holdt hverandre via bruk av bulldog klemmer.
5. Micro-saks deretter brukeså fjerne muskel vev fra dorsale spinale lamina på thorax nivå 8 (T8). T8 kan identifiseres som beskrevet i Kuh og Wrathall (1998) ^10. Kort fortalt kan T13 identifiseres ved sin dorsal spinous prosess. Ved hjelp av et par # 5 Dumont tang, kan den siste ribben være palpated / identifiseres og telles tilbake til T8. Når ryddet, bein Rongeurs brukes til å utføre en dorsal laminektomi på T8.
6. Full Spinal Transection Lesjon: Når ryggmargen er utsatt på T8, et ekstra sett med sterilisert mikro-saks brukes til å kutte ryggmargen i planet vinkelrett på den lange aksen av ledningen under et kirurgisk mikroskop. Vi bruker # 5 Dumont pinsett til å forsiktig løfte ene polen i ryggmargen for å bekrefte fullstendigheten av lesjonen.
7. Etter spinal transection, et lite stykke sterile gelfoam, dyppet i sterilt saltvann (0,9%) er omhyggelig plassert inn i lesjonen hulrom for å fremme hemostase.
8. En ekstra stykke gelfoam deretter plasseres over de eksponerte spinal ledningen. Huden blir deretter lukkes med steril, rustfritt stål kirurgiske stifter. Emner blir deretter returnert til sine hjem bur, plassert på et papir håndkle for å unngå aspirasjon av sengetøy materiale og varmet med en oppvarming puten for en periode på ca 12 timer. Emner er også utstyrt med Hydrogel packs (ClearH2O) og mat pellets på gulvet i burene under tidlig igjen. Skadet fag er tilgang til mat / vann i sitt hjem burene gang gjenopprettet fra anestesi.
9. All skadet fagene får to ganger daglig manuell blære evakueringer (ca 12 timers mellomrom) med en modifisering av den manuelle metoden for Crede for varigheten av studien (40 dager).
10. Skadet mus er også utstyrt med to ganger daglig intraperitoneal injeksjon av 0,9% saltvann i tre dager (0,5 cc) for å bidra til å opprettholde hydrering, og to ganger daglig injeksjoner av opiat buprenorfin (0,05 mg / kg) til å kontrollere postoperative smerter for en periode på 5 dager. Dersom dyr viser tegn of smerter etter den innledende 5 dagers periode, vil de motta ekstra buprenorfin (0,05 mg / kg) daglig inntil tegn på smerte (redusert bevegelighet, sammenkrøket vekst, unnlatelse av å stelle, stemmebruk når håndteres) har løst.

2. Langsgående vurdering av bentetthet bruke IVIS Lumina XR på samme kohort av spinally-transected mus

1. Begynnelsen på dag 10 etter SCI og fortsatte med 10 dagers intervaller til dag 40, vurderte vi høyre og venstre femurs og tibiae i levende, bedøvet fag (transection SCI og uskadet alders-matchet kontroll).
2. På dagen for skanning, ble fagene overført i sitt hjem burene fra institusjonens Vivarium området til rommet der Caliper IVIS Lumina XR ligger. Alle fag er så bedøvet med samme Ketamin / xylazin cocktail tidligere brukt i levering av SCI. Dette cocktail sikrer en tilstand av anestesi for en periode på 1 til 1,5 time, tilstrekkelig for varigheten av scanning prosedyre.
3. Utprøver initialiseres Lumina XR enheten og lar interne kameraet nå operativ temperatur (-90 ° C) (~ 10 minutter).
4. Når bedøvet, er emnet (transection eller kontroll) forsiktig plassert på dyret plattformen i Lumina XR. En høy forstørrelse objektivet er satt inn i enheten, slik at fokus på både femur og tibial regioner (Field of view 2.4X2.4cm med høy forstørrelse objektivet). Hvis motivet er feil plassert utenfor synsfeltet, er døren åpnet og temaet flyttes til venstre eller høyre hind lem er sentrert (Se Figur 2a for riktig plassering av hind lem).
5. Når riktig plassert, kan X-ray-funksjon utføres. Lag en markering fra Energifondet rullegardinlisten egnet for Animal (Living emne, 35 100uA Kv, filtrert X-Rays)
6. Når dyret er i riktig posisjon, gjør X-ray funksjon ved check-merking X-Ray ikontrollpanelet. Acquire X-ray bilde. Sørg for at hele femur og tibia er synlige (se figur 2b). Rå bildedata lagres automatisk på harddisken. Representant. TIFF-filer lagres også. Musen er da tilbake til sitt hjem bur og lov til å gjenopprette i henhold etterforsker observasjon. Prosessen er så gjentas med neste musen.
   Merk: The Living Bilde software viser forvandlet røntgenbilder som standard. For å vise rå X-ray bilder, fjerne haken ved siden av X-Ray Absorpsjon i Korrigeringer / filtrering verktøy. Når X-ray data har blitt korrigert for absorpsjon, kan du vurdere relative bentetthet ved å sammenligne signalet intensiteter av måling Rois. ROI intensiteten øker med økende vev tetthet.

3. Bildeanalyse av IVIS X-ray skanner

1. Åpne programvaren ved å dobbeltklikke på den levende bilde ikon.
2. Load en X-ray ved å klikke på OK. The Living Bilde nettleseren viser de valgte dataene sammen med bruker-ID, etikett informasjon og kamera konfigurasjon informasjon. For å åpne data, gjør du ett av følgende: Dobbeltklikk data rad, Høyreklikk data navnet og velg Load på hurtigmenyen, velg data raden og klikk på Load, eller Dobbeltklikk på miniatyrbildet. Bildet og verktøypaletten vises. Åpne data er uthevet i grønt i nettleseren.
3. Klikk på ROI Tools i verktøypaletten. I ROI Tools, velg Measurement ROI fra Type nedtrekkslisten. Hvis du vil laste de 3 ROI er brukt i dette eksperimentet, klikker Square ikonet og last 3 ruter.
4. Ved hjelp av en linjal, måle lengden på femur. Juster lengden på to av rutene til å være 1 / 8 ^th av den totale femur lengde. Juster bredden på disse to rutene å være 1/24th den totale femur lengde. Med linjal din, måler 1 / 8 ^th av avstanden fra den proksimale ende av femur, og situate plassen slik at den er sentrert i femur. Plasser andre rute slik at den ligger 1/4th av den totale femur lengde fra den distale enden av femur (Fig. 3). Disse ROI er kan brukes til å måle både proksimal og distal femur regioner.
5. Ved hjelp av linjal, måle lengden på tibia. Juster lengden på den tredje plassen å være 1 / 8 ^th av den totale tibial lengde. Juster bredden til 1 / 30 ^th av den totale tibial lengde. Situate plassen slik at er sentrert og 1 / 8 ^th den totale lengden på tibia avstand fra den proksimale enden av tibia (se Figur 3).
6. Klikk på Measure-ikonet (en blyant og linjal). ROI intensitet målingene vises i X-ray image og ROI målinger tabellen vises. Eksporter denne tabellen to ønsket posisjon som et. csv-fil. Dette vil tillate deg å åpne tabellen ved hjelp av Excel.
7. Gjenta dette med alle dine lagrede bilder.
8. Samle alle dataene på ett excel-ark. Statistisk signifikans ble bestemt via student t-test ved hjelp av enten Microsoft Excel eller SigmaPlot 11,0 programvare (SYSTAT Software).

Fire. Post-mortem analyse av bentetthet:

1. Etter oppkjøpet av den endelige langsgående X-ray scan innen IVIS Lumina XR, mus senere blir dypt bedøvet med Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). Når dyp narkose er oppnådd, er musene transcardially perfused med is-kald fosfat-bufret saltvann med heparain (40 mg / liter) til exsanguinate.
2. Når exsanguinated, avgifter begge femurs. Vær spesielt nøye med å fjerne så mye mykt vev som mulig, for dette har vist seg å påvirke tettheten målinger ^11. Vikle femurs med vann gjennomvåt gasbind og butikken på-20C til du er klar til å analysere dem.

5. DXA Analyse ved hjelp av en Hologic QDR 4000 Bone densitometer

1. Tin gasbind-gjennomvåt femurs og overføring til Bone densitometer suite.
2. Kalibrer apparatet i henhold til produsentens protokoll; sikre at BMC og BMD verdier havner innenfor akseptable grenser.
3. Plasser en messing collimator i maskinen. Dette tillater brukeren å begrense størrelsen og vinkelen på X-ray beam å fokusere på et bestemt mål.
4. Senk tinte femur i en petriskål fylt med vann (kondylene til venstre, med femur parallell til sengen), og plasser den rett til høyre for laser.
5. Tast inn en biografi (en beskrivende tittel som inkluderer dyr identifikasjon informasjon, behandling, etc.) for femur du er i ferd med å skanne.
6. Tast Skanne fra Selections menyen, velg deretter regionA hi-res. Indikere skanningsparametere: En skanning region 2 x 0,7489 inches, med 0,01 tommers linjeavstand og 0,00499 tommers punkt oppløsning.
   Merk: Monitor skanningen mens den pågår. Som X-ray beam raster skanner prøven, monitor for å sikre at det er nok vann i kammeret å fullstendig dekke beinet prøven.
7. Tast Analyser under Analysis Utvalg menyen. Følg instruksjonene for å markere hele femur som en ROI. En rapport side vil komme opp med den beregnede BMC (gram) og BMD (gms / cm ^2).
8. Gjenta disse trinnene for å analysere de resterende femurs.
9. Samle alle dataene på ett excel-ark og utføre statistisk analyse (t-test).

Seks. Representant Resultater:

Den relative beintetthet tap av en mus tibia og femur etter ryggmargsskade sammenlignet med naive mus er synlig ved hjelp av de ovennevnte metoden. Det er en synlig betydelig reduksjon i bentetthet etterbare 10 dager (12%, p <0,0005), med opptil 15% bentetthet tap på 40 dager (p <0,0005, figur 4). Bentetthet tap i femur ble observert ved 40 dager etter skaden (7% reduksjon, p <0,05, 5 figur). Disse resultatene gir bevis for bruk av ikke-invasive x-ray bildebehandling for langsgående observasjon av bentetthet endres etter ryggmargsskade.

For å sammenligne effekten av denne metoden til hva som er tilgjengelig for øyeblikket, vi analyserte excised femurs av disse musene 40 dager etter skaden med DXA imaging. En representasjon av dataene utgangen kan sees i Figur 6. Vi fant at det var et betydelig tap av bone mineral innhold i SCI mus sammenlignet med naive (12% reduksjon, p <0.05, figur 7). Bone mineral density ikke endres vesentlig, men fulgte en lignende trend (Figur 8). Disse resultatene er lik dem som finnes i litteraturen; Picard et al observerte en 13,5% nedgang (p <0,001) i BMC, men ingen signifikant decrletthet i BMD (Picard 2008).

Figur 1. Experimental Timeline.

Figur 2 Representative orientering venstre hind-lem. A) fotografi og b) x-ray.

Figur 3. ROI dimensjoner og orientering innenfor områder av proksimal femur og tibia.

Figur 4. Bone density tap etter SCI i proksimale 10 tibia, 20, 30 og 40 dager etter skade (n = 5) sammenlignet med samme alder naives (n = 5). Feilfelt representerer SEM, ** p <0,005, *** p <0,0005.

Figur 6. Bone density tap etter SCI i distale femur 10, 20, 30 og 40 dager etter skade (n = 5) sammenlignet med samme alder naive kontroller (n = 5). Feilfelt representerer SEM, * p <0.01 til 0.05, ** p <0,001 til 0,01, *** p <0,0001 til 0.001; **** p <0,0001.

Figur 7.. Representative bilde av DXA data som viser BMC og BMD utgang.

Figur 8. DXA analyse av bone mineral innhold (gram) i femurs av SCI mus 40 dager etter skade (n = 5) vs samme alder naives (n = 5).Feilfelt representerer SEM, * p <0,05.

Figur 9. DXA analyse av bentetthet (mg / cm ²⁾ i femurs av SCI mus 40 dager etter skade (n = 5) vs samme alder naives (n = 5). Feilfelt representerer SEM, ingen signifikant forskjell.

Discussion

Denne studien presenterer en roman, non-invasiv metode for å vurdere tettheten endringer innen de enkelte bein (tibiae og femurs) lengderetningen, innenfor en enkelt kohort av mus ved hjelp av Caliper IVIS Lumina XR imaging system. SCI produsert en reduksjon i bentetthet i både femurs og tibiae når studert innenfor en enkelt kohort av spinally-transected mus over en 40 dagers test periode sammenlignet med samme alder, uskadet, kontroll mus. Våre resultater i femur ble bekreftet, post-mortem, gjennom bruk av DXA, tyder på at anvendelsen av Caliper Instruments IVIS Lumina XR kan tjene som en følsom måleverktøy for å vurdere de langsiktige og progressive effekter av SCI på bentap .

En mulig fordel for etterforskerne å bruke dette systemet er muligheten til å lengderetningen følge utviklingen av patologiske endringer i hind lem knokler av dyr etter SCI. Muligheten til å vurdere en enkelt kohort over lange tidsperioder gir strong fordeler til etterforsker i form av: 1) kostnader forbundet med dyre kjøp og langsiktig omsorg. I stedet for en studie som krever et stort antall dyr som må ofres på bestemte tidspunkter for å vurdere tidsavhengig endringer, kan disse patologisk utfall følges innen samme kohort over den samme tidsperioden, 2) variasjon: i tillegg til sammenligning med kontroll kohortene, kan resultatene som genereres i én kohort av skadet fagene bli vurdert og sammenlignet mellom tidspunkter for de samme dyrene gjennom omfanget av studien, nok en gang, noe som reduserer både intra-dyr variabilitet samt behovet for større kohorter av eksperimentelle fag.

Mens Caliper IVIS Lumina XR gitt oss viktig langsgående informasjon om utviklingen av SCI-indusert osteoporose, er det begrensninger som bør vurderes: 1), mens denne plattformen har tillatt oss å generere høy oppløsning X-ray daten i hind lem knokler av mus følgende SCI, kan dens nytte være begrenset til små gnagere som mus. Den maksimale faget høyde tillates innenfor Lumina XR er 2.8 cm. Alt over at høyden kan ikke være vellykket avbildes ved hjelp av X-ray del av Lumina XR. I våre hender, har dette utelukket vår evne til å studere rotter i 200-250 gram vekt. Mens det kan være mulig å avbilde rotter under denne vektområdet eller andre gnagere som hamster eller ørkenrotte, vil dette kreve ytterligere testing av PI. 2) Felles orientering. Det er viktig at Investigator nøye ordne lemmer i en lett reproduserbare orientering som vil tillate vellykket sammenligning mellom avbildning økter. Standardisering av lem plassering vil tillate Investigator å generere og anvende standardiserte ROI er som kan lagres og brukes på tvers av både fag og tid.

Totalt sett mener vi at IVIS Lumina XR gir en utmerket plattform som å modellereutviklingen av SCI-avhengige osteoporose hos mus. Muligheten til å studere bentap lengderetningen innenfor samme musen kohorten vil tillate oss å: 1) bedre forstå timelige natur bentap og demineralisering etter SCI, 2) avgjøre om disse forandringene stabilisere seg over tid, 3) utforske, med tilgjengeligheten av både transgene og null mus linjer, evnen til å studere de molekylære mekanismene bak disse patologiske forandringer i en reduksjonistisk måte, og 4) ganske muligens den viktigste fordelen, begynne å teste nye intervensjoner er utformet for å enten forebygge utvikling av osteoporose i de tidlige stadier av skade, eller for å reversere slike endringer når osteoporose har allerede utviklet. Endelig Lumina XR, i tillegg til å gi gode røntgenbilder potensial, kan også brukes til å studere både bioluminescent og fluorescerende signaler hos levende dyr. Man kan lett forestille seg innlemme den andre modaliteter tilbys innenfor dette systemet for å se på en multitude av faktorene som bestemmer bein dynamikk mechanistically følgende SCI eller annen sykdom prosess som resulterer i osteoporose.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beuthanasia	Butler Animal Health Supply	001848
Ketathesia (Ketamine Hydrochloride)	Butler Animal Health Supply	023061
Xylazine	Butler Animal Health Supply	037849
Bupivicaine	Butler Animal Health Supply	021801
Gelfoam; 7MM	Fisher Scientific	NC0085178	To promote hemostasis during surgery
IVIS Lumina XR	Caliper Life Sciences	135400
ZFOV, 2.5 cm field of view lens	Caliper Life Sciences	127285	Absolutely necessary to generate high magnification X-ray images of bone structure
QDR Bone Densitometer	Hologic		Model used no longer in production