Summary
Belangrijke technieken om te worden gebruikt bij de evaluatie van
Abstract
Vulvovaginale candidiasis (VVC), veroorzaakt door Candida-soorten, is een schimmelinfectie van de lagere vrouwelijke geslachtsorganen dat ongeveer 75% van anders gezonde vrouwen treft tijdens hun reproductieve jaren 18,32-34. Predisponerende factoren zijn onder meer het gebruik van antibiotica, ongecontroleerde diabetes en verstoring van de voortplanting hormoonspiegels ten gevolge van zwangerschap, orale anticonceptiva of hormoonvervangende therapieën 33,34. Recurrente VVC (RVVC), gedefinieerd als drie of meer episodes per jaar, van invloed op een aparte 5 tot 8% van de vrouwen met geen predisponerende factoren 33.
Een experimenteel muismodel van VVC is vastgesteld en gebruikt om de pathogenese en mucosale gastheer reactie op Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37 studeren. Dit model is ook gebruikt om potentiële anti-schimmel therapieën te testen in vivo 13,24. Het model vereist dat de dieren worden gehouden in een staat van pseudoestrus voor optiMAL Candida kolonisatie / infectie 6,14,23. Onder dergelijke omstandigheden zal geënte dieren hebben aantoonbaar vaginale schimmel last voor weken tot maanden. Verleden studies tonen een extreem hoge parallel tussen het diermodel en menselijke besmetting met betrekking tot immunologische en fysiologische eigenschappen van 3,16,21. Verschillen zijn echter ook een gebrek aan Candida als normale vaginale flora en een neutrale vaginale pH in de muizen.
Hier tonen we een reeks belangrijke methoden in de muis vaginitis model dat vaginale inenting, een snelle inzameling van vaginale exemplaren, de beoordeling van de vaginale schimmel last, en weefsel de voorbereidingen voor mobiele extractie / isolatie te nemen. Dit wordt gevolgd door representatieve resultaten voor de bestanddelen van vaginale lavage vocht, schimmel last, en de drainerende lymfeklier leukocyten oplevert. Met het gebruik van verdoving, kan lavage monsters worden verzameld op verschillende tijdstippen op dezelfde muizen voor longitudinale evaluatie van deinfectie / kolonisatie. Bovendien is dit model vereist geen immunosuppressieve middelen te initiëren infectie, waardoor immunologische studies onder gedefinieerde omstandigheden gastheer. Ten slotte is het model en elke techniek introduceerde hier zou kunnen leiden tot het gebruik van de methoden om andere besmettelijke ziekten van de lagere vrouwelijke geslachtsorganen (bacteriële, parasitaire, virale) en de respectieve lokale of systemische afweer van de gastheer te onderzoeken te geven.
Protocol
1. Vaginale inoculatie met Candida albicans
- Drie dagen vóór de inoculatie, terwijl straatverbod het dier naar de buik bloot, injecteren van 100 ul van sesamolie met 0.1-0.5 mg van de β-estradiol subcutaan in de onderbuik. Vooraf de naald ongeveer 5 tot 10 mm lateraal van de huid om lekkage van de injectieplaats te minimaliseren.
De subcutane toediening van oestrogeen in de onderbuik is optimaal in dit model als gevolg van de nabijheid van de genitale tractus. Effectieve doses kan per muizenstammen, leeftijd of oestrogeen derivaten. In voorgaande studies met CBA-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 onder b), Balb / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) muizen op 6-8 weken oud zijn, 0,1 mg/100 pi werd gevonden effectief bewezen door verdikking van de vaginawand, verminderde vaginale slijm enverhoogde epitheliale cellen vervelling. Muizen die werden behandeld met oestrogeen boven bij deze concentratie vertonen consistent vaginale kolonisatie met Candida. Voor de inenting in muizen van andere stammen en leeftijden, is een pilot-studie werd aanbevolen om de effectiviteit van oestrogeen zorgen onder de gewijzigde omstandigheden en de dosis oestrogeen, indien nodig te verhogen.
Het oestrogeen oplossing moet vers worden bereid elke keer op de dag van de injectie. Om ervoor te zorgen volledige oplosbaarheid van oestrogeen in sesamolie, meng grondig de oplossing met behulp van een vortex mixer en warmte met tussenpozen bij 37 ° C. Herhaal de injectie wekelijks gedurende de hele studieperiode. - Ter voorbereiding op het inoculum, voeg een entoog met bacterie C. albicans blastoconidia uit een recente subcultuur voorbereiding op Sabouraud-dextrose agar (SDA) in 10 ml van Phytone-pepton bouillon aangevuld met 0,1% glucose. Incubeer de bouillon cultuur stationaire fase gedurende 18 uur bij 25 ° C in een schuddend waterbad.
- Na de incubatie, verzamel ee bouillon cultuur in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 minuten. Twee keer was de pellet met steriele PBS.
- Opsommen levensvatbaar blastoconidia op een hemocytometer door trypan blauwe kleurstof uitsluiting. Pas de cel concentratie tot 2,5 x 10 6 / ml (of om een gewenste inoculum concentratie) in een steriele PBS.
- Te stabiliseren met de muis, houdt u de basis van de staart met twee vingers en til de heup naar boven, zodat de vaginale opening gezichten naar u toe (figuur 1a). Het is ideaal als de muis wordt geplaatst op een vlakke ondergrond geraspte (bijv. kooi boven), zodat de muis kan weerstand bieden tegen de staart terughoudendheid.
- Pipetteer 20 ui (of een gewenste volume niet hoger zijn dan 20 ul) van het inoculum opschorting door het inbrengen van de pipetpunt ongeveer 5 mm diep in de vaginale lumen (Figuur 1B). Vul deze stap zo snel en voorzichtig mogelijk te minimaliseren nood in de muis.
2. Vaginale spoelsels
- Na de euthanasie (of anesthesie), houde met de muis naar beneden door de basis van de staart met twee vingers, zodat de vaginale opening wordt blootgesteld.
- Lavage de vaginale lumen door de invoering van 100 pi steriel PBS met herhaalde aspiratie en agitatie met een pipet tip. De pipetpunt kan verstopt raken met cellen. Als dit gebeurt, afzien van de belemmerende cellen en verder lavaging met resterende PBS in de vagina. Verzamel de lavage vloeistof in een microcentrifugebuis.
- Als alternatief kan vaginale spoelsels worden uitgevoerd op verdoofde muizen met isofluraan inhalatieoplossing anesthesie. Voor deze, bloot de muizen aan verdampte isofluraan tot ze volledig verdoofd (~ 30 sec.). Houd de muizen naar beneden door de basis van de staart en voorzichtig lavage de vaginale lumen met behulp van 50 pi steriel PBS. Zorg ervoor dat u hard onrust te vermijden met een pipet tip om trauma te minimaliseren om de vagina tijdens deze procedure. Gesedeerd muizen moeten herstellen van anesthesie binnen 30 sec van de blootstelling aan de omgevingslucht.
Isofluraankan worden verdampt met behulp van een verdamper isofluraan en O 2 (bij voorkeur) of een standaard-drop systeem afgesloten kamer zonder verdoving de verdamper systeem (moet nauwlettend worden gevolgd, terwijl het dier verdoofd om ademnood te voorkomen).
Vaginale spoelsels op verdoofde muizen moet de methode van keuze voor longitudinale lavage monsters op dezelfde muizen worden. Opeenvolgende lavaging heeft geen invloed op de beoordeling van de schimmel belasting na verloop van tijd 41.
- Voor nat-mount bereidingen, overdracht 10 ul van de lavage vloeistof op een glasplaatje en let op 400-1000x vergroting met lichtmicroscopie. Daarnaast kunnen cellulaire fracties van de lavage vloeistof gekleurd worden naar cel en nucleaire morfologie onderzoeken. Voor uitstrijkje voorbereiding, overdracht 10 ul van de lavage vloeistof op een glasplaatje en voorzichtig verspreiden met behulp van de buitenwand van een pipet tip. Behoud van het uitstrijkje monsters met CytoPrep fixatief en vlekken door de standaard Papanicolaou techniek (uitstrijkje). Let op bij 400 × vergroting met lichtmicroscopie.
3. Kwantificering van vaginale schimmel last
- In een 96 well-ronde bodemplaat, de overdracht van de lavage vloeistof in een goed van de bovenste rij en 180 ul van steriele PBS in de volgende vijf bronnen van die kolom (beneden de plaat).
- Maak 01:10 seriële verdunningen van vaginaal vocht lavage door de overdracht van de 20 ul van de vloeistof naar het volgende goed in de kolom. Meng goed door herhaalde aspiratie voor elke overdracht. Seriële verdunningen van maximaal 12 lavage (een volledige horizontale rij) kan gelijktijdig worden uitgevoerd met behulp van een 12-kanaals pipet.
- Te beginnen met de laagste verdunning, overdracht 10 ul van het monster op Sabouraud-dextrose agar (SDA). Plating van maximaal 36 monsters kunnen worden uitgevoerd op een plaat met behulp van SDA opgesteld in vierkante petrischaaltjes met rooster en een instelbare afstand multichannel pipet.
- Opsommen kolonievormende eenheden (CFU's) na incubatie bij 34 ° C fof 48 h.
4. Vaginale weefsel extractie
- Na de vaginale spoeling procedure, leg het inslapen muis op zijn rug en verzadigen de liesstreek met 70% ethanol. Met behulp van een pincet, de hoorn van de urine-opening naar boven, zodat de vaginale opening wordt blootgesteld.
- Plaats een paar gebogen pincet in de vaginale lumen en zoek de baarmoederhals. Met behoud van een stevige grip met de tang, extract van de baarmoederhals door de vaginale holte (Figuur 2A-C).
- Accijnzen de vagina aan de voet van de vaginale opening en verwijder vervolgens de baarmoederhals van de vagina met chirurgische schaar. Houd in gedachten dat het vaginale weefsel geïnvolueerd is (innerlijke epitheel-kant van de vagina naar buiten blootgesteld). Het weefsel kan zijdelings of worden omgekeerd om de oorspronkelijke oriëntatie van de vagina te behouden of geopend in een blad door het maken van een laterale incisie.
Weggesneden vaginale weefsel kan gebruikt worden voor 1) lymfocyten extractie volgende collagenase spijsvertering (~ 1 × 10 4 / muis) 40, 2) epitheliale celisolatie volgende dispase spijsvertering (~ 5 × 10 4 / muis) 28, 3) bevroren of paraffine-ingebed voorbereidingen voor de histologische analyses 25.
5. Lumbale lymfeklieren excisie
- Na de vaginale spoeling procedure, leg het inslapen muis op zijn rug en verzadigen de buik met 70% ethanol. Maak een laterale incisie vanaf de onderbuik naar de borst en bloot de inwendige organen. Met behulp van een pincet in beide handen, zet de darmen omhoog, zodat de centrale bloedvaten zichtbaar worden.
- Zoek de vena cava inferior en abdominale aorta. Normaal gesproken kan een paar van de lumbale lymfeklieren worden geïdentificeerd naast de abdominale aorta, ligt ongeveer halverwege tussen de oorsprong van de nier en de gemeenschappelijke iliacale slagaders 39. Deze lymfeklieren kunnen visueel worden onderscheiden van het vetweefsel door de elastische textuuren zijn lichter en meer ondoorzichtige in kleur ten opzichte van vetweefsel (figuur 3). Deze lymfeklieren zijn aanzienlijk groter bij besmette dieren in vergelijking met niet-geënte dieren.
- Accijnzen de lymfeklieren door het plaatsen van microforceps onder het knooppunt en dan trek maximaal te scheiden van het omringende weefsel.
6. Isolatie van lymfoïde cellen in single-cell suspensies
- Transfer lymfeklieren op een steriel gaas scherm (ongeveer 3 x 3 cm 2 groot) geplaatst in een steriele glazen petrischaal met ~ 10 ml van gebalanceerde zoutoplossing Hanks "(HBSS) (figuur 4).
- Met de petrischaal enigszins schuin, drukt u op de lymfeklieren tegen het scherm met een spuit zuiger kop. Zorg ervoor dat alle lymfeklieren te breken, zodat de cellulaire inhoud van de knooppunten passeren op het scherm terwijl de niet-cellulaire componenten van de knooppunten (dat wil zeggen, membranen, stroma, vet) blijven op het scherm.
- Met dezelfde zuiger en spuit, zuigen thij HBSS met cellen. Was het scherm met ~ 5 ml HBSS en het verzamelen van de resterende vloeistof in een 15 ml conische buis.
- Centrifugeer bij 800 xg gedurende 10 minuten. Aspireren eventuele vetafzetting op de top van de vloeistof met een pipet voor het teruggooien van het vocht. Was de celpellet drie keer met HBSS. Resuspendeer de pellet in 1 ml HBSS en sommen levensvatbare cellen door trypan blauwe kleurstof uitsluiting.
7. Representatieve resultaten:
De cellulaire fracties van vaginale lavage vloeistof uit> 4-daagse entte muizen in het algemeen bestaan uit Candida, epitheliale cellen en cellulaire infiltraten (figuur 5). Door natte-mount microscopie, kan Candida visueel worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van hyfen als gist (figuur 5A). Smeer de voorbereidingen van vaginale lavage vloeistof kan worden gekleurd door de Papanicolaou-techniek om epitheliale cellen en infiltreren leukocyten, waarvan de belangrijkste cellen neutrofielen geïdentificeerd door de tri-nucle onderzoekenAR kwabben (figuur 5B). Heel weinig neutrofielen, indien van toepassing, zijn gedetecteerd in niet-geënte muizen (figuur 5C) 41.
Een voorbeeld van een vaginale schimmel belasting is weergegeven in figuur 6. Vaginaal lavage vloeistof verzameld op specifieke tijdstippen worden gekweekt voor de CFU opsomming (figuur 6A). Vaginale kolonisatie / infectie met Candida blijft wekenlang in de oestrogeen-behandelde muizen ingeënt (figuur 6B), terwijl Candida niet aan vaginale kolonisatie vestigen in niet-oestrogeen-behandelde muizen ingeënt (Figuur 6C). Oestrogeen-behandelde muizen niet-geënte blijft negatief voor Candida in de tijd (gegevens niet getoond). Daarnaast kunnen vaginale spoelsels te worden uitgevoerd hetzij een keer op een aparte muizen op elk tijdstip of overlangs in dezelfde muizen onder narcose.
De lumbale lymfeklieren zijn de primaire drainerende lymfeknopen van de voortplantingsorganen en de meest relevante website te evalueren voor systemische immuunrespons op een vaginale uitdaging. NOTE dat deze lymfeklieren kunnen worden uitgebreid in entte muizen in, terwijl deze normaliter voorkomen erg klein in niet-geënte muizen. Leukocyten cellulaire terugvorderingen doorgaans variëren van 8 × 10 5 / niet-geënte muis om 5 × 10 6 / ingeënt muis. Naast de lumbale lymfeklieren, kan lies, knieholte en mesenteriale lymfeklieren ook worden gebruikt.
Figuur 1. Vaginale inoculatie met Candida. A) Een muis ingehouden voor de inenting. De muis is geplaatst op een kooi plaatsen en gehouden door de basis van de staart, iets omhoog om de benen te tillen en de vaginale opening bloot te leggen. De heup van de muis kan worden gestabiliseerd met dezelfde hand als het probeert te verzetten tegen de staart terughoudendheid. B) Invoering van het inoculum in de vaginale lumen. Een pipet tip is zachtjes geplaatst ongeveer 5 mm diep in de vaginale lumen. De suspensie inoculum wordt dan afgezet.
Figuur 2. Vaginale weefsel extractie. AB) Extractie van de baarmoederhals. De baarmoederhals ligt met gebogen pincet en naar buiten worden blootgesteld door de vaginale holte. Eenmaal uit de vaginale holte, wordt de baarmoederhals verder getrokken naar buiten om volledig bloot te leggen van de vagina. C) Extractie van de vagina. De vagina is uitgesneden uit de vulva met een schaar. Eenmaal los, verwijder de baarmoederhals uit de vagina.
Figuur 3. Identificatie van de lumbale lymfeklieren. De locatie van de lumbale lymfeklieren onder de omliggende organen / bloedvaten in de nabijheid van het bekken wordt aangegeven. Een, abdominale aorta. B, de blaas. C, gemeenschappelijke iliacale slagader. Ik, darmen. L, lever. R, rectum. S, de milt. U, baarmoeders.
Figuur 4. De lumbale lymfeklieren geplaatst op een gaas-scherm. De lymfeklieren worden samengevoegd op het scherm geplaatst in een petrischaal met HBSS. De lymfeklieren zijn gedrukt tegen het scherm met een zuiger van de spuit om lymfoïde cellen te verkrijgen in single-cell suspensies.
Figuur 5. Cellulaire fracties van vaginale lavage vocht uit geïnoculeerde muizen. A) Wet-mount en B) uitstrijkje voorbereidingen van vaginale lavage monsters verzameld vier dagen na de inenting en C) van de niet-geënte muizen. Beelden worden getoond op 1000 × (A) of 400 × (B, C) vergroting. De insert in B toont de nucleaire morfologie van vaginale neutrofielen bij 1000 ×. Candida gist (Y) en hyphae (H), epitheelcellen (EC) en neutrohils (N) zijn aangegeven.
Figuur 6. Detection van vaginale schimmel last. A) Representatieve C. albicans kolonies gegroeid op een SDA plaat. Nette (N) lavage monsters van zes verschillende entte muizen in (bovenste rij) werden serieel verdund en gekweekt CFU opsomming. B) Kwantificering van de vaginale schimmel lasten in oestrogeen-behandeld en C) niet-oestrogeen-behandelde muizen. Kve/100 pi lavage vloeistof uit entte muizen werd beoordeeld op aangegeven tijdstippen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een experimenteel muismodel van Candida vaginitis is vastgesteld en historisch gebruikt voor de afgelopen decennia mucosale gastheer reactie op Candida studie en voor het testen van antischimmel therapieën 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. De protocollen die hier nemen efficiënte en minder arbeidsintensieve methoden, en lijken een van de meest optimale model systemen van Candida vaginitis beschreven. Deze technieken maken een snelle kwantificering van de schimmel last en het verzamelen van vaginale exemplaren. Bovendien eerdere studies het testen van verschillende haplotypic stammen van muizen (n = 13) en verschillende tijdstippen post-inoculatie de vergelijkbare niveaus van de variabiliteit in de schimmel lasten en gastheer antwoorden bleek dat bij vaginale kolonisatie met Candida 2,6,41. Daarom kan dit model worden aangepast aan bestaande protocollen, zonder beperking op de muis stammen of de duur van de infectie. Echter, men moet erkennen dat devariabiliteit in vaginale schimmel druk kan hoog zijn tussen dieren die hetzelfde inoculum (figuur 6B). Er is bewijs dat de variabiliteit optreedt als gevolg van verschillende mate van vroege toetreding tot vaginale epitheel 41. Daarom is 7-10 muizen / groep stelde voor statistische doeleinden.
Variabiliteit in vaginale schimmel belasting is ook aangetoond tussen de verschillende stammen van C. albicans, wat suggereert dat niet alle stammen van C. albicans hebben de capaciteit om dezelfde koloniseren de muis vagina. Bijvoorbeeld, C. albicans 3153A (lab-stam) in dit protocol is gemeld dat het hoger vaginale kolonisatie tonen dan SC5314 (klinisch isolaat), waarbij een hogere inoculum (> een log) nodig zou zijn om een gelijkwaardige graad van vaginale schimmel last gezien met 3153A 27 te verkrijgen. In feite, heeft een zeer variabel vaginale kolonisatie met diverse klinische isolaten gedocumenteerd 36. Daarom moet men voorzichtig zijn taken bij het bepalen van een optimale inoculum voor elke C. albicans stam om een consistente kolonisatie in muizen te verzekeren. Typisch, de gemiddelde CFU's variërend van 5 x 10 4 tot 5 x 10 5 / 100 ul lavage vloeistof dient te worden vastgesteld voor een consistente kolonisatie. Voor de beoordeling van vaginale schimmel last, kwantificering van CFU's door spoelsels geschikt is voor dit model als Candida blastoconidia en hyfen normaal gesproken niet doordringen verder dan de oppervlakkige laag van vaginale epitheel. Onze vorige histologische evaluatie van post-lavage vaginale weefsel zelden toonde resterende Candida 25,41. Echter, we erkennen de mogelijkheid dat hyfen kon worden miscounted als ze groeien als een kolonie op de agar plaat en misschien niet overeen met nauwkeurige schimmel last. Als een alternatieve methode om CFU opsomming, een nieuw ontwikkelde in vivo beeldvormende techniek is gemeld dat het succes te beoordelen vaginale schimmel last bij het gebruik van genetisch gemanipuleerde lichtgevende C. albicans 9,29. Bovendien kan het protocol worden aangepast om C. te induceren glabrata kolonisatie bij diabetische dieren 15,20. Tot op heden hebben muismodellen voor andere niet-C. Albicans-geïnduceerde vaginitis niet gemeld.
Oestrogeen administratie is essentieel voor dit model, het initiëren van robuuste vaginale kolonisatie met Candida 6,14,23. Naast de subcutane injectie van estradiol in sesamolie suspensie, injectie van in water oplosbare estradiol in PBS en intradermale implantatie van een gecontroleerde afgifte estradiol pellet zijn alternatieve methoden voor het oestrogeen toediening en zijn tewerkgesteld in andere muismodellen van vrouwelijke genitale infecties 10 , 35. Vereiste van hoge oestrogeen in dit model kan worden verklaard door twee fysiologische factoren. Een daarvan is dat verhoogde oestrogeen gelaagdheid van vaginale epitheel 5,8,30 bevordert. Verdikte epitheel van de toegenomen epitheelcelproliferatie kunnen alleow Candida om betere hechting aan de vaginawand en de daaropvolgende kolonisatie te krijgen. Ten tweede zijn vaginale epitheelcellen bekend om hoge glycogeen inhoud. Een verhoogd weefsel niveau van oestrogeen leidt tot afzetting van glycogeen in de vaginale wand 30. Verhoogde glycogeen in de vaginale micro-omgeving kunnen op hun beurt laten Candida tot bloei kan komen door het verstrekken van extra voedingsstoffen. Vorige immuun-analyses toonden aan dat exogene oestrogenen niet celadhesiemolecuul expressie 40 beïnvloeden. Een nadeel van de behandeling van de dieren met exogene oestrogenen is dat de verhoogde oestrogeen is ook bekend dat overgroei van de vaginale flora commensale 30 te promoten. Aangezien de samenstelling van de flora kunnen aanzienlijk verschillen tussen de dieren, kan deze add een variabele waar commensale organismen kunnen Candida groei beïnvloeden of moduleren gastheer reacties. Als tegenprestatie van deze kwestie, het model vereist oestrogeen-behandelde controle (niet-geënte) dieren op te nemen inalle experimenten en geanalyseerd in parallel.
In deze muis model, kan de effectiviteit van anti-schimmel middelen nauwkeurig worden beoordeeld door de protocollen beschreven, die kunnen van cruciaal belang in vivo testen leidt tot de ontwikkeling van potentiële therapieën voor klinisch gebruik. In feite is het robuuste karakter van het model zorgt voor een goede indicatie van de klinische werkzaamheid. In aanvulling op het gebruik van oestrogenen, neutrale vaginale pH bij muizen bevordert de groei van de hyfen, een pathogene vorm van Candida te zien in alle ingeënt muizen. Net als bij klinische observaties, een robuuste vaginale neutrofiel migratie vindt plaats in een subset van muizen zonder dat schimmel belasting 31,41. De aanwezigheid van neutrofielen is prominent aanwezig in vrouwen tijdens symptomatische vaginitis en lijkt parallel muizen na inoculatie 12,41. Aangezien ook andere klinische symptomen (dat wil zeggen, jeuk, zwelling) kan niet precies meetbaar bij muizen, de beoordeling van de vaginale neutrofielenfungeert als een eenvoudige, maar betrouwbare indicatie van ontsteking (symptomen) in dit model.
De microscopie van de vaginale lavage vocht weergegeven in figuur 5 wordt routinematig uitgevoerd in ons laboratorium om Candida kolonisatie en vaginale ontsteking te beoordelen. Bovendien kan hyfen scoren ook worden gebruikt als een maat voor infectie. Daarna kan de cellulaire en oplosbare fracties van de lavage vloeistof worden bewaard en cryo-gearchiveerd voor toekomstige analyses. Van de nota, een voordelige eigenschap van het protocol is dat de vaginale spoelsels kunnen lengterichting worden uitgevoerd in dezelfde muizen onder narcose. Onze eerdere studies bevestigd dat longitudinale evaluatie geen beoordeling van de vaginale schimmel last beïnvloeden. Deze aanpak is bijzonder voordelig in gevallen waarin de longitudinale analyses van infectie zijn gewenst.
Tot slot hebben we een minder invasieve excisie methode voor de vagina. Deze effectieve en snelle techniek vereist geen insnijding inde buik of interne organen, waarbij de rest van de voortplantingsorganen intact. Een andere handige functie van dit model is het ontbreken van een vereiste voor immunosuppressiva aan Candida kolonisatie te starten. Dit is vooral belangrijk omdat de instandhouding van natuurlijke immuunstatus van de gastheer is een cruciaal aspect van immunologische studies en gastheer antwoorden op een microbiële uitdaging. Daarom kunnen weefsels en cellen geïsoleerd door deze methoden worden toegepast in diverse in-vitro-immuun assays.
Tot slot geven we een aantal belangrijke eigenschappen en representatief zijn de resultaten van het experimenteel model van vaginale candidiasis. Naast de C. albicans-geïnduceerde vaginitis, hebben infecties door andere ziekteverwekkers van de vrouwelijke geslachtsorganen onderste, met inbegrip van Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis en Herpes simplex virus bestudeerd met behulp van muis-modellen waar de organismen intravaginaal worden ingevoerd in hormoon-behandelde muizen 1,7,10,22,26,35,38. Daarom kan de technieken die bruikbaar zijn voor studies met Candida vaginitis worden toegepast en mogelijk vooraf methodologieën om de pathogenese te bestuderen en immuunreacties host voor andere besmettelijke ziekten van de vrouwelijke lagere genitale tractus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door R01 AI32556 (NIAID, National Institute of Health). Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door Louisiana Vaccine Center en Zuid-Louisiana Instituut voor Besmettelijke Ziekte onderzoek gesponsord door het Louisiana College van Regenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female CBA/J mice | Charles River Laboratories | 01C38 | 5-6 weeks of age |
| Candida albicans (3153A) | National Collection of Pathogenic Fungi, UK | NCPF3153 | |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547 | D–s not need to be pre-sterilized before use |
| Β-estradiol 17-valerate | Sigma-Aldrich | E1631 | 0.1-0.5mg in sesame oil |
| Phytone peptone | BD Biosciences | 211906 | Supplement with 0.1% glucose |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Sabouraud dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | |
| Collagenase type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | 0.25% |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 1.7 U/ml |
| Wire mesh screens | TWP | 060X060S0065W36T | No. 60 mesh, stainless |
| Hanks’ balanced salt solution | Invitrogen | 24020-117 | |
| CytoPrep fixative | Fisher Scientific | 12-570-10 | Preserves smear slides |
| Papanicolaou stain EA-65 | EMD Millipore | 7054X-85 | |
| Papanicolaou stain OG-6 | EMD Millipore | 7052X-85 | |
| Harris’ Alum hematoxylin | EMD Millipore | 638A-85 | |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | Used with isoflurane vaporizer or in a drop system closed anesthetic chamber |
References
- Abraham, M. C. Inducible immunity to Trichomonas vaginalis in a mouse model of vaginal infection. Infect. Immun. 64, 3571-3571 (1996).
- Black, C. A. Major histocompatibility haplotype does not impact the course of experimentally induced murine vaginal candidiasis. Lab. Anim. Sci. 49 (6), 668-668 (1999).
- Black, C. A. Acute neutropenia decreases inflammation associated with murine vaginal candidiasis but has no effect on the course of infection. Inf. Immun. 66, 1273-1273 (1998).
- Black, C. A. Increased severity of Candida vaginitis in BALB/c nu/nu mice versus the parent strain is not abrogated by adoptive transfer of T cell enriched lymphocytes. J. Reprod. Immunol. 45, 1-1 (1999).
- Buchannan, D. L. Role of stromal and epithelial estrogen receptors in vaginal epithelial proliferation, stratification, and cornification. Endocrinology. 139 (10), 4345-4345 (1998).
- Clemons, K. V. Genetic susceptibility of mice to Candida albicans vaginitis correlates with host estrogen sensitivity. Infect. Immun. 72, 4878-4878 (2004).
- Conrady, C. D., Halford, W. P., Carr, D. J. Loss of the type I interferon pathway increases vulnerability of mice to genital Herpes simplex virus 2 infection. J. Virol. 85 (4), 1625-1625 (2011).
- Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of estromal-epithelial interaction in hormonal responses. Arch Histol Cytol. 67 (5), 417-417 (2004).
- Enjalbert, B. A multifunctional, synthetic Caussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. 77 (11), 4847-4847 (2009).
- Feinen, B. Critical role of Th17 responses in a murine model of Neisseria gonorrhoeae genital infection. Mucosal Immunol. 3 (3), 312-312 (2010).
- Fidel, P. L. Distinct protective host defenses against oral and vaginal candidiasis. Med. Mycol. 40, 359-359 (2002).
- Fidel, P. L. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect. Immun. 72, 2939-2939 (2004).
- Fidel, P. L., Cutright, J. L., Sobel, J. D. Efficacy of D0870 treatment of experimental Candida vaginitis. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, 1455-1455 (1997).
- Fidel, P. L., Cutright, J. L., Steele, C. Effects of Reproductive hormones on experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 68, 651-651 (2000).
- Fidel, P. L. A murine model of Candida glabrata vaginitis. J. Inf. Dis. 173, 425-425 (1996).
- Fidel, P. L. Analysis of vaginal cell populations during experimental vaginal candidiasis. Inf. Immun. 67, 3135-3135 (1999).
- Fidel, P. L., Lynch, M. E., Sobel, J. D. Candida-specific cell-mediated immunity is demonstrable in mice with experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 61, 1990-1990 (1993).
- Fidel, P. L., Sobel, J. D.
- Fidel, P. L., Sobel, J. D. Murine Models of Candida Vaginal Infections, In Experimental models in antimicrobial chemotherapy. Zak, O., Sande, M. , 2nd ed, Academic Press Ltd. London, UK. 741-748 (1999).
- Fidel, P. L., Vazquez, J. A., Sobel, J. D. Candida glabrata: Review of epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to C. albicans. Clin. Microbiol. Rev. 12, 80-80 (1999).
- Fulurija, A., Ashman, R. B., Papadimitriou, J. M. Neutrophil depletion increases susceptibility to systemic and vaginal candidiasis in mice, and reveals differences between brain and kidney in mechanisms of host resistance. Microbiology. 142, 3487-3487 (1996).
- Gill, N. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269 (1), 29-29 (2011).
- Hamad, M., Abu-Elteen, K. H., Ghaleb, M. Estrogen-dependent induction of persistent vaginal candidosis in naive mice. Cell. Immunol. 47 (7), 304-304 (2004).
- Hamad, M. Utility of the oestrogen-dependent vaginal candidosis murine model in evaluating the efficacy of various therapies against vaginal Candida albicans infection. Mycoses. 49 (2), 104-104 (2006).
- LeBlanc, D. M., Barousse, M. M., Fidel, P. L. A role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 74, 3213-3213 (2006).
- McGrory, T., Garber, G. E. Mouse intravaginal infection with Trichomonas vaginalis and role of Lactobacillus acidophilus in sustaining infection. Infect. Immun. 60, 2375-2379 (1992).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS. Microbiol. Lett. 283 (2), 129-129 (2008).
- Nomanbhoy, F. Vaginal and oral epithelial cell anti-Candida activity. Inf. Immun. 70, 7081-7081 (2002).
- Pietrella, D. A beta-glucan-conjugate vaccine and anti-beta-glucan antibodies are effective against murine vaginal candidiasis as assessed by a novel in vivo imaging technique. Vaccine. 28 (7), 1717-1717 (2010).
- Redondo-Lopez, V., Cook, R. N., Sobel, J. D. Emerging role of Lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora. Rev Infect Dis. 12 (5), 856-856 (1990).
- Saavedra, M. Local production of chemokines during experimental vaginal candidiasis. Inf. Immun. 67, 5820-5820 (1999).
- Sobel, J. D. Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis. Ann. N. Y. Acad. Sci. 544, 547-547 (1988).
- Sobel, J. D. Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis. Clin. Infect. Dis. 14, Suppl 1. S148-S153 (1992).
- Sobel, J. D. Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations. Am. J. Obstet. Gynecol. 178 (2), 203-203 (1998).
- Song, W. Local and humoral immune responses against primary and repeat Neisseria gonorrhoeae genital tract infections of 17β-estradiol-treated mice. Vaccine. 26, 5741-5741 (2008).
- Taylor, B. N. In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus. J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).
- Taylor, B. N., Saavedra, M., Fidel, P. L. Local Th1/Th2 cytokine production during experimental vaginal candidiasis. Med. Mycol. 38, 419-419 (2000).
- Tirabassi, R. S. A mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type 2. Vaccine. 29 (5), 1090-1090 (2011).
- Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: descriptive and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J. Immunol. Methods. 312 (1-2), 12-12 (2006).
- Wormley, F. L., Chaiban, J., Fidel, P. L. Cell adhesion molecule and lymphocyte activation marker expression during experimental vaginal candidiasis. J. Immunol. Methods. 69, 5072-5072 (2001).
- Yano, J. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).
