Summary
（COX / SDH），细胞色素C氧化酶/钠脱氢酶双标记方法允许直接可视化的新鲜冷冻组织切片中线粒体呼吸酶的缺陷。这是一个简单的组织化学技术，并在调查线粒体疾病，老化和衰老有关的疾病非常有用。
Abstract
线粒体DNA（mtDNA）的缺陷是疾病的重要原因，可能背后的老龄化和老龄化有关的改建1,2。衰老的线粒体理论表明mtDNA突变的作用，它可以改变生物能动态平衡和细胞的功能，在衰老过程中 3 。财富已编译的证据支持这一理论的1,4，例如线粒体DNA的mutator鼠标5;然而，线粒体老化损坏的确切作用是不完全了解6,7。
观察呼吸酶的活性，是一个简单的方法进行调查线粒体功能障碍。复杂的四，或细胞色素 c氧化酶（COX），是对线粒体功能至关重要。环氧合酶的催化亚基由线粒体DNA编码和复杂的装配（图1）是必不可少的。因此，适当的合成和功能主要是基于对线粒体DNA的完整性 2 。虽然可以调查其他呼吸道疾病复合物，复合物IV和II是最适合组织化学检查 8,9 。复杂的二，或琥珀酸脱氢酶（SDH），完全是由核DNA（图1）编码，其活动通常不会受损线粒体的影响，虽然增加可能表明线粒体生物合成10-12。观察受损的线粒体DNA在线粒体疾病，老化，与年龄有关的疾病往往导致低或缺乏COX活性2,12-14细胞的存在。虽然COX和SDH活动可以单独进行调查，15,16连续的双标记方法已被证明是在寻找与细胞线粒体功能障碍 12,17-21有利。
许多检测的最佳宪法已经确定，如底物浓度，电子受体/捐助者，中间电子载体，pH值的影响，反应吨IME 9,22,23。 3,3' -二氨基联苯胺（DAB）是一种有效和可靠的电子供体 22 。在运作的COX细胞，棕色indamine聚合物产品本地化线粒体嵴和饱和细胞22。因此，这些细胞功能失调的COX将不饱和民建联产品，硝基四氮唑（NBT），电子受体的减少SDH活性的可视化，一个蓝色的甲臜最终产品9,24。添加到细胞色素 C和琥珀酸钠基板内源性水平之间的控制和患病/突变体的组织 9正常化。过氧化氢 酶增加一条，作为一项预防措施，以避免可能的污染从过氧化物酶的活性 9,22反应。 methosulfate吩嗪（PMS），中间电子载体，是叠氮化钠，呼吸链抑制剂，结合使用，以增加形成的最终反应产物 9,25 。尽管这一通知ATION，影响这个看似简单的检测结果的一些关键细节，除了特异性的控制和在技术的进步，都尚未提出。
Protocol
1。组织编制为cryosectioning
- 按照与现有的伦理许可证牺牲的动物，无论是颈椎脱位或斩首。
- 快速收集利益的组织（如大脑），并迅速冻结干冰（组织可能需要用液态氮冷冻，以获得最佳的形态在戊烷或丙烷冻结）。铝箔存储于-80℃直至组织准备节。
- cryosectioning冰冻组织嵌入在准备。
- 收集14微米的低温恒温器部分在-21 ° C（可能需要调整温度± 1-2 ° C）。解冻部分上使用coverslipping直到准备使用在-20 ° C加热块，并将其存储幻灯片的幻灯片。
2。环氧合酶组织化学
- 让幻灯片在室温下干燥1小时。将幻灯片在幻灯片用湿滤纸染色室，切成条状。为了获得consisten在每个实验吨结果，建议处理最多10％实验幻灯片，以尽量减少时间延误。
- 准备下化学罩1X民建联，100微米0.1 M的PBS pH值= 7.0细胞色素C。涡迅速。
- 新增2微克牛过氧化氢 酶（2微克毫升 -1或-1毫升约4 IU）。震荡向上突破所有的过氧化氢酶颗粒混合。
- 应用150 - 200μL孵化中期到每个幻灯片，使用枪头，均匀地分布到所有路段。
- 40分钟的幻灯片在37 ° C。
- 从幻灯片中删除多余的解决方案。洗净幻灯片4次，每次10分钟，在0.1 M的PBS pH值= 7.0。
- 返回幻灯片，幻灯片染色室，用湿纸条。
3。 SDH组织化学
- 准备下一个化学罩1.5毫米NBT，琥珀酸钠130毫米，0.2毫米的PMS，叠氮化钠在0.1 M的PBS pH值= 7.0和1.0 mm。注意屏蔽PMS的由轻。涡迅速。
- 150-200μL孵化介质应用到每个幻灯片，使用枪头，均匀地分布到所有路段。
- 40分钟的幻灯片在37 ° C。
- 从幻灯片中删除多余的解决方案。洗净幻灯片4次，每次10分钟，在0.1 M的PBS pH值= 7.0。
- 在以下浓度的乙醇脱水为2分钟的幻灯片：70％，70％，95％，95％，99.5％。然后让一个额外的99.5％步骤10分钟。
- 广场幻灯片二甲苯10分钟。山与Entellan和盖玻片。允许的幻灯片干燥通风的地方过夜，或至少1-2小时。
4。线粒体功能障碍的测定
- 线粒体功能障碍的金额是由蓝染色细胞的数量表示。半量化这些款项，幻灯片应编码和明场显微镜下观察。应该盲目进行半定量规模的基础上使用，例如从0-4（0，没有蓝染色; 4，只有蓝染色）。最好是从一个给定的主题/动物的几个部分执行这种半定量计算出每个主题/动物的平均值。
- 统计应使用非参数检验，如曼 - 惠特尼或克鲁斯卡尔 - 沃利斯。
5。适当的特异性控制
- 特异性COX活性控制，重复“考克斯组织化学”的步骤，并添加2.5毫米的叠氮化钠，终端呼吸链抑制剂。
- 对于SDH活性的特异性控制，重复“的SDH组织化学步骤，”琥珀酸钠的去除和另外50毫米丙二酸，SDH的竞争性抑制剂。
- 洗涤和脱水乙醇系列中的一个部分，然后装入和盖玻片步骤3.4中所述的幻灯片 - 3.6。
6。代表性的成果：
帐篷“的总体方案>的适当的COX / SDH双标从野生型和过早衰老线粒体DNA的mutator小鼠的大脑切片组织化学的COX / SDH双标签组织化学检测，如图2所示。代表性的例子显示在图3暗棕黄色染色（图3，左图）在野生型小鼠表现出正常的COX活性细胞呼吸链指出不足之处，由蓝染色，在12周大的线粒体DNA的mutator小鼠显示，这些不足之处成为线粒体DNA的mutator岁至46周（图3，中心和右侧面板）小鼠更广泛。不适当的COX / SDH双标记野生型小鼠的大脑由于不足的COX标签部分的例子如图4所示。 COX活性的示范孵化时间不足，或减少coverslipping孵化过程中的幻灯片，氧分子的可用性，导致在民建联的反应减少沉积离子产品，从而形成蓝色甲臜最终产品允许在SDH孵化。
COX和SDH活动也可以被单独调查（图5，左，中心）;然而，连续的标签是有助于识别与COX缺陷的细胞，由于在SDH孵化形成的蓝色沉淀（图3，中心和右）。特异性COX和SDH活动的控制，也可以做（图5，右）。
图1。线粒体呼吸配合物四 。线粒体呼吸链位于内膜，包括五个复合物。呼吸链的目的是从复杂的运输电子I至IV和这样做，它创建了一个跨内膜复杂V（ATP酶）用于产生ATP的质子梯度。 represe红色六边形新台币亚基由线粒体DNA编码。白色的六边形代表由核DNA（注意是完全的核基因组编码的复杂II）编码的亚基。因此，在线粒体基因组的突变可能会导致呼吸链功能障碍由于呼吸链复合物的亚基突变。
图2的COX / SDH双标组织化学检测流程图 。解剖感兴趣的器官，迅速冻结干冰组织，并存储他们在 - 80 ° C。收集低温恒温器的部分，并保持在 - 20℃直至使用。允许在室温下风干节1小时。孵化介质准备的COX组织化学，应用幻灯片，和40分钟在37 ° C。 PBS中4次，每次洗10分钟，洗净的部分。准备用于SDH组织化学孵化介质，适用于它的SLIDES，并再次在37 ° C孵育40分钟再次在PBS清洗部分，在乙醇系列脱水，然后装入和盖玻片的幻灯片。准备明场显微镜下查看1-2个小时内的COX / SDH双标部分。
图3的COX / SDH双标代表性的例子 。从野生型和过早衰老线粒体DNA的mutator小鼠的大脑切片顺序标示COX和SDH活动。 （比例尺：200微米）普通COX活性（深褐色表示）是从野生型小鼠的海马（左）所示。 COX缺陷（以蓝色表示），揭示了从线粒体的mutator小鼠的海马区（中心和右）。有mtDNA中的mutator小鼠的年龄由46个星期在COX活性的进一步下降，这表明呼吸链功能障碍的广泛发作。观察线粒体在线粒体DNA的mutator小鼠12线粒体功能障碍是引起mtDNA的点突变，以及增加5线性缺失水平高的水平。
图4。不适当的COX / SDH双标签的例子。从野生型小鼠的大脑切片顺序标示COX和SDH活动。 （比例尺：200微米）的孵育时间不足COX活性的示范（10和25分钟），在减少褐色DAB反应产物沉积，相比到40分钟的孵育时间（左边和中间的）。允许的蓝色甲臜最终产品的过程中形成的SDH孵化缩短孵化时间，误导性暗示与COX缺陷细胞的存在。 Coverslipping在COX孵化的幻灯片，也导致不准确的形成和沉积民建联的反应离子产品（右）。
图5，我ndividual COX和SDH的标签和特异性控制 。来自野生型小鼠的脑切片分别标示为深褐色和蓝色，分别为（左边和中间的）表示COX和SDH活动，。虽然COX和SDH活动可以单独标签，连续标签已被证明是定位与细胞线粒体功能障碍的优势。为特异性COX和SDH活动，从野生型小鼠在大脑控制的一个例子显示的标签的情况下（右）。 （比例尺：200微米）。
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Discussion
合并COX / SDH组织化学方法使细胞线粒体功能障碍的可视化。这种技术，与早期的研究可追溯到到1968年，仍然深受市民欢迎，许多考虑它的“金标准”，确定线粒体疾病患者14,19,26,27。现在常用的调查mtDNA突变驱动的老化和衰老相关的疾病 12,13,18,20,21,24 。 COX / SDH双标记方法经常被用来与其他技术的同时，确定具体的mtDNA突变，并进一步调查，如oximetric测量和分光光度酶分析28,29 ，线粒体呼吸酶。
在其长期使用，但重要的细节，简单的特异性控制，和进步，改善方法都尚未提出。在组织的处理方面，重要的是要使用新鲜冰冻组织与本techniqUE，因为虽然考克斯将生存福尔马林固定，SDH不会。虽然这是一个技术的限制，已发现没有验尸报告延迟干涉用这种方法 24，但建议迅速取出感兴趣的器官保存形态。然而，连续冻融循环的组织和部分应尽量避免。干冰，可能会被冻结的组织样本，但是，一些组织可能需要在戊烷或用液氮冷却，以获得最佳的形态，并避免冻结文物丙烷冻结。也应确定适当的低温恒温器部分取决于组织型，厚度。它是建议收集在8 - 14微米的部分，足够薄的解决方案，但足够厚，以保持脱水后的解剖特点渗透之间。建议低温恒温器的温度-21 ° C可能需要调整± 1-2 ° C。如果试样太冷，部分可能会卷曲，如果它是太热情，部分可能会粘在刀。随着幻灯片的处理方面，油脂笔的使用，这往往是有利于在幻灯片上的孵化中期，应尽量避免。相反，使用150 - 200μL每张幻灯片的孵化中期，根据第。盖玻片孵化过程中也应避免使用，直到幻灯片准备好要安装的，因为氧分子，必须在COX标签的步骤（图4）目前。最后，建议使用市售的DAB溶液（如Sigma公司），更安全的替代准备DAB溶液结晶固体。民建联的解决方案也可以从现有的药片，但这款平板基于DAB溶液使用时发现的，不一致的COX标签结果。
要获得这个生化分析是一致的和可靠的结果，有以下几点建议。在每个experimen使用新鲜配制的PBS和乙醇T.准备库存解决方案，细胞色素 C，NBT，市政服务（从光盾），丁二酸钠，叠氮化钠，和丙二酸在0.1 M的PBS pH值= 7.0，0.1 M盐酸或0.1 M的氢氧化钠调整pH至7.0。分装和储存在-20 ° C股票的解决方案，并迅速解冻的解决方案，只是在使用前。为了获得一致的结果，在每次实验，这是建议的过程最多10％实验幻灯片，以尽量减少时间延误。有一些实验之间的变异性，因此，从每个主题/动物的部分应重复至少三至四次，并应在每次实验中使用适当的控制。最后，孵育时间不影响COX标签（图4，左边和中间板）和SDH标签的数量，不建议改变孵育时间超过5％（2分钟）。
合并COX / SDH协议这里介绍是基于先前所描述的9,22,23,25原则。正如许多technqiues，此协议的变化，如不包括PMS和叠氮化钠此外，使用水mountant，和不同的孵化和冲洗时间，确实存在，同样也可能工作。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国家衰老研究所（AG04418），国家药物滥用研究所，国立卫生卡罗林斯卡医学院研究生院合作计划研究院，卡罗林斯卡医学院，瑞典研究理事会，瑞典脑动力，和瑞典的脑基金会。非常感谢马蒂亚斯Karlen博士和朱Coppotelli与图1和2，分别创造性的支持;卡琳Pernold技术援助和Drs。巴里J. Hoffer，拉尔斯奥尔森和尼尔斯戈兰拉尔森许多有益的建议和讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 | |
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm International | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ | |
| Cover glasses Borosilicate glass | VWR international | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 | 430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 | |
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 | |
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 | |
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 | PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 | |
| Xylene | VWR international | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR international | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) | Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
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