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Mitochondrial श्वसन समारोह के विज़ुअलाइज़ेशन साइटोक्रोम का उपयोग सी डिहाइड्रोजनेज / oxidase Succinate (/ कॉक्स SDH) डबल - लेबलिंग ऊतकरसायनशास्त्र

Published: November 23, 2011 doi: 10.3791/3266
Automatic Translation
1,2
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2National Institute on Drug Abuse (NIDA)

Summary

साइटोक्रोम ग डिहाइड्रोजनेज / oxidase सोडियम (/ कॉक्स SDH) विधि डबल लेबलिंग mitochondrial ताजा जमे हुए ऊतक वर्गों में सांस एंजाइम की कमी के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है. यह एक सरल histochemical तकनीक है और mitochondrial रोगों, उम्र बढ़ने, और उम्र बढ़ने से संबंधित विकारों की जांच में उपयोगी है.

Protocol

1. Cryosectioning के लिए ऊतक की तैयारी

  1. या तो ग्रीवा अव्यवस्था या कत्ल के द्वारा उपलब्ध नैतिक परमिट के साथ अनुसार पशु बलिदान.
  2. जल्दी ब्याज के ऊतकों (जैसे मस्तिष्क) जमा है, और तेजी से सूखी बर्फ (ऊतकों तरल नाइट्रोजन के साथ ठंडा करने के लिए इष्टतम आकारिकी प्राप्त isopentane या प्रोपेन में ठंड की आवश्यकता हो सकती है) पर स्थिर. -80 पर एल्यूमीनियम पन्नी में स्टोर ऊतकों ° सी अनुभाग जब तक करने के लिए तैयार है.
  3. तैयारी में cryosectioning के लिए जमे हुए ऊतक एम्बेड.
  4. -21 में 14 सुक्ष्ममापी cryostat वर्गों लीजिए डिग्री सेल्सियस (तापमान को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकता है 1-2 ± ° सी). जब तक का उपयोग करने के लिए तैयार -20 डिग्री सेल्सियस पर coverslipping के बिना हीटिंग, ब्लॉक, और दुकान स्लाइड्स का उपयोग कर स्लाइड्स पर पिघलना वर्गों.

2. कॉक्स ऊतकरसायनशास्त्र

  1. स्लाइड्स 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति दें. गीला फिल्टर पेपर के साथ एक स्लाइड धुंधला चैम्बर में स्लाइड्स रखो, स्ट्रिप्स में कटौती. Consisten प्राप्त करने के लिएप्रत्येक प्रयोग में टी परिणाम, यह प्रयोग प्रति दस स्लाइड्स की अधिकतम प्रक्रिया समय देरी को कम करने के लिए सिफारिश की है.
  2. एक रासायनिक हुड 1X थपका के तहत तैयार करने के लिए, 100 सुक्ष्ममापी 0.1 एम पीबीएस = पीएच 7.0 में ग साइटोक्रोम. जल्दी भंवर.
  3. 2 गोजातीय catalase μg (2 μg मिलीलीटर -1 या लगभग 4 आइयू -1 मिलीलीटर) जोड़ें. Catalase की सभी अनाज को तोड़ने vortexing से अच्छी तरह मिक्स.
  4. 150 लागू करें - प्रत्येक स्लाइड के लिए ऊष्मायन माध्यम के 200 μL, पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए सभी वर्गों पर समान रूप से फैला.
  5. 37 पर 40 मिनट के लिए स्लाइड्स को सेते डिग्री सेल्सियस
  6. स्लाइड्स से अधिक समाधान निकालें. धो 0.1 एम पीबीएस = पीएच 7.0 में 4 बार, 10 मिनट प्रत्येक समय, स्लाइड.
  7. स्लाइड - धुंधला चैम्बर गीला कागज के स्ट्रिप्स के साथ स्लाइड्स लौटें.

3. SDH ऊतकरसायनशास्त्र

  1. एक रासायनिक 1.5 मिमी एनबीटी, 130 मिमी सोडियम succinate, 0.2 मिमी पीएमएस, और 0.1 एम पीबीएस = पीएच 7.0 में 1.0 मिमी सोडियम azide हुड के तहत तैयार. लो ढाल सावधानीप्रकाश से पीएमएस. जल्दी भंवर.
  2. प्रत्येक स्लाइड के लिए ऊष्मायन माध्यम से 150-200 μL लागू करने के लिए, पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए सभी वर्गों पर समान रूप से फैला.
  3. 37 पर 40 मिनट के लिए स्लाइड्स को सेते डिग्री सेल्सियस
  4. स्लाइड्स से अधिक समाधान निकालें. धो 0.1 एम पीबीएस = पीएच 7.0 में 4 बार, 10 मिनट प्रत्येक समय, स्लाइड.
  5. 70%, 70%, 95%, 95%, 99.5% इथेनॉल के निम्नलिखित सांद्रता में 2 मिनट के लिए स्लाइड्स निर्जलीकरण. फिर एक अतिरिक्त 99.5% चरण में 10 मिनट की अनुमति देते हैं.
  6. प्लेस 10 मिनट के लिए xylene में स्लाइड. Entellan और coverslip के साथ माउंट. स्लाइड एक हवादार क्षेत्र में रातोंरात, या कम से कम 1-2 घंटे शुष्क करने की अनुमति दें.

4. Mitochondrial रोग का निर्धारण

  1. mitochondrial रोग की राशि सेलुलर नीले धुंधला की राशि से संकेत दिया है. इन राशियों को अर्द्ध - यों के लिए, स्लाइड और कोडित किया जाना चाहिए उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत कल्पना. अर्ध - मात्रा का ठहराव एक अंधे पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए एक पैमाने का उपयोग कर आधार, 0-4 (0, कोई नीले रंग धुंधला हो जाना, 4, केवल नीले रंग धुंधला हो जाना) से उदाहरण के लिए. यह सबसे अच्छा है किसी दिए गए विषय / जानवर से कई वर्गों पर अर्द्ध मात्रा का ठहराव के इस तरह के प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक विषय / पशु के लिए एक मतलब मूल्य की गणना.
  2. सांख्यिकी मान व्हिटनी या Kruskal वालिस जैसे एक गैर पैरामीट्रिक परीक्षण का उपयोग किया जाना चाहिए.

5. उपयुक्त विशिष्टता नियंत्रण

  1. कॉक्स गतिविधि के लिए विशिष्टता नियंत्रण के लिए, "कॉक्स ऊतकरसायनशास्त्र" कदम दोहराएँ, और 2.5 मिमी सोडियम azide, एक टर्मिनल श्वसन श्रृंखला अवरोध करनेवाला जोड़ने.
  2. SDH गतिविधि के लिए विशिष्टता नियंत्रण के लिए, सोडियम succinate को हटाने और 50 मिमी malonate, SDH की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध करनेवाला के अलावा के साथ "SDH ऊतकरसायनशास्त्र" कदम दोहराएँ.
  3. धो और एक श्रृंखला में इथेनॉल वर्गों निर्जलीकरण, और फिर माउंट और स्लाइड्स के रूप में 3.4 चरणों में वर्णित coverslip - 3.6.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

"तम्बू> / कॉक्स SDH डबल histochemical परख लेबलिंग चित्रा 2 में सचित्र है. जंगली प्रकार और समय से पहले उम्र बढ़ने mtDNA mutator चूहों से मस्तिष्क वर्गों में उचित ऊतकरसायनशास्त्र कॉक्स / SDH डबल - लेबलिंग का प्रतिनिधि उदाहरण के समग्र योजना चित्र में दिखाया गया हैं 3. जंगली प्रकार चूहों में काले भूरे रंग धुंधला हो जाना (चित्रा 3, बाएं पैनल) सामान्य कॉक्स गतिविधि दिखाया सांस श्रृंखला की कमी है, नीले रंग धुंधला हो जाना द्वारा संकेत के साथ कक्ष, 12 सप्ताह पुरानी mtDNA mutator चूहों में पता चला रहे थे, और इन कमियों बन गए mtDNA mutator 46 सप्ताह (3 चित्रा, केंद्र और सही पैनल) के लिए आयु वर्ग के चूहों के रूप में व्यापक.

अनुचित कॉक्स / SDH जंगली प्रकार अपर्याप्त कॉक्स लेबलिंग के कारण चूहों से मस्तिष्क वर्गों में डबल - लेबलिंग का उदाहरण 4 चित्र में दिखाए जाते हैं. कॉक्स गतिविधि के प्रदर्शन के लिए अपर्याप्त ऊष्मायन समय, या ऊष्मायन के दौरान स्लाइड coverslipping द्वारा आणविक ऑक्सीजन की उपलब्धता को कम करने, थपका प्रतिक्रिया का एक कम बयान के परिणामस्वरूपआयन उत्पाद है, और इस तरह SDH ऊष्मायन के दौरान नीले formazan अंत उत्पाद के गठन के लिए अनुमति दी.

कॉक्स और SDH गतिविधियों को भी अलग से जांच किया जा सकता है (चित्रा 5, छोड़ दिया और केंद्र), तथापि, अनुक्रमिक लेबलिंग कॉक्स कमियों के साथ कोशिकाओं, SDH ऊष्मायन के दौरान (चित्रा 3, केंद्र और नीले वेग के गठन की वजह से पहचान करने में उपयोगी है दाएं). कॉक्स और SDH गतिविधियों के लिए विशिष्टता नियंत्रण भी किया जा सकता है (चित्रा 5, सही).

चित्रा 1
चित्रा 1 Mitochondrial सांस परिसर चतुर्थ. mitochondrial श्वसन श्रृंखला भीतर की झिल्ली के भीतर स्थित है और पांच परिसरों शामिल है. सांस की श्रृंखला के उद्देश्य परिसर से इलेक्ट्रॉनों मैं चतुर्थ और कर रहे हैं तो यह भीतरी परिसर वी (ATPase) द्वारा इस्तेमाल किया एटीपी उत्पादन झिल्ली भर में एक प्रोटॉन ढाल बनाता में परिवहन है. रेड hexagons represeNT के सब यूनिटों mtDNA द्वारा इनकोडिंग. व्हाइट परमाणु डीएनए (कृपया ध्यान दें कि परिसर द्वितीय पूरी तरह से परमाणु जीनोम से एन्कोडेड है) द्वारा इनकोडिंग hexagons सब यूनिटों का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस प्रकार, mitochondrial जीनोम में परिवर्तन सांस सांस श्रृंखला परिसरों के सब यूनिटों में परिवर्तन की वजह से श्रृंखला की शिथिलता का कारण बन सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. कॉक्स / SDH लेबलिंग डबल histochemical परख के फ्लो चार्ट. ब्याज के अंगों को काटना, तेजी से सूखी बर्फ पर ऊतकों फ्रीज, और उन पर दुकान - 80 डिग्री सेल्सियस Cryostat वर्गों लीजिए और रख - 20 ° जब तक सी उपयोग. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हवा शुष्क वर्गों की अनुमति दें. कॉक्स ऊतकरसायनशास्त्र के लिए ऊष्मायन मध्यम तैयार करने के लिए, स्लाइड्स के लिए लागू होते हैं, और 37 पर 40 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस पीबीएस 4 बार में 10 मिनट प्रत्येक धोने के लिए वर्गों धो लें. SDH ऊतकरसायनशास्त्र के लिए ऊष्मायन मध्यम तैयार करने के लिए, यह sli के लिए लागूडेस, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए सेते वर्गों पीबीएस में फिर से धो, एक श्रृंखला में इथेनॉल निर्जलीकरण, और तब माउंट और स्लाइड्स coverslip. / कॉक्स SDH डबल लेबल वर्गों के लिए 1-2 घंटे के भीतर उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत देखने के लिए तैयार हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3 / कॉक्स SDH डबल लेबलिंग के प्रतिनिधि उदाहरण हैं. जंगली प्रकार और समय से पहले उम्र बढ़ने mtDNA mutator चूहों से मस्तिष्क वर्गों sequentially कॉक्स और SDH गतिविधियों के लिए लेबल रहे थे. (स्केल पट्टी: 200 सुक्ष्ममापी) सामान्य कॉक्स गतिविधि (गहरे भूरे रंग से इंगित) जंगली प्रकार चूहों (बाएं) से हिप्पोकैम्पस में दिखाया गया था. कॉक्स कमियों (नीले रंग से इंगित) mtDNA mutator चूहों (केंद्र और सही) से हिप्पोकैम्पस में पता चला रहे थे. वहाँ mtDNA mutator चूहों में उम्र के 46 सप्ताह के द्वारा कॉक्स गतिविधि में आगे कमी थी, सांस की श्रृंखला में शिथिलता के व्यापक गहरा सुझाव. मनाया मिटोmtDNA mutator चूहों में 12 chondrial शिथिलता mtDNA बिंदु के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परिवर्तन रैखिक 5 विलोपन के स्तर में वृद्धि की उच्च स्तर की वजह से है.

चित्रा 4
चित्रा 4 अनुचित कॉक्स / SDH डबल - लेबलिंग के उदाहरण.. जंगली प्रकार चूहों से मस्तिष्क वर्गों sequentially कॉक्स और SDH गतिविधियों के लिए लेबल रहे थे. (स्केल पट्टी: 200 सुक्ष्ममापी) कॉक्स गतिविधि के प्रदर्शन के लिए अपर्याप्त ऊष्मायन बार (10 और 25 मिनट) भूरे रंग थपका प्रतिक्रिया उत्पाद का एक कम बयान में हुई 40 मिनट ऊष्मायन समय छोड़ दिया और (बीच में) की तुलना में,. छोटा ऊष्मायन SDH ऊष्मायन के दौरान नीले formazan अंत उत्पाद के गठन के लिए अनुमति दी बार, गुमराह कॉक्स कमियों के साथ कोशिकाओं की उपस्थिति का सुझाव दे. कॉक्स ऊष्मायन के दौरान स्लाइड्स Coverslipping भी गलत और थपका प्रतिक्रिया के गठन के बयान के परिणामस्वरूपआयन उत्पाद (दाएं).

चित्रा 5
चित्रा 5 मैं ndividual कॉक्स और SDH लेबलिंग और विशिष्टता नियंत्रण. जंगली प्रकार चूहों से मस्तिष्क वर्गों कॉक्स और SDH गतिविधियों, गहरे भूरे रंग और नीले रंग क्रमशः (बाएं और केंद्र) ने संकेत दिया के लिए लेबल अलग थे. हालांकि कॉक्स और SDH गतिविधियों को व्यक्तिगत रूप से लेबल किया जा सकता है, अनुक्रमिक लेबलिंग mitochondrial रोग के साथ कोशिकाओं का पता लगाने में फायदेमंद साबित हुई है. कॉक्स और SDH गतिविधियों के मस्तिष्क में एक जंगली प्रकार माउस से के लिए एक विशिष्टता नियंत्रण का एक उदाहरण लेबलिंग के अभाव (दाएं) से पता चला. (स्केल पट्टी: 200 सुक्ष्ममापी)

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Discussion

संयुक्त कॉक्स / SDH histochemical विधि mitochondrial रोग के साथ कोशिकाओं के दृश्य सक्षम बनाता है. यह तकनीक प्रारंभिक अध्ययन 1968 तक वापस डेटिंग के साथ, कई 14,19,26,27 रोगियों में mitochondrial रोगों की पहचान के लिए "सोने के मानक 'पर विचार के साथ लोकप्रिय बनी हुई है. अब यह अक्सर mtDNA उत्परिवर्तन संचालित उम्र बढ़ने और बुढ़ापे से संबंधित विकारों 12,13,18,20,21,24 की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया. कॉक्स / SDH डबल लेबलिंग विधि अक्सर अन्य तकनीकों के साथ समानांतर में प्रयोग किया जाता है के लिए विशिष्ट mtDNA म्यूटेशन की पहचान के लिए और आगे oximetric मापन और spectrophotometric एंजाइम 28,29 विश्लेषण जैसे mitochondrial श्वसन एंजाइमों , की जांच.

इसके उपयोग के लंबे समय से चली आ रही के बावजूद, अभी तक महत्वपूर्ण जानकारी, सरल विशिष्टता नियंत्रण, और अग्रिम करने के लिए विधि में सुधार नहीं प्रस्तुत किया गया है. से निपटने के लिए ऊतक के संबंध में, यह महत्वपूर्ण है इस techniq के साथ ताजा जमे हुए ऊतक का उपयोग करेंue, हालांकि कॉक्स formalin निर्धारण बच जाएगा क्योंकि, SDH नहीं होगा. हालांकि इस तकनीक की एक सीमा है, कोई देरी पोस्टमार्टम करने के लिए इस विधि के साथ 24 हस्तक्षेप पाया गया है, लेकिन यह जल्दी से ब्याज के अंगों को हटाने के लिए आकारिकी संरक्षित करने का सुझाव दिया है. हालांकि, ऊतकों और वर्गों के सतत फ्रीज पिघलना चक्र बचा जाना चाहिए. ऊतकों के नमूनों सूखी बर्फ पर जमे हुए किया जा सकता है, तथापि, कुछ ऊतकों isopentane या तरल नाइट्रोजन के साथ ठंडा करने के लिए इष्टतम प्राप्त आकारिकी और ठंड कलाकृतियों से बचने प्रोपेन में ठंड की आवश्यकता हो सकती है. cryostat वर्गों, ऊतक प्रकार के आधार पर, उचित मोटाई भी निर्धारित की जानी चाहिए. 14 - सुक्ष्ममापी वर्गों, समाधान, लेकिन काफी मोटी निर्जलीकरण के बाद संरचनात्मक सुविधाओं के संरक्षण के प्रवेश के लिए काफी पतली - यह 8 के बीच एकत्र की सिफारिश की है. सुझाव -21 के cryostat तापमान डिग्री सेल्सियस ± 1-2 ° सी. समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है अगर नमूना बहुत ठंड है, अनुभाग कर्ल, अगर हो सकता हैयह बहुत गर्म है, अनुभाग चाकू छड़ी सकता है. स्लाइड्स की हैंडलिंग के संबंध के साथ, एक तेल कलम, जो अक्सर स्लाइड पर ऊष्मायन माध्यम को ध्यान में रखते हुए फायदेमंद के उपयोग से बचा जाना चाहिए. इसके बजाय, 150 का उपयोग करें - वर्गों की संख्या के आधार पर स्लाइड प्रति ऊष्मायन मध्यम के 200 μl. ऊष्मायन के दौरान एक coverslip का उपयोग भी जब तक स्लाइड के लिए मुहिम शुरू हो तैयार है क्योंकि आणविक ऑक्सीजन कॉक्स लेबलिंग कदम (चित्रा 4) के दौरान उपस्थित होना चाहिए बचा जाना चाहिए. अंत में, यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध थपका (जैसे सिग्मा) समाधान, एक सुरक्षित क्रिस्टलीय ठोस से थपका समाधान की तैयारी के लिए वैकल्पिक का उपयोग करने का सुझाव दिया है. थपका समाधान भी उपलब्ध गोलियों से बना जा सकता है, लेकिन असंगत कॉक्स लेबलिंग परिणाम पाए गए जब इस थपका गोली आधारित समाधान का इस्तेमाल किया गया था.

इस जैव रासायनिक परख से सुसंगत और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित बातों की सिफारिश कर रहे हैं. प्रत्येक experimen में हौसले से तैयार पीबीएस और इथेनॉल का उपयोग करेंटी. साइटोक्रोम ग, एनबीटी, पीएमएस (प्रकाश से ढाल), सोडियम succinate, सोडियम azide, और 0.1 एम पीबीएस = पीएच 7.0 में malonate का जायजा समाधान, 0,1 एम एचसीएल या 0.1 एम NaOH के साथ 7,0 करने के लिए पीएच समायोजन तैयार करें. अशेष भाजक और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान की दुकान, और तेजी से समाधान सिर्फ पहले पिघलना उपयोग करने के लिए. प्रत्येक प्रयोग में अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह प्रयोग प्रति दस स्लाइड्स की अधिकतम प्रक्रिया के लिए समय की देरी को कम करने के लिए सिफारिश की है. प्रयोगों के बीच कुछ परिवर्तनशीलता है, इसलिए, प्रत्येक विषय / जानवर से वर्गों में कम से कम तीन से चार बार दोहराया जाना चाहिए, और उचित नियंत्रण प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अन्त में, के रूप में ऊष्मायन बार (चित्रा 4, बाईं और मध्यम पैनलों) कॉक्स लेबलिंग और SDH-लेबलिंग की राशि को प्रभावित करते हैं, यह अधिक से अधिक 5% (2 मिनट) द्वारा ऊष्मायन बार भिन्न नहीं की सिफारिश की है.

संयुक्त कॉक्स / SDH यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले 9,22,23,25 वर्णित सिद्धांतों पर आधारित है. साथ के रूप मेंकई technqiues, इस प्रोटोकॉल के रूपांतरों पीएमएस और सोडियम azide के अलावा छोड़कर एक जलीय mountant का उपयोग, और अलग ऊष्मायन और बार कुल्ला के रूप में, मौजूद है और समान रूप से के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम उम्र बढ़ने के राष्ट्रीय संस्थान (AG04418), नशीली दवाओं के सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ स्वास्थ्य कारोलिंस्का Institutet स्नातक भागीदारी कार्यक्रम, कारोलिंस्का Institutet, स्वीडिश अनुसंधान परिषद, स्वीडिश ब्रेन पावर, और स्वीडिश ब्रेन फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था. Mattias Karlen और डॉ. ग्यूसेप Coppotelli चित्रा 1 और 2, क्रमशः के साथ रचनात्मक समर्थन के लिए बहुत धन्यवाद, तकनीकी सहायता के लिए Karin Pernold, और डीआरएस. बैरी जे Hoffer, लार्स Olson, और बहुत उपयोगी सलाह और चर्चा के लिए निल्स - गोरान लार्सन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dry Ice AGA Gas AB block form
Isopentane (2-methylbutane) Sigma-Aldrich 277258 CAS: 78-78-4
Cyrostat embedding solution Sakura Finetek Tissue Tek 4583
Cryostat Microm International Microm Model HM 500M
Slides Thermo Fisher Scientific, Inc. Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ
Cover glasses Borosilicate glass VWR international 16004-098 24 x 50 mm
Filter Paper Munktell Filter AB Quality: 1350 Article Number: 242 001 430 x 430 mm
3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Sigma-Aldrich Sigma Liquid Substrate System, D7304
Cytochrome c (Type III, from equine heart) Sigma-Aldrich C2506 CAS: 9007-43-6
Bovine catalase (from liver) Sigma-Aldrich C9322 CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma-Aldrich N6876 CAS: 298-83-9
Sodium succinate Sigma-Aldrich S2378 CAS: 6106-21-4
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625 CAS: 299-11-6 PMS is light sensitive. Shield from light.
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 CAS: 26628-22-8
Xylene VWR international EM-XX0060-4
Entellan VWR international 100503-870
Malonate (Malonic acid) Sigma-Aldrich M1296 CAS: 141-82-2

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References

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