Après Cell-sort Published: October 14, 2011 doi: 10.3791/3363

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Lanying Zeng¹, Ido Golding^1,2,3

¹Department of Physics, University of Illinois at Urbana-Champaign, ²Center for the Physics of Living Cells, University of Illinois at Urbana-Champaign, ³Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Cet article décrit la procédure à suivre pour la préparation d'une version marquée par fluorescence du bactériophage lambda, l'infection des

Abstract

Le système comprend des bactériophages (phages) lambda et de la bactérie E. coli a longtemps servi de paradigme pour ^1,2 détermination cellulaire destin. Suite à l'infection simultanée de la cellule par un certain nombre de phages, l'une des deux voies est choisi: lytique (virulente) ou lysogène (en sommeil) ^3,4. Nous avons récemment développé une méthode de fluorescence étiquetage phages individuels, et ont été en mesure d'examiner la décision après l'infection en temps réel sous le microscope, au niveau des phages et les cellules individuelles ^5. Nous décrivons ici la procédure complète pour réaliser les expériences d'infection décrits dans nos travaux antérieurs ^5. Cela comprend la création de phages fluorescentes, l'infection des cellules, imagerie sous le microscope et l'analyse des données. Le phage fluorescent est un «hybrides», co-exprimant les versions de type sauvage et YFP-fusion de la protéine de capside GPD. Un lysat de phage brut est d'abord obtenue en induisant un lysogène de l'(GPD-EYFP Enhancées Yellow Fluorescent Protein) phage, hébergeant un plasmide de type sauvage exprimant GPD. Une série d'étapes de purification sont ensuite réalisée, suivie par DAPI-étiquetage et l'imagerie au microscope. Ceci est fait afin de vérifier l'uniformité, l'efficacité empaquetage de l'ADN, signal de fluorescence et de la stabilité structurelle du stock de phages. L'adsorption initiale de phages à des bactéries est effectuée sur la glace, puis suivie par une courte incubation à 35 ° C pour déclencher l'injection d'ADN viral ^6. Le phage / bactérie mélange est ensuite déplacé vers la surface d'une plaque de gélose nutritive mince, recouverte d'une lamelle couvre-objet imagé et sous un microscope à épifluorescence. Le processus post-infection est suivie pendant 4 heures, à 10 min d'intervalle. Positions à plusieurs étages sont suivis tels que ~ 100 infections cellulaires peuvent être retrouvées dans une seule expérience. A chaque point de position et de temps, les images sont acquises dans le contraste de phase et les canaux rouge et vert fluo. L'image en contraste de phase est utilisé ultérieurement pour automatiser les celreconnaissance l tandis que les canaux fluorescents sont utilisés pour caractériser l'issue infection: la production de nouveaux phages fluorescent (vert), suivie par la lyse cellulaire, ou l'expression de facteurs lysogénie (rouge), suivie par une croissance cellulaire a repris et la division. Les acquis time-lapse films sont traités en utilisant une combinaison de méthodes manuelles et automatisées. Les résultats d'analyse de données pour l'identification des paramètres des infections pour chaque événement infection (par exemple le nombre et les positions d'infecter les phages) ainsi que les résultats infection (lyse / lysogénie). D'autres paramètres peuvent être extraites si désiré.

Protocol

1. Création d'un lysat de phage brut (Figure 1)

1. Dans un ballon de 50 ml, ensemencer une colonie fraîche du LE392 (λ _LZ1) [pPLate * D] (voir le tableau 1 pour plus de détails) dans 6 ml de ⁷ milieu LB supplémenté avec 10 ug / ml de kanamycine et 100 pg / ml ampicilline. Développer une nuit à 30 ° C sous agitation douce (180 rpm).
2. Diluer le 1:100 culture dans LBM (LB supplémenté avec 10 mM MgSO ₄₎ et de croître à 30 ° C sous agitation douce (180 rpm). Afin d'optimiser le rendement de phage, faire en sorte que le volume de culture n'est pas supérieure à un dixième de la capacité du volume ballon. Nous préparent habituellement les deux flacons d'une capacité de 2 litres ou de 2,5 litres, et ajouter 2,5 ml culture d'une nuit dans 250 ml LBM moyenne dans chaque flacon.
3. Lorsque la densité cellulaire atteint DO ₆₀₀ ≈ 0,6 (~ 2,5 à 3 h), induisent la lysogène en déplaçant la culture à 42 ° C un bain-marie agitateur pendant 18 min sous agitation modérée (180 tours par minute), puis Incubate à 37 ° C sous agitation douce (180 rpm) jusqu'à ce que la lyse est visible (la culture devient clair, à environ 60 - 90 min).
4. Ajouter le chloroforme à 2% à la culture, serrer la main de mélanger, puis laisser incuber pendant 15 min à température ambiante. Attention: Porter des gants pour manipuler le chloroforme, et éviter de la respirer.
5. Transférer la culture en deux 250 bouteilles à centrifuger ml, centrifuger la culture dans un rotor Sorvall GSA à 10000 rpm pendant 15 min à 4 ° C. Récupérer le surnageant contenant les particules de phages, et jeter le culot de débris. Effectuer une deuxième centrifugation pour s'assurer de se débarrasser des débris visibles.
6. Utiliser un protocole de type phage titrage ⁸ pour mesurer la concentration de phage. Le titre devrait être phage ~ 5-10 x 10 ⁹ pfu / ml. Utiliser une souche supF comme LE392 que la souche témoin à cause de la mutation Sam7 dans le génotype du phage fluorescent, et d'utiliser l'agar agar plaques supérieure et fait avec NZYM riche pour obtenir de plus grandes plaques (Figure 2).

2. Purification de phages (Figure 1)

1. Verser le lysat dans une grande (par exemple 2-litre) fiole, ajouter la DNase et la RNase I (1 pg / ml) au lysat pour digérer les acides nucléiques libérés de bactéries lysées, et incuber 1 h à température ambiante.
2. Ajouter 1M NaCl au lysat, transférer le lysat dans 250 ml bouteilles à centrifuger et incuber 3 h sur la glace. Centrifuger le lysat dans un Sorvall GSA à 10000 rpm pendant 15 min à 4 ° C. Récupérer le surnageant. Le titre de phages doit être similaire à celle du lysat brut, qui est d'environ 5-10 x 10 ⁹ ufc / ml. L'ajout de NaCl favorise la dissociation des particules de phage à partir de débris bactériens et est nécessaire pour la précipitation de particules de phage efficace par PEG ^8.
3. Verser le lysat dans un grand flacon, par exemple 2-litre flacon, ajouter 10% (p / v) PEG8000 dans le lysat, lentement remuer ou secouer pour dissoudre PEG8000 à la température ambiante. Transférer le lysat dans 250 ml centbouteilles rifuge puis incuber pendant une nuit (~ 16 h) à 4 ° C. Centrifuger le lysat dans un rotor Sorvall GSA à 10000 rpm pendant 15 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
4. Tremper le culot (particules de phage précipité avec de PEG8000) avec le phage tampon SM (4 ml de tampon SM par 250 ml de lysat de phage initial). Incuber avec très doux en secouant ou pas secouer pendant 16 heures à 4 ° C.
5. Doucement sortir le lysat (tampon SM avec les particules de phages) dans un tube à centrifugation de 50 ml Eppendorf, puis laver le culot avec restante de 0,5 à 1 ml de tampon SM.
6. Ajouter un volume égal de chloroforme au lysat. Mélanger délicatement le lysat avec du chloroforme jusqu'à inverseuse et vers le bas pour quelques temps. Centrifuger à 4000 rpm pendant 15 min à 4 ° C dans un Eppendorf 5804R ou un analogue de paillasse centrifugeuse.
7. Répétez l'étape 2.6 pour procurer une meilleure lysat. Le titre devrait être phage ~ 1-2 x 10 ¹¹ pfu / ml.
8. Préparer SM / CsCl avec trois solutions différentes densités (ρ) de 1,3 g / ml, 10,5 g / ml et 1,7 g / ml. Mesurer l'indice de réfraction (η) pour obtenir une lecture plus précise de densité. La conversion ⁹ densité est ρ = 10,8601 η - 13,4974 à 25 ° C. Voir le tableau 3 pour plus de détails.
9. Utiliser une seringue avec une aiguille longue à charger la solution dans 14 ml d'un ultra-clair, tube de Beckman ultracentrifugeuse 40Ti. Pour éviter de mélanger et de former un gradient de densité plus, la solution sous-jacente (c.-à-superposition des solutions de densité croissante sous l'autre) doivent être utilisés, à savoir, doucement charger 2 ml de SM / CsCl solutions à l'ordre de 1,3 g / ml, 1,5 g / ml et 1,7 g / ml par l'insertion de l'aiguille d'une seringue 3 ml de la partie inférieure du tube.
10. Charger doucement 8 ml de lysat de phage par la superposition de la partie supérieure du tube d'ultracentrifugation 14 ml. Préparer un tube d'équilibrage. Centrifuger dans un rotor Beckman SW40Ti à 24.000 rpm pendant 4 heures à 4 ° C.
11. Saisissez doucement le tube dans une pièce sombre et éclairer par le haut du tube sur un fond noir avec aflashlight. Le groupe phage doit être clairement visible à l'emplacement de l'interface entre 1,3 g / ml et 1,5 g / ml SM / CsCl couches (figure 3A). Percer à travers la paroi du tube légèrement en dessous de la bande avec une aiguille de calibre 21,5 avec une seringue de 3 ml. Doucement recueillir ~ 500 ul de la suspension de phages. Le titre devrait être phage ~ 5-10 x 10 ¹¹ pfu / ml.
12. Placez la suspension de phages dans un 4 ml ultra-clair ultracentrifugeuse Beckman SW60Ti tube de rotor. Remplir le tube avec 1,5 g / ml SM / solution de CsCl. Préparer un tube d'équilibrage. Centrifuger dans un rotor Beckman SW60Ti à 35.000 tours par minute pendant 24 heures à 4 ° C.
13. Répétez la même procédure qu'à l'étape 2.11 pour recueillir le phage de la bande visible. Le groupe doit être visible comme le montre la figure 3B.
14. Chargez la suspension de phages dans une cassette membrane de dialyse (Tableau 2) et dialyse trois fois contre un volume de 1000 fois de tampon SM à 4 ° C pour des durées de 3 h, 3 h et overnight (~ 16 h). Le but de la dialyse est de se débarrasser de la présente CsCl dans la suspension de phages. Le titre phage final devrait être ~ 5-10 x 10 ¹¹ pfu / ml.

3. Préparer un gel d'agarose dalle (figure 4)

1. Nettoyez 6 lames de microscope (75 x 50 mm, épaisseur 1 mm) avec de l'éthanol à 70%.
2. Disposer 5 toboggans et fixer avec une bande comme indiqué dans la figure 4.
3. Mélanger 0,09 g d'agarose dans 6 ml de milieu dans un petit bécher recouvert de film plastique (ce qui donne 1,5% d'agarose). Chauffer sur une plaque chauffante jusqu'à ce que la solution devienne claire.
4. Verser la solution d'agarose sur des lames sécurisées.
5. Placez la dernière diapositive sur le dessus, en évitant soigneusement les bulles d'air. Lieu poids dessus et laisser refroidir pendant environ 30 min.
6. Retirez les 4 lames sur le côté, et envelopper la dalle ainsi que les diapositives supérieure et inférieure avec film étirable. La dalle peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à 3 jours.

4. Test du stock de phages purifiés

1. Préparerune plaque de gel d'agarose PBS-comme décrit ci-dessus (section 3).
2. Colorer le phage purifié avec du DAPI. Mélanger 10 ul du phage (~ 1 x ¹⁰ 10 pfu / ml) avec 10 ul de 10 pg / ml DAPI (concentration finale DAPI de 5 ug / ml), incuber pendant 30 min à 4 ° C ou 10 min à température ambiante.
3. Placer 1 pl du mélange de phages / DAPI au centre d'un n ° 1 24 x 50 mm lamelle, un petit morceau de recouvrement (~ 10 x 10 mm) de la pré-préparés PBS-agarose dalle. Le petit morceau de plaque d'agarose est coupé avec une lame de rasoir à la glissière supérieure sur le gel est éliminé en sandwich. L'image de l'échantillon dans le microscope à épifluorescence à travers les canaux YFP et DAPI. Phages individuels doivent être visibles comme la diffraction limitée fluorescents «spots» dans les deux canaux (figure 5). Utilisez le même microscope et configurations de caméra comme à l'étape 6.2 ci-dessous.

5. L'infection (figure 6)

1. Dans un tube de 14 ml Falcon, ensemencer une colonie fraîche du LE392 [pP _RE-MCHerry] (voir le tableau 1 pour plus de détails) dans 2 ml de milieu LB supplémenté avec 100 pg / ml ampicilline, 10 mM MgSO ₄ et Maltose 0,2%. Développer une nuit à 37 ° C sous agitation modérée (265 tours par minute).
2. Diluer la culture dans LBMM 1:1000 (LB supplémenté avec 10 mM MgSO ₄ et Maltose 0,2%), c'est à dire ajouter 5 ul culture du jour au lendemain dans 5 ml de milieu LBMM dans un flacon de 50 ml. Croître à DO ₆₀₀ ≈ 0,4 à 37 ° C sous agitation modérée (265 tours par minute).
3. Utiliser un moyen de préparer un LBM plaque de gel d'agarose-LBM comme décrit dans la section 3 ci-dessus.
4. Centrifuger 1 ml de cellules à 2000 g dans une microcentrifugeuse de paillasse pendant 2 min à température ambiante. Enlever le surnageant et remettre en suspension les cellules doucement dans 20 ul glacée LBMM pour atteindre OD ₆₀₀ et 20.
5. Lors de la manipulation du stock de phages purifiés, utiliser un embout de pipette de grand ou de couper la pointe de pipette régulière pour s'assurer de la pointe ouverture plus large, pour éviter le cisaillement des particules de phage ^3. Doucement Mix 20 ul de cellules avec 20 ul de phage purifié pour atteindre une moyenne phages à cellule rapport de l'ordre de 0,1 à 5. Incuber dans la glace pendant 30 min pour permettre adsorption des phages, puis incuber dans un bain d'eau à 35 ° C pendant 5 min pour déclencher l'injection d'ADN de phage ^6.
6. Introduire à la pipette de haut en bas à quelques reprises pour séparer les agrégats de cellules. Encore une fois utiliser un embout de pipette large pour éviter le cisaillement des phages. Diluer le mélange dans LBMM 1:10, par exemple 5 mélange ul dans 45 ul LBMM.
7. Placez un morceau de LBM-agarose dalle (~ 10 x 10 mm) sur une lamelle n ° 1 22 x 22 mm. Le pré-préparés LBM-agarose dalle doit être placé à température ambiante pendant au moins 1 heure avant utilisation afin de s'assurer que la dalle d'agarose atteigne la température ambiante. Placer 1 pl du mélange de phages / cellules sur la plaque d'agarose et attendre 1 min pour permettre au mélange d'absorber dans la dalle d'agarose. Placez délicatement une lamelle n ° 1 24 x 50 mm sur le dessus de la dalle d'agarose. Cette procédure est destinée à éviter le cisaillement des phages de l'infète cellule (figure 6).

6. Après le destin des cellules sous le microscope

1. Soigneusement monter la lamelle couvre-objet sur la platine du microscope. Pour l'imagerie, utilisez un objectif à fort grossissement (100x par exemple) (voir Système de microscope dans le rapport ci-dessous).
2. Acquérir une image définie pour le délai initial. Cette série d'images seront utilisées pour caractériser les chiffres initiaux et les positions de tous les phages infectant. Prenez une série de 15 images à 200 nm axe z (vertical) d'intervalle. L'image à travers le canal YFP. En outre, prendre une seule de mise au point image à travers le contraste de phase et les canaux mCherry. Optimiser l'intensité lumineuse et la durée d'exposition pour obtenir un signal suffisant tout en minimisant la décoloration et les dommages cellulaires (voir Image Acquisition dans le rapport ci-dessous).
3. Acquérir un film time-lapse de la destinée cellulaire après l'infection. L'image de l'échantillon en contraste de phase, YFP et mCherrycanaux à des intervalles de temps de 10 min environ 4 heures. Pendant le film time-lapse, utiliser un seul z-position de l'image par canal par point dans le temps, afin d'éviter toute exposition inutile de l'échantillon, ce qui pourrait conduire à la décoloration et la phototoxicité.

7. L'analyse d'image

1. Compter manuellement le nombre de phages et l'emplacement d'enregistrement du phage et la longueur de cellule dans le délai initial. Cela peut être fait en utilisant un logiciel tel que MetaMorph ou ImageJ. Enregistrez les destins cellulaires (lytique, lysogène ou non infecté), le temps de lyse, et toute autre information souhaitée par la lecture du film time-lapse. Pour identifier les destins cellulaires différents, voir Time-lapse film dans la section des résultats représentatifs ci-dessous.
2. En plus de l'analyse manuelle ci-dessus, des informations quantitatives (par exemple le niveau de fluorescence au cours du temps dans des cellules individuelles) peuvent être extraites en utilisant des cellules automatisés de reconnaissance et de la lignée des algorithmes de traçage. Nous utilisons une maison construite programme Matlab pour tracing la lignée cellulaire et le niveau de fluorescence, avec le code d'Schnitzcell Matlab pour la segmentation de cellules (écrite par le groupe Elowitz à Caltech).

8. Les résultats représentatifs:

Dépôt de phages:

Les plaques des phages marqués par fluorescence (en 1.6 et à la section Étape 2) sont nettement plus petits que ceux de type sauvage (figure 2). Nous avons donc incuber les plaques au moins 12 h à 37 ° C incubateur pour les plaques pour être visible.

Ultracentrifugation phage:

Après ultracentrifugation de l'échantillon avec le phage gradient de CsCl étape (Etape 2,10), deux bandes doit être visible (Figure 3A). La bande supérieure, à l'interface entre la suspension de phages et SM / CsCl 1,3 g / ml couche, contient des débris cellulaires et les capsides de phages vides. La bande inférieure, à l'interface entre SM / CsCl 1,3 g / ml et 1,5 g / ml couches, est la bande de phage. This band apparaît verdâtre pour le phage λ _LZ2 fluorescente. La bande de type sauvage du phage λ _IG2903 bleuâtre ^5. Après l'ultracentrifugation du gradient de CsCl équilibre à l'étape 2.12, une bande phage doit être visible dans la partie centrale du tube (figure 3B). Depuis le phage λ _LZ2 fluorescent contient un mélange de GPD-EYFP et GPD capsides, le rapport de la protéine à l'ADN est supérieur à celui du type sauvage. Par conséquent, la bande du phage λ fluorescente _LZ2 est légèrement plus léger (semble être à un endroit plus élevé dans le tube) que celle du type sauvage λ _IG290310.

La coloration DAPI:

La figure 5 montre des images typiques obtenues après marquage du phage avec DAPI (section 4). Les signaux YFP et DAPI d'un phage purifié doit avoir avec succès près de 100% de correspondance. En général, nous constatons que moins de 1% de la tache YFPs ne contiennent pas DAPI (représentant capsides sans le génome viral). Moins de 1% des spots ne contiennent DAPI YFP (correspondant à la non-fluorescents phages) ^5.

Time-lapse film:

Lytiques des cellules sont reconnues par l'accumulation de fluorescence YFP (vert) à l'intérieur de la cellule, suivie d'une lyse cellulaire. Cellules lysogènes sont reconnus par l'accumulation de l'uniforme mCherry fluorescence (rouge) à l'intérieur de la cellule et la reprise de la croissance cellulaire normale et la division. Les cellules non infectées (ou cellules où l'infection a échoué) ne présentent aucune des phénotypes ci-dessus et va croître et se diviser normalement. Figure 7 montre quelques images-ensembles de contraste de phase, YFP et canaux mCherry, et les images correspondantes superposées de ces trois canaux, à partir d'un type time-lapse movie (section 6). Les phages individuels (points verts) sont clairement visibles sur le calendrier initial (figure 7A). En règle générale, un certain nombrephages de sont visibles sur la surface de la cellule (probablement infecter les cellules), tandis que d'autres phages sont non adsorbée, comme le montre la figure 7B (panneau de gauche). Le résultat infection devienne distinguable au fil du temps. Le cycle lytique est indiquée par la production intracellulaire de nouveaux phages (vert, figure 7C), suivie par la lyse des cellules (cellules éclatées avec les phages du modèle vert, la figure 7D). Lysogénie est indiquée par la production de mCherry à partir du promoteur P _RE (rouge, figure 7C) et la reprise de la croissance et la division cellulaire (rouge, la figure 7D).

Figure 1. AB). Le phage est purifié par une série d'étapes (CL panneaux).

Figure 2. Plaques de phages. Plaques de phage fluorescente (à gauche) sont plus petits que ceux de type sauvage (à droite), après incubation des plaques pendant 12 heures à 37 ° C.

Figure 3. Bandes phages après ultracentrifugation. A) Deux bandes sont visibles après ultracentrifugation dans un gradient de CsCl étape. Celui du haut correspond à des débris cellulaires et les capsides de phages vides; la bande inférieure contient le phage souhaité. À gauche: le phage fluorescente, à droite:. Type sauvage B ) Une bande de phage simple est visible après ultracentrifugation dans un gradient de CsCl équilibre. Le groupe phage fluorescente (à gauche) est verdâtre, par rapport à une bande bleuâtre pour le phage de type sauvage (à droite).

Figure 4. La procédure de préparation des plaques de gel d'agarose.

Figure 5. Images fluorescentes de phages après coloration au DAPI. Phages individuels sont faciles à distinguer, et YFP et DAPI signale co-localiser très bien.

Figure 6. Représentation schématique de l'infection par le phage et la configuration d'imagerie. Cliquez ici pour voir une version grandeur de cette image.

gure 7 "src =" / files/ftp_upload/3363/3363fig7.jpg "/>
Figure 7. Images typiques d'un film en accéléré de l'infection par le phage. La montre sont en contraste de phase, et YFP canaux mCherry, ainsi que d'une superposition des trois canaux. (A) YFP voies images du délai initial. Gauche, la somme des différentes images YFP à z positions. Les trois images de droite sont des images YFP échantillon à différentes positions z, correspondant à différentes zones de la surface de la cellule. (B), (C) et (D) des images superposées (à gauche) du contraste de phase (au milieu à gauche), YFP (centre-droit) et mCherry (à droite) canaux à différentes échelles de temps. (B) A t = 0, deux cellules sont vu, chaque infectées par un phage unique (points verts), et une cellule est infectée par 3 phages. On a également observé certains phages sont non adsorbées. (C) A t = 80 min, les deux cellules infectées par des phages isolés ont chacun passé dans la voie lytique, comme indiquerd par la production intracellulaire de nouveaux phages (vert). La cellule infectée par les phages 3 est entré dans la voie lysogène, comme indiqué par la production de mCherry à partir du promoteur PRE (rouge). (D) A t = h 2, la voie lytique a conduit à la lyse des cellules (cellule éclatée), tandis que la cellule lysogène a divisé ^§.

^§ panneaux de gauche de la figure 7 (C) et (D) sont tiré à part de Cell, 141, Lanying Zeng, Samuel O. Skinner, Chenghang Zong, Jean Sippy, Michael Feiss et Ido Golding, prise de décision à un niveau subcellulaire détermine le résultat des maladies infectieuses bactériophage, 682-691, Copyright (2010), avec la permission d'Elsevier.

Filtrer nom	Génotype pertinente	Source de référence /
Les souches bactériennes
LE392	souperFa	John Cronan, Université de l'Illinois
Souches de phages
λ LZ1	Gpd-EYFP, cI857 Sam7 D-EYFP b :: kanR	Zeng et al. 5
λ LZ2	Gpd-mosaïque, même génotype que λ LZ1	Zeng et al. 5
Les plasmides
pP RE - mCherry	mCherry sous le contrôle de P RE, ampR	Zeng et al. 5
pPLate * D	GPD sous le contrôle du promoteur tardif λ, ampR	Zeng et al. 5

Tableau 1. Souches bactériennes,phages et plasmides utilisés dans ce travail.

Ρ densité (g / ml)	CsCl (g)	SM (ml)	Indice de réfraction η
1,30	39	86	1,3625
1,50	67	82	1,3815
1,70	95	75	1,3990

Tableau 3. Solutions de CsCl préparé dans du tampon SM (100 ml) pour des gradients étape.

Discussion

Souches bactériennes, plasmides et de phages:

Souche LE392 est supF. Il a été choisi de supprimer la mutation Sam7 dans le génome du phage (voir le tableau 1 pour plus de détails). Ainsi, lysogènes induits finira lyser et libérer des particules de phages, comme les cellules infectées volonté qui ont choisi la voie lytique. Lysogènes cellules sont cultivées à 30 ° C en raison de la présence de la température cI 857 sensible allèle dans le génome du phage. Après l'induction de chaleur, Gpd-EYFP et de type sauvage Gpd sont co-exprimés à partir du génome de λ _LZ1 et le plasmide pPlate * D respectivement. En conséquence, la capside du phage nouvellement créé _LZ2 λ contient un mélange de Gpd-EYFP et protéines GPD. Ce phage mosaïque est structurellement stable et suffisamment pour permettre la détection fluorescente de phages individuels ^5. pP _RE - mCherry est un plasmide rapporteur utilisé pour détecter choix de la pathwa lysogèney. Le promoteur P _RE est activée par CII lors de l'établissement de la lysogénie ^1,11. pP _RE - mCherry ⁵ a été dérivé de pE-gfp ¹¹ par le remplacement gfp avec mCherry ^12. Pour plus de détails, voir nos travaux antérieurs ^5.

Paramètres Condition de croissance:

Pendant l'induction lysogène (section 1), tremblements légers à 180 rpm donne un rendement bon virus ^13. L'utilisation de glucose dans le milieu de croissance doit être évitée car le métabolisme du glucose génère acides produits métaboliques, et les particules lambda matures sont instables à pH acide ^13. L'addition de MgSO ₄ vise à stabiliser la capside de phage ^3. Pour phages porteurs de type sauvage cI (au lieu de cI 857), le lysogène peut être induite en utilisant le C altération de l'ADN mitomycine agent ^3. À l'étape 1.3, l'incubation à 37 ° C ne devrait normalement pas dépasser 90 minutes. Il est usef ul pour vérifier la densité cellulaire par DO ₆₀₀ toutes les 30 min. Pour un bon lysat, DO ₆₀₀ tombe à environ 0,2 ou moins, et le reste de OD ₆₀₀ est le résultat de débris cellulaires. Incubation trop long peut entraîner une baisse du rendement depuis le phage phage nouvellement créée peut commencer à injecter leur ADN dans les débris cellulaires. Pour obtenir une bande de phage visible (au moins 1 x 10 ¹¹ particules de phages) aux étapes 2.11 et 2.13, croître d'au moins 500 ml de culture à l'étape 1.2. L'ajout de 0,2% de maltose dans le milieu de croissance dans les étapes 5.1 et 5.2 vise à induire l'expression de l'agneau, le récepteur de phage lambda adsorption ^3,14. La dilution de 1000 fois au lieu de 100 fois dans l'étape 5.2 vise à réduire le niveau de fond mCherry du journaliste pP _RE plasmide - mCherry. À l'étape d'injection de 5,5 pour déclencher l'ADN du phage, 35 ° C est choisie pour éviter l'induction de l'allèle sensible à la température cI857.

Purification phage:

jove_content "> Les étapes de purification de phages (étapes 2.1 à 2.11) peut être remplacé par d'autres protocoles de purification ^5, mais l'ultracentrifugation finale par gradient de CsCl équilibre (étapes 2.12 et 2.13) est inévitable. rotors à godets oscillants sont nécessaires aux étapes 2.10 et 2.12 à assurer pointus bandes de phages visibles. Obtention d'un stock de phages pur peut facilement prendre jusqu'à une semaine, il est donc nécessaire de vérifier le titre du phage en cours de route pour s'assurer que rien se passe mal pendant les étapes intermédiaires.

Manipulation phage:

Pendant toutes les procédures de purification dans la section 2, il est essentiel de traiter le lysat de phage doucement pour éviter le cisaillement des queues des têtes de phages phages. Au cours de l'infection des cellules dans la section 5 (par exemple, les étapes 5.5 à 5.7), il est également essentiel pour éviter le cisaillement des particules de phage de la cellule infectée. Notez que si le phage est cisaillé à partir de la cellule infectée après l'injection de l'ADN, le résultat est un "sombre" infection, à savoir l'enfection résultat sera observé dans l'expérience, mais le phage infectant le seront pas. Pour minimiser ces problèmes, nous utilisons un embout de pipette large lors de la manipulation ou le mélange des phages phages / cellules.

DAPI essai:

La coloration du stock de phages avec du DAPI (section 4) est une méthode rapide et efficace pour vérifier la pureté du stock de phage. Il peut également être utilisé pour tester une possible dégradation d'un stock de phages existant au fil du temps. Pour une pure souche, la co-localisation des signaux YFP et DAPI au microscope à fluorescence devrait être proche de 100%. On observe généralement que moins de 1% des spots YFP ne contiennent DAPI (représentant capsides, sans le génome viral), ce qui indique que ces particules n'ont pas réussi à emballer l'ADN viral, ou déjà injecté leur ADN ailleurs. Moins de 1% des spots ne contiennent DAPI YFP (correspondant à la non-fluorescents phages). Si ce n'est pas le cas, les étapes 2,12 par 2,14 besoin d'être répété dans oOMMANDE à purifier à nouveau. En ce qui concerne les paramètres d'imagerie, la configuration de microscope à l'étape 4.3 est pas aussi critique que dans la section 5, car aucun long terme imagerie des cellules vivantes est nécessaire ici. Toutefois, en gardant les paramètres de microscopie mêmes que dans la section 5 est utile si l'on souhaite calibrer l'intensité de fluorescence d'une seule particule de phage. Si la dalle de PBS-agarose n'est pas très propre, ou trop DAPI colorant est utilisé, quelques taches DAPI correspondant à l'ADN de phage peuvent être entourés d'un «halo». Si trop peu de colorant DAPI est utilisé, le signal provenant du canal DAPI peut être très faible.

Système de microscope:

Pour l'imagerie dans la section 6, nous utilisons un microscope à épifluorescence commerciale inversée (Eclipse TE2000-E, Nikon) avec un objectif 100x (Plan Fluo, ouverture numérique de 1,40, immersion dans l'huile) et standards des jeux de filtres (Nikon). La source lumineuse est une lampe à fluorescence avec Arc de commande de l'intensité lumineuse. Les fonctions suivantes sont contrôlés par ordinateur: x, y et z potion; champ clair et volets fluorescence et de fluorescence choix de filtre. Une fonction d'auto-focus est nécessaire. Dans le cas contraire, l'accent peut facilement dériver pendant le film time-lapse (normalement 4 heures). La capacité d'acquérir de multiples positions (x, y) à chaque point est utile, car elle permet de suivre l'actualité des infections multiples en parallèle. En général, nous acquérir 8 positions de scène dans chaque film, à la suite jusqu'à 100 événements d'infection. La caméra que nous utilisons est une solution refroidie 512x512 CCD 16x16 pixel appareil photo um avec une plage dynamique de 16 bits (Cascade512, Photometrics). L'acquisition est réalisée à l'aide du logiciel MetaMorph (Molecular Devices). Le microscope doit être placé dans une chambre à température contrôlée, en alternative, la platine du microscope doit être entourée par une chambre à température contrôlée.

Acquisition d'image:

Pour imagerie des cellules vivantes, il est essentiel d'éviter toute exposition inutile de l'échantillon, ce qui pourrait conduire à la décoloration et phototoxicity. Par conséquent, il est préférable de commencer par caractériser le système pour trouver une exposition optimale de la lumière qui permet la détection de fluorescence tout en ne conduisant pas à une croissance cellulaire excessive de blanchiment ou d'inhibition. Pour obtenir une bonne image de fluorescence, jouer avec l'intensité lumineuse d'excitation, le temps d'exposition et de gain de la caméra. Dans les étapes 6.2 à 6.3, l'intervalle de 10 min est choisie de cadre dans le but de réduire l'exposition de la lumière. Dans chaque image, un seul de mise au point d'image est nécessaire à contraste de phase (pour la reconnaissance des cellules) et les canaux fluorescents (pour déterminer le devenir des cellules). Dans le premier point de temps, cependant, de multiples z-position des images à travers le canal YFP sont nécessaires pour capturer tous les phages infectant sur la surface cellulaire. Le temps d'exposition YFP dans le cadre initial peut également besoin d'être supérieure à celle utilisée pour le film time-lapse dans les délais ultérieurs.

Analyse d'images:

Très soigneusement compter les particules de phage dans la surface de la cellule à l'étape 7,1. Commeindiqué ci-dessus, nous prenons une série de z-piles à travers le canal YFP à l'étape 6.2. Toutefois, cela peut encore laisser des particules de phages fluorescentes out-of-focus, qui contestent le décompte. La longueur de la cellule dans le délai initial est mesuré à l'aide du logiciel Metamorph. La longueur de la cellule peut également être mesurée par ImageJ ou d'autres outils logiciels. En outre, une maison automatisée construite programme Matlab peut être très utile pour obtenir des informations telles que le changement de fluorescence au cours du temps le long lignées cellulaires.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Fisher Scientific	C298-500
NaCl	Fisher Scientific	S271-3
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527-10KU
RNase	Sigma-Aldrich	R4642-10MG
PEG8000	Fisher Scientific	BP233-1
SM buffer	TEKnova, Inc.	S0249
NZYM	TEKnova, Inc.	N2062
CsCl	Sigma-Aldrich	C3011-250G
Syringe	BD Biosciences	309585
Needle	BD Biosciences	305176
Dialysis cassette	Thermo Fisher Scientific, Inc.	66333
Microscope slide	Corning	2947-75x50
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
SW40Ti ultra-clear tube	Beckman Coulter Inc.	344060
SW60Ti ultra-clear tube	Beckman Coulter Inc.	344062
SW40Ti rotor	Beckman Coulter Inc.	331302
SW60Ti rotor	Beckman Coulter Inc.	335649
Refractometer	Fisher Scientific	13-947
Epifluorescence microscope	Nikon Instruments	Eclipse TE2000-E
Table 2. Reagents and equipment.