Longitudinale Evaluatie van de muis Hind Limb botverlies na ruggenmergletsel met behulp van nieuwe, In vivo Methodologie

Summary

Een longitudinaal onderzoek van botverlies in het dijbeen en de tibiae van volwassen muizen werd uitgevoerd na een dwarslaesie met behulp van sequentiële lage dosis X-ray scans. Tibia botverlies werd ontdekt gedurende de studie, terwijl het botverlies in het dijbeen werd pas ontdekt 40 dagen na letsel.

Abstract

Ruggenmergletsel (SCI) gaat vaak gepaard met osteoporose in de sublesional regio's van het bekken en de onderste extremiteiten, wat leidt tot een hogere frequentie van fracturen ^1. Omdat deze fracturen komen vaak voor in regio's die hebben verloren normale zintuiglijke functie, de patiënt is op een groter risico op fracturen-afhankelijke ziekten, met inbegrip van de dood. SCI-afhankelijke verlies in zowel de bot mineraal dichtheid (BMD, gram / ​​cm ²⁾ en bot mineraal gehalte (BMC, gram) is toe te schrijven aan mechanische onbruik ^2, aberrante neuronale signalering ³ en hormonale veranderingen ^4. Het gebruik van knaagdiermodellen van SCI-geïnduceerde osteoporose kan waardevolle informatie met betrekking tot de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van osteoporose volgende SCI evenals een testomgeving voor het genereren van nieuwe therapieën ^5-7 (en beoordeeld in ^8). Muismodellen van de SCI zijn van groot belang omdat ze toelaten een reductionistische benadering van het mechanisme-based beoordeling door het gebruik van nul en transgene muizen. Hoewel dergelijke modellen hebben belangrijke gegevens, is er nog steeds behoefte aan minimaal-invasieve, betrouwbare, reproduceerbare en kwantificeerbare methoden bij het bepalen van de mate van botontkalking na SCI, met name over de tijd en in dezelfde cohort van proefdieren, het verbeteren van de diagnose , behandelmethoden en / of preventie van SCI-geïnduceerde osteoporose.

Een ideale methode voor het meten van de botdichtheid bij knaagdieren zouden kunnen meerdere, opeenvolgende (in de tijd) blootstelling aan lage niveaus van de X-ray straling. Deze studie beschrijft het gebruik van een nieuw geheel-dier-scanner, de IVIS Lumina XR (Remklauw Instruments) die kunnen worden gebruikt om lage-energie (1-3 milligray (mGy)) met hoge resolutie, hoge vergroting X-ray beelden te leveren van de muis achterste ledematen botten verloop van tijd na SCI. Aanzienlijk verlies van botdichtheid werd gezien in de tibiae van muizen met 10 dagen post-spinale doorsnijding in vergelijking met ongedeerd, leeftijd-gematchte controlegroep (naïeve) muizen (13% dalen, p <0,0005). Verlies van botdichtheid in de distale femur was ook detecteerbaar met 10 dagen post-SCI, terwijl een verlies van dichtheid in de proximale femur was niet detecteerbaar tot 40 dagen na de verwonding (7% dalen, p <0,05). SCI-afhankelijke verlies van de muis dijbeen dichtheid was post-mortem bevestigd door het gebruik van Dual-energy X-ray absorptiometrie (DXA), de huidige "gouden standaard" voor de botdichtheid metingen. We detecteren een 12% verlies van BMC in de bovenbenen van muizen op 40 dagen na het gebruik van de SCI IVIS Lumina XR. Dit steekt gunstig af bij een eerder gemelde BMC verlies van 13,5% door Picard en zijn collega's die DXA analyse worden gebruikt op de muis dijbeen post-mortem 30 dagen na de SCI ^9. Onze resultaten suggereren dat de IVIS Lumina XR een roman, high-resolution/high-magnification methode voor het uitvoeren van lange-termijn longitudinale metingen van achterste ledematen botdichtheid in de muis volgende SCI biedt.

Protocol

1. Muis spinale doorsnijding model

1. Volwassen, mannelijk, C57Bl6 muizen (ongeveer 20-25 g) worden verdoofd met behulp van een combinatie van ketamine (200 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Alle chirurgische ingrepen worden uitgevoerd in een Institutioneel, IACUC-goedgekeurde chirurgische suite onder steriele omstandigheden.
2. Eenmaal diep onder narcose, is de vacht van de rug gesneden met behulp van elektrische tondeuse. De geschoren rug wordt eerst gewassen met een jodiumoplossing, gevolgd door 70% ethanol.
3. Voorafgaand aan de eerste incisie, is het gebied van de rug te worden ingesneden eerste geïnfiltreerd met een plaatselijke verdoving (Marcaine) bij een concentratie van (0,25%, <1ml/kg) om postoperatieve pijn te minimaliseren.
4. Met behulp van kleine schaar, is een kleine opening gemaakt in de huid rond de L2 gebied. Deze opening is uitgebreid met dezelfde set van de schaar, uitbreiding van lengterichting van de T2 gebied. De randen van de huid worden dan uit elkaar gehouden via het gebruik van de bulldog klemmen.
5. Micro-schaar worden dan gebruiktduidelijke spierweefsel uit het dorsale ruggenmerg lamina op thoracale niveau 8 (T8). T8 kunnen worden geïdentificeerd, zoals beschreven in Kuh en Wrathall (1998) ^10. Kortom, kan T13 worden geïdentificeerd door zijn dorsale processus spinosus. Met behulp van een paar # 5 Dumont tang, kan de laatste rib worden gepalpeerd / geïdentificeerd en geteld terug naar T8. Eenmaal gewist, bot Rongeurs worden gebruikt om een ​​dorsale laminectomie presteren op T8.
6. Spinal volledige doorsnijding Laesie: Zodra het ruggenmerg wordt blootgesteld aan T8, een extra set van gesteriliseerde micro-schaar worden gebruikt om het ruggenmerg in het vlak loodrecht verbreken om de lange as van het koord onder een chirurgische microscoop. We maken gebruik van # 5 Dumont een tang om til een pool van het ruggenmerg naar de volledigheid van de laesie te bevestigen.
7. Na de spinale transsectie, een klein stukje van steriele gelfoam, gedrenkt in steriele zoutoplossing (0,9%) is zorgvuldig geplaatst in de laesie holte hemostase te bevorderen.
8. Een extra stuk van gelfoam wordt dan geplaatst over de blootliggende draaienal koord. De huid wordt dan gesloten met een steriele, roestvrij staal chirurgische nietjes. De onderwerpen zijn vervolgens terug naar hun huis kooien, geplaatst op een papieren handdoek om aspiratie van strooisel voorkomen en verwarmd met een verwarmingselement voor een periode van ongeveer 12 uur. De onderwerpen zijn ook voorzien van Hydrogel packs (ClearH2O) en voedsel pellets op de vloer van de kooien tijdens de vroege herstellen. Gewonde onderwerpen zijn in staat om toegang voedsel / water in hun eigen kooien eens hersteld van anesthesie.
9. Alle gewonde patiënten krijgen twee keer per dag handmatig blaas evacuatie (op ongeveer 12 uur) met behulp van een modificatie van de handmatige methode van Crede voor de duur van de studie (40 dagen).
10. Gewonde muizen zijn ook voorzien van tweemaal daags intraperitoneale injecties van 0,9% zoutoplossing gedurende drie dagen (0,5 cc) om te helpen hydratatie te behouden, en tweemaal daags injecties van de opiaat buprenorfine (0,05 mg / kg) tot post-operatieve pijn voor een periode van controle 5 dagen. Als dieren vertonen tekenen of pijn na de eerste periode van vijf dagen, dan zouden ze extra buprenorfine (0,05 mg / kg) per dag krijgen tot de tekenen van pijn (een beperkte mobiliteit, ineengedoken gestalte, niet te verzorgen, vocalisatie bij hantering) hebben opgelost.

2. Longitudinale beoordeling van de botdichtheid met behulp van de IVIS Lumina XR op dezelfde cohort van spinally-doorsneden muizen

1. Beginnend op dag 10 na de SCI en voortgezet op 10 dagen met intervallen tot dag 40, onderzochten we rechts en links bovenbenen en tibiae in het leven, patiënten onder narcose (doorsnijding SCI en ongedeerd leeftijd gematchte controles).
2. Op de dag van het scannen, kregen de proefpersonen overgebracht in hun huis kooien van de Instelling Vivarium gebied om de ruimte waarin de Caliper IVIS Lumina XR is gehuisvest. Alle onderwerpen worden dan verdoofd met behulp van dezelfde ketamine / xylazine cocktail eerder gebruikt in de levering van SCI. Deze cocktail zorgt voor een toestand van verdoving voor een periode van 1 tot 1,5 uur, voldoende voor de duur van de scannING procedure.
3. De onderzoeker initialiseert de Lumina XR apparaat en kan de interne camera te bereiken operationele temperatuur (-90 ° C) (~ 10 minuten).
4. Eenmaal verdoofd, is het onderwerp (doorsnijding of controle) voorzichtig op de dier-platform binnen de Lumina XR. Een hoge vergroting lens is ingevoegd in het apparaat te richten zodat zowel op dijbeen en scheenbeen regio's (Gezichtsveld 2.4X2.4cm met een sterk vergrotende lens). Als het onderwerp niet goed is gepositioneerd buiten het gezichtsveld, is de deur geopend en het onderwerp opnieuw gepositioneerd totdat de linker of rechter achterpoot ledematen in het midden (zie afbeelding 2a voor de juiste plaatsing van de achterste ledematen).
5. Eens goed geplaatst is, kan de X-ray-functie worden uitgevoerd. Maak een selectie uit de Energy drop-down lijst geschikt voor diervoeding (Wonen onderwerp, 35 Kv 100uA, gefilterd X-stralen)
6. Zodra het dier in de juiste positie, zodat de X-ray functie door check-markering X-Ray in debedieningspaneel. verwerven van de X-ray beeld. Zorg ervoor dat de gehele femur en de tibia te zien zijn (zie Figuur 2b). Ruwe beeld gegevens worden automatisch opgeslagen op de harde schijf. Vertegenwoordiger. TIFF-bestanden worden ook opgeslagen. De muis wordt dan weer in de kooi en laten herstellen onder onderzoeker observatie. Het proces wordt vervolgens herhaald met de volgende muis.
   Let op: The Living Image software toont getransformeerd X-ray beelden door standaard. Om te laten zien ruwe X-ray beelden, verwijdert u het vinkje naast de X-Ray Absorptie in het Correcties / Filtering tools. Wanneer de X-ray data is gecorrigeerd voor de absorptie, dan kunt u de relatieve dichtheid van het bot te evalueren door vergelijking van de signaal intensiteit van de meting ROI. De ROI intensiteit toeneemt met toenemende dichtheid van weefsel.

3. Beeldanalyse van IVIS X-ray scans

1. Open de software door te dubbelklikken op het levende beeld Icoon.
2. Laad een X-ray afbeelding door te klikken op de OK. The Living Image browser toont de geselecteerde gegevens samen met de gebruikers-ID, het etiket informatie, en camera-configuratie-informatie. Voor het openen van gegevens, voert u een van de volgende: de gegevens rij Dubbelklik op de rechtermuisknop op de naam van data en selecteer Laden in het snelmenu, Selecteer de gegevens rij en klikt u op Laden, of Dubbelklik op de miniatuur. Het beeld en de Tool Palette worden weergegeven. Open data is gemarkeerd in het groen in de browser.
3. Klik op de ROI Tools in de Tool Palette. In de ROI Tools, kies Meting ROI van de Type keuzelijst. Voor het laden van de drie ROI's gebruikt in dit experiment, klik op het vierkant pictogram en laden drie pleinen.
4. Met behulp van een liniaal, meet de lengte van het dijbeen. Pas de lengte van twee van de kwadraten tot 1 / 8 ^ste van de totale femur lengte. Pas de breedte van deze twee pleinen aan de totale femur lengte 1/24e. Met uw heerser, maat 1 / 8 ^ste van de afstand van het proximale uiteinde van het dijbeen, en situeren het plein, zodat het is gecentreerd in het dijbeen. Situeren het tweede vierkant, zodat ligt 1/4e van de totale dijbeen lengte van het distale uiteinde van het femur (fig. 3). Deze ROI's kunnen worden gebruikt om zowel de proximale en distale femur regio's te meten.
5. Met behulp van de heerser, meet de lengte van het scheenbeen. Pas de lengte van de derde vierkant tot 1 / 8 ^ste van de totale lengte tibia. Pas de breedte tot 1 / 30 ^ste van de totale lengte tibia. Situeren op het plein dus dat is gecentreerd en 1 / 8 ^ste van de totale lengte van de tibia afstand van het proximale uiteinde van de tibia (zie figuur 3).
6. Klik op het icoontje Measure (een potlood en liniaal). De ROI intensiteit metingen verschijnen in de X-ray beeld en de ROI-metingen tafel verschijnt. Exporteer deze tabel to de gewenste locatie als een. csv-bestand. Dit zal u toelaten om de tabel in Excel te openen.
7. Herhaal dit met al je opgeslagen foto's.
8. Consolideer al uw gegevens naar een Excel-blad. Statistische significantie werd bepaald via de Student's t-test met behulp van Microsoft Excel of SigmaPlot 11,0 software (systat Software).

4. Post-mortem analyse van de botdichtheid:

1. Na de overname van de uiteindelijke longitudinale X-ray scan binnen de IVIS Lumina XR, muizen worden vervolgens diep onder narcose gebracht met Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). Zodra diepe narcose is bereikt, worden de muizen transcardially geperfuseerd met ijs-koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing met heparain (40 mg / liter) voor exsanguinate.
2. Eenmaal exsanguinated, accijnzen beide bovenbenen. Besteed speciale zorg om zoveel mogelijk zacht weefsel te verwijderen als mogelijk, want dat is aangetoond dat metingen van de dichtheid ¹¹ beïnvloeden. Wikkel de bovenbenen met water doordrenkte gaas en op te slaan-20C tot u klaar bent om ze te analyseren.

5. DXA analyse met behulp van een Hologic QDR 4000 Bone Densitometer

1. Dooi gaas gedrenkt scheen-en transfer naar Bone Densitometer suite.
2. Kalibreer de inrichting volgens protocol van de fabrikant, ervoor zorgen dat de BMC en BMD waarden vallen binnen de aanvaardbare grenzen.
3. Plaats een koperen collimator in de machine. Hierdoor kan de gebruiker de grootte en de hoek van de X-stralen te beperken tot focus op een specifieke doelgroep.
4. Dompel de ontdooide dijbeen in een petrischaal gevuld met water (knobbels aan de linkerkant, met het dijbeen parallel aan het bed), en plaats het gewoon aan de rechterkant van de laser.
5. Voer een Biografie (een beschrijvende titel die de identificatie van dieren informatie, behandeling, enz. omvat) voor het dijbeen die u gaat scannen.
6. Geef Scan van de Selecties Menu, selecteer dan regionA hi-res. Geef uw scanparameters: Een scanning regio van 2 x 0,7489 cm, met een 0,01 inch regelafstand en 0,00499 inch punt resolutie.
   Let op: Monitor de scan terwijl deze bezig is. Als de X-stralen raster scans van het monster, om te garanderen dat er voldoende water in de kamer volledig te dekken op het bot monster.
7. Geef Analyseer onder de Analyse Selectie menu. Volg de aanwijzingen wijzen op het gehele femur als een ROI. Een rapport pagina zal komen met de berekende BMC (gram) en BMD (g / cm ^2).
8. Herhaal deze stappen om de resterende bovenbenen te analyseren.
9. Consolideer al uw gegevens naar een Excel-blad en het uitvoeren van statistische analyses (t-test).

6. Representatieve resultaten:

De relatieve botdichtheid verlies van een muis scheenbeen en dijbeen na dwarslaesie in vergelijking met de naïeve muizen is detecteerbaar met behulp van de bovengenoemde methode. Er is een aantoonbaar significante daling van de botdichtheid naslechts 10 dagen (12%, p <0,0005), met tot 15% verlies van botdichtheid bij 40 dagen (p <0,0005, figuur 4). Botdichtheid verlies in het dijbeen werd waargenomen bij 40 dagen na verwonding (7% dalen, p <0.05, figuur 5). Deze resultaten leveren het bewijs voor het gebruik van niet-invasieve x-ray imaging voor de longitudinale observatie van de botdichtheid te veranderen na ruggenmergletsel.

Met het oog op de effectiviteit van deze methode tot wat momenteel beschikbaar is te vergelijken; we de weggesneden bovenbenen van deze muizen geanalyseerd 40 dagen na het letsel met behulp van DXA beeldvorming. Een weergave van de data-output is te zien in figuur 6. Wij vonden dat er een aanzienlijk verlies van bot mineraal gehalte in de SCI muizen in vergelijking met naïeve (12% daling, p <0.05, figuur 7). Botdichtheid veranderden niet significant, maar volgde een vergelijkbare trend (figuur 8). Deze resultaten zijn vergelijkbaar met die gevonden in de literatuur; Picard et al. zagen een afname van 13,5% (p <0,001) in BMC, maar geen significante decrgemak in BMD (Picard 2008).

Figuur 1. Experimentele tijdlijn.

Figuur 2 Vertegenwoordiger oriëntatie van links achterste ledematen:. A) foto en b) x-ray.

Figuur 3. ROI afmetingen en oriëntatie binnen de regio's van de proximale femur en tibia.

Figuur 4. Botdichtheid verlies na SCI in de proximale tibia 10, 20, 30 en 40 dagen na het letsel (n = 5) ten opzichte van vergelijkbare leeftijd Naives (n = 5). Foutbalken representeren SEM; ** p <0,005, *** p <0,0005.

Figuur 6. Botdichtheid verlies na SCI in de distale femur 10, 20, 30 en 40 dagen na het letsel (n = 5) in vergelijking met leeftijd gematchte naïeve controlegroep (n = 5). Foutbalken representeren SEM; * p <0.01-0.05; ** p <0.001-0.01; *** p <0.0001-0.001; **** p <0,0001.

Figuur 7. Representatief beeld van de DXA gegevens waaruit blijkt dat BMC en BMD output.

Figuur 8. DXA analyse van het bot mineraal gehalte (gram) in de bovenbenen van SCI muizen 40 dagen na letsel (n = 5) versus leeftijd-gematchte Naives (n = 5).Foutbalken representeren SEM; * p <0,05.

Figuur 9. DXA analyse van de bot mineraal dichtheid (mg / cm ²⁾ in de bovenbenen van SCI muizen 40 dagen na letsel (n = 5) versus leeftijd-gematchte Naives (n = 5). Foutbalken representeren SEM; geen significant verschil.

Discussion

Deze studie presenteert een nieuwe, niet-invasieve methode voor het beoordelen van de dichtheid veranderingen binnen de afzonderlijke botten (tibiae en bovenbenen) in de lengterichting, binnen een cohort van muizen met behulp van de Caliper IVIS Lumina XR imaging systeem. SCI produceerde een afname van de botdichtheid in zowel scheen-en tibiae als studeerde binnen een cohort van spinally-doorsneden muizen gedurende een periode van 40 dagen test vergeleken met leeftijd-afgestemd, niet gewond, controle muizen. Onze resultaten in het dijbeen werden bevestigd, post-mortem, door het gebruik van DXA, wat suggereert dat de toepassing van de Caliper Instruments IVIS Lumina XR kan dienen als een gevoelig meetinstrument voor de lange termijn en progressieve effecten van SCI beoordelen op botverlies .

Een mogelijke voordeel voor de onderzoekers met behulp van dit systeem is de mogelijkheid om de ontwikkeling van pathologische veranderingen longitudinaal volgen in de achterste ledematen beenderen van dieren na SCI. De mogelijkheid om een ​​cohort te beoordelen over langere perioden biedt stRong voordelen voor de onderzoeker op het gebied van: 1) kosten in verband met dieren aankoop en langdurige zorg. In plaats van een studie waarbij grote aantallen dieren die moeten worden opgeofferd op specifieke tijdstippen om tijdsafhankelijke veranderingen te beoordelen, kunnen deze pathologische uitkomsten worden gevolgd binnen dezelfde cohort over diezelfde periode, 2) variabiliteit: naast vergelijking met controle cohorten, kunnen de uitkomsten worden gegenereerd binnen de single cohort van gewonden onderwerpen worden beoordeeld en vergeleken tussen de tijdstippen voor dezelfde dieren in de omvang van de studie, nogmaals, het verminderen van zowel intra-variabiliteit dier, alsmede de behoefte aan grotere cohorten van de proefpersonen.

Terwijl de Caliper IVIS Lumina XR heeft ons belangrijke longitudinale informatie over de ontwikkeling van SCI-geïnduceerde osteoporose, zijn er beperkingen die moeten worden genomen: 1), terwijl dit platform heeft ons toegelaten om met hoge resolutie X-ray DAT generereneen in de achterste ledematen beenderen van muizen na SCI, kan het nut ervan beperkt worden tot kleine knaagdieren zoals muizen. De maximale hoogte onderwerp toegestaan ​​binnen de Lumina XR is 2,8 cm. Alles boven die hoogte kan niet met succes worden afgebeeld met behulp van de X-ray component van de Lumina XR. In onze handen, heeft dit uitgesloten ons vermogen om ratten studie in de 200 tot 250 gram gewicht. Hoewel het misschien mogelijk om de afbeelding ratten onder dit gewicht bereik of andere knaagdieren zoals hamsters of gerbils, zal dit extra onderzoek door de PI. 2) Gezamenlijke oriëntatie. Het is cruciaal dat de onderzoeker zorgvuldig de ledematen in een gemakkelijk reproduceerbaar oriëntatie die een succesvolle vergelijking tussen beeldvormende bijeenkomsten zal organiseren. Standaardisatie van ledematen plaatsing zal de onderzoeker te genereren en toe te passen gestandaardiseerde ROI's die kunnen worden opgeslagen en toegepast op zowel de onderwerpen en de tijd.

Over het algemeen geloven we dat de IVIS Lumina XR een uitstekend platform om mee te model biedtde ontwikkeling van de SCI-afhankelijke osteoporose bij muizen. De mogelijkheid om botverlies longitudinaal onderzoek binnen dezelfde muis cohort zal ons toelaten om: 1) hoe beter de tijdelijke aard van botverlies en demineralisatie te begrijpen na de SCI, 2) bepalen of deze veranderingen te stabiliseren in de tijd, 3) te verkennen, met de beschikbaarheid van zowel transgene en null muis lijnen, de mogelijkheid om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze pathologische veranderingen in een reductionistische manier, en 4) studie misschien wel het belangrijkste voordeel, beginnen met het nieuwe interventies ontwikkeld om te voorkomen, de ontwikkeling van osteoporose in de vroege stadia testen van letsel, of, om zulke veranderingen te keren zodra osteoporose is al ontwikkeld. Ten slotte is de Lumina XR, naast het verstrekken van uitstekende X-ray imaging potentieel, kan ook worden gebruikt om zowel bioluminescente en fluorescerende signalen in levende dieren te bestuderen. Men kan zich gemakkelijk voorstellen waarin de andere modaliteiten aangeboden binnen dit systeem om te kijken naar een mulveelomvattende factoren die mechanisch bot dynamiek vast te stellen na SCI of een andere ziekte proces dat resulteert in osteoporose.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beuthanasia	Butler Animal Health Supply	001848
Ketathesia (Ketamine Hydrochloride)	Butler Animal Health Supply	023061
Xylazine	Butler Animal Health Supply	037849
Bupivicaine	Butler Animal Health Supply	021801
Gelfoam; 7MM	Fisher Scientific	NC0085178	To promote hemostasis during surgery
IVIS Lumina XR	Caliper Life Sciences	135400
ZFOV, 2.5 cm field of view lens	Caliper Life Sciences	127285	Absolutely necessary to generate high magnification X-ray images of bone structure
QDR Bone Densitometer	Hologic		Model used no longer in production