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Immunology and Infection

योनि और प्रायोगिक माउस मॉडल में नमूना संग्रह टीका के लिए प्रोटोकॉल Candida योनिशोथ

Published: December 8, 2011 doi: 10.3791/3382
Automatic Translation
1, 1
1Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

कुंजी तकनीकों के मूल्यांकन में इस्तेमाल किया जा

Protocol

1. Candida albicans के साथ योनि टीका

  1. तीन दिन पहले टीका, जबकि पशु निरोधक पेट को बेनकाब करने के लिए, β estradiol की 0.1-0.5 मिलीग्राम पेट के निचले हिस्से में subcutaneously युक्त तिल के तेल के 100 μl इंजेक्षन. त्वचा के लिए पार्श्व इंजेक्शन साइट से रिसाव को कम करने के लिए 5 से 10 मिमी के बारे में सुई अग्रिम.
    पेट के निचले हिस्से में एस्ट्रोजन का उपचर्म प्रशासन इस जननांग पथ के करीब निकटता के कारण मॉडल में इष्टतम है. प्रभावी खुराक माउस उपभेदों, उम्र या एस्ट्रोजन डेरिवेटिव द्वारा भिन्न हो सकते हैं. पिछले CBA जम्मू (एच 2 κ), C3H/HeN (एच 2 κ), C57BL / 6 (एच 2 बी), Balb / ग (एच 2 घ) का उपयोग अध्ययन में, DBA / 2 ( एच 2 डी), उम्र के 6-8 सप्ताह में SJL चूहों (एच 2 एस), 0.1 mg/100 μl प्रभावी पाया गया योनि दीवार का उमड़ना द्वारा evidenced, योनि बलगम और कमउपकला कोशिका sloughing वृद्धि हुई. ऊपर इस एकाग्रता में एस्ट्रोजन के साथ इलाज चूहे Candida के साथ संगत योनि उपनिवेशण दिखा रहे हैं. अन्य उपभेदों और उम्र के चूहों में टीका के लिए, एक पायलट अध्ययन करने के लिए संशोधित शर्तों के तहत एस्ट्रोजन की प्रभावशीलता सुनिश्चित करने और यदि आवश्यक हो तो एस्ट्रोजन खुराक में वृद्धि की सिफारिश की है.
    एस्ट्रोजन समाधान इंजेक्शन के दिन हर बार नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए. तिल के तेल में एस्ट्रोजन की पूरी विलेयता सुनिश्चित करने के लिए, अच्छी तरह से 37 पर समाधान एक भंवर मिक्सर और गर्मी रहकर प्रयोग मिश्रण डिग्री सेल्सियस अध्ययन अवधि के दौरान साप्ताहिक इंजेक्शन दोहराएँ.
  2. Inoculum तैयार करने के लिए, सी के एक loopful जोड़ने Phytone peptone 0.1% ग्लूकोज के साथ पूरक शोरबा के 10 मिलीलीटर में अगर Sabouraud dextrose (एसडीए) पर हाल ही में एक subculture तैयारी से albicans blastoconidia . 18 ज के लिए स्थिर चरण के लिए 25 ° सी एक मिलाते हुए पानी के स्नान में शोरबा संस्कृति सेते हैं.
  3. ऊष्मायन के बाद, वें इकट्ठाई एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार और 5 मिनट के लिए 800 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र में शोरबा संस्कृति. गोली दो बार धो बाँझ पीबीएस के साथ.
  4. Trypan नीले डाई अपवर्जन hemocytometer पर व्यवहार्य blastoconidia गणना करें. 2.5 से सेल एकाग्रता समायोजित x 10 बाँझ पीबीएस में 6 मिलीग्राम / (या एक वांछित inoculum एकाग्रता के लिए).
  5. माउस को स्थिर करने के लिए, दो उंगलियों के साथ पूंछ के आधार पकड़ और कूल्हे ऊपर इतना है कि आप (चित्रा 1A) की ओर योनि खोलने चेहरे लिफ्ट. यह आदर्श है अगर माउस में एक फ्लैट grated सतह (जैसे पिंजरे शीर्ष) पर रखा गया है कि माउस पूंछ संयम के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं.
  6. विंदुक विंदुक टिप के बारे में 5 मिमी योनि लुमेन (चित्रा 1 बी) में गहरी डालने से inoculum निलंबन का 20 μl (या एक वांछित 20 μl नहीं से अधिक मात्रा). इस कदम के रूप में जल्दी और धीरे के रूप में संभव पूरा करने के लिए माउस में संकट को कम.

2. योनि lavages

  1. घंटे के बाद इच्छामृत्यु (या संज्ञाहरण),पुराने दो उंगलियों ताकि योनि खोलने उजागर हो जाता है के साथ पूंछ के आधार से नीचे माउस.
  2. दोहराया और एक विंदुक टिप के साथ आकांक्षा आंदोलन के साथ बाँझ पीबीएस के 100 μl शुरू करने से योनि लुमेन Lavage. विंदुक टिप कोशिकाओं के साथ भरा हो सकता है. यदि ऐसा होता है, कोशिकाओं में बाधा डालने के बग़ैर और lavaging योनि में शेष पीबीएस के साथ जारी है. एक microcentrifuge ट्यूब में पानी से धोना तरल पदार्थ ले लीजिए.
  3. वैकल्पिक रूप से, योनि lavages isoflurane inhalant संज्ञाहरण के साथ anesthetized चूहों पर किया जा सकता है है. इस के लिए, चूहों को बेनकाब करने के लिए isoflurane vaporized जब तक वे पूरी तरह से बेहोश हैं (~ 30 सेकंड). पूंछ के आधार द्वारा नीचे चूहों पकड़ो और धीरे से योनि बाँझ पीबीएस के 50 μl का उपयोग लुमेन पानी से धोना. इस प्रक्रिया के दौरान योनि को आघात को कम करने के लिए एक विंदुक टिप के साथ कठोर आंदोलन से बचने के लिए सुनिश्चित करें. बेहोश चूहों संज्ञाहरण से परिवेशी वायु के संपर्क में 30 सेकंड के भीतर ठीक करना चाहिए.

    Isofluraneएक isoflurane vaporizer और ओ 2 (पसंदीदा) या एक मानक ड्रॉप प्रणाली संवेदनाहारी vaporizer प्रणाली (जानवर के निकट निगरानी की आवश्यकता है जबकि श्वसन संकट से बचने के बेहोश) के बिना कक्ष बंद का उपयोग vaporized किया जा सकता है है.

    Anesthetized चूहों पर योनि lavages ही चूहों पर अनुदैर्ध्य lavage नमूने के लिए पसंद की विधि होना चाहिए. लगातार lavaging 41 से अधिक समय कवक बोझ का आकलन प्रभावित नहीं करती.

  4. गीला माउंट की तैयारी के लिए, एक गिलास स्लाइड पर lavage द्रव के 10 μl हस्तांतरण और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा 400-1000x बढ़ाई पर निरीक्षण. इसके अतिरिक्त, lavage द्रव की सेलुलर भिन्न करने के लिए सेल और परमाणु morphologies की जांच दाग जा सकता है. स्मियर तैयारी के लिए, एक गिलास स्लाइड पर lavage द्रव के 10 μl हस्तांतरण और धीरे से एक विंदुक टिप की बाहरी दीवार का उपयोग फैल. रक्षित CytoPrep लगानेवाला साथ धब्बा नमूने और मानक Papanicolaou तकनीक द्वारा दाग पैप स्मीयर (). प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा 400 × बढ़ाई निरीक्षण.

3. योनि कवक बोझ की मात्रा का ठहराव

  1. एक 96 अच्छी तरह से दौर नीचे की थाली में, एक में अच्छी तरह से ऊपर और उस स्तंभ के निम्नलिखित 5 कुओं (प्लेट के नीचे) में बाँझ पीबीएस के 180 μl पंक्ति के पानी से धोना तरल स्थानान्तरण.
  2. अगले स्तंभ में अच्छी तरह से करने के लिए तरल पदार्थ की 20 μl स्थानांतरित द्वारा योनि lavage द्रव के 1:10 धारावाहिक dilutions बनाओ. प्रत्येक हस्तांतरण से पहले दोहराया आकांक्षा से अच्छी तरह मिक्स. 12 lavage नमूने (एक पूर्ण क्षैतिज पंक्ति) तक के सीरियल dilutions के साथ एक 12 चैनल पिपेट का उपयोग किया जा सकता है है.
  3. कम कमजोर पड़ने के साथ शुरू, Sabouraud dextrose अगर (एसडीए) पर नमूने के 10 μl हस्तांतरण. 36 नमूनों की चढ़ाना एक वर्ग ग्रिड और एक समायोज्य रिक्ति multichannel विंदुक के साथ पेट्री डिश में तैयार एसडीए का उपयोग कर प्लेट पर प्रदर्शन किया जा सकता है है.
  4. 34 में कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) ऊष्मायन के बाद गणना करें डिग्री सेल्सियस चया 48 एच.

4. योनि ऊतक निष्कर्षण

  1. योनि lavage प्रक्रिया के बाद, अपनी पीठ पर euthanized माउस करना और 70% इथेनॉल के साथ कमर क्षेत्र तर. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग लिफ्ट मूत्र छिद्र ऊपर इतना है कि योनि खोलने उजागर हो जाता है.
  2. योनि लुमेन में घुमावदार संदंश की एक जोड़ी डालें और गर्भाशय ग्रीवा का पता लगाने. हालांकि संदंश के साथ एक फर्म पकड़ बनाए रखने, योनि गुहा (चित्रा 2A सी) के माध्यम से गर्भाशय ग्रीवा निकाल सकते हैं.
  3. योनि खोलने के आधार पर और फिर उत्पाद शुल्क शल्य कैंची के साथ योनि योनि से गर्भाशय ग्रीवा को हटा दें. ध्यान रखें कि योनि ऊतक involuted (योनि के भीतर उपकला साइड जावक उजागर). ऊतक laterally या तो कर सकते हैं योनि के मूल ओरिएंटेशन बनाए रखने के लिए औंधा या एक पार्श्व चीरा द्वारा एक पत्रक में खोला गया.

    Excised योनि ऊतकों 1 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) लिम्फोसाइट निकासी निम्नलिखित कोलाजhistological 25 विश्लेषण के लिए nase (~ 1 × 4 माउस / 10) 40, 2) पाचन उपकला कोशिका अलगाव निम्नलिखित dispase (~ 5 माउस × 4 / 10) पाचन 28, 3) जमी आयल या एम्बेडेड तैयारी.

5. लम्बर लिम्फ नोड छांटना

  1. योनि lavage प्रक्रिया के बाद, अपनी पीठ पर euthanized माउस करना और 70% इथेनॉल के साथ पेट तर. एक पार्श्व पेट के निचले हिस्से से सीने में शुरू चीरा और आंतरिक अंगों को बेनकाब. दोनों हाथों में संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, आंतों कदम ऊपर इतना है कि केंद्रीय रक्त वाहिकाओं दृश्यमान हो.
  2. अवर रग Cava और उदर महाधमनी का पता लगाएँ. आम तौर पर, काठ लिम्फ नोड्स की एक जोड़ी के उदर महाधमनी के आसन्न पहचाना जा सकता है, गुर्दे और आम श्रोणिफलक धमनियों 39 के मूल के बीच आधे रास्ते के बारे में स्थित है. इन लिम्फ नोड्स नेत्रहीन लोचदार बनावट से वसा ऊतकों से प्रतिष्ठित किया जा सकता हैऔर वसा ऊतकों (चित्रा 3) की तुलना में लाइटर और अधिक रंग में अपारदर्शी रहे हैं. इन लिम्फ नोड्स uninoculated पशुओं की तुलना में संक्रमित पशुओं में काफ़ी बड़ा है.
  3. आबकारी नोड के अंतर्गत microforceps रखकर लिम्फ नोड्स और फिर धीरे से खींच के आसपास के ऊतकों से अलग है.

6. Lymphoid कोशिकाओं के एकल कक्ष निलंबन में अलगाव

  1. लिम्फ नोड्स एक बाँझ तार मेष (आकार में लगभग 3 x 2 3 सेमी) स्क्रीन एक बाँझ गिलास पेट्री पकवान युक्त ~ हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान के 10 मिलीलीटर (HBSS) (चित्रा 4) के अंदर रखा पर स्थानांतरण .
  2. थोड़ा इच्छुक पेट्री डिश के साथ एक सिरिंज सवार सिर के साथ स्क्रीन के खिलाफ लिम्फ नोड्स दबाएँ. सभी लिम्फ नोड्स को तोड़ने ताकि नोड्स के सेलुलर सामग्री स्क्रीन के माध्यम से गुजरती हैं जबकि गैर नोड्स के सेलुलर घटकों (यानी, झिल्ली stroma, वसा) स्क्रीन पर बने रहने के लिए सुनिश्चित करें.
  3. एक ही सवार और सिरिंज, महाप्राण (व्यंजन) टी का उपयोगवह युक्त कोशिकाओं HBSS. धो ~ 5 मिलीलीटर HBSS के साथ स्क्रीन और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में शेष तरल पदार्थ इकट्ठा.
  4. 10 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र. तरल पदार्थ के शीर्ष पर एक discarding करने के लिए तरल पदार्थ से पहले विंदुक के साथ किसी भी वसा जमा महाप्राण (व्यंजन). HBSS के साथ सेल गोली तीन बार धोएं. Trypan नीले डाई अपवर्जन और HBSS एन्यूमरेट करने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend.

7. प्रतिनिधि परिणाम:

> 4 दिन inoculated चूहों से योनि lavage द्रव की सेलुलर भिन्न आमतौर पर Candida, उपकला कोशिकाओं और सेलुलर पैठ (चित्रा 5) से मिलकर बनता है . गीला माउंट माइक्रोस्कोपी करके, Candida नेत्रहीन hyphae की उपस्थिति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खमीर (चित्रा 5A) द्वारा की पहचान किया जा सकता है. उपकला कोशिकाओं और घुसपैठ leukocytes, जिनमें से प्रमुख कोशिकाओं त्रिकोणीय Nucle द्वारा पहचान neutrophils रहे हैं की जांच योनि lavage द्रव की स्मियर तैयारी Papanicolaou तकनीक से सना हुआ जा सकता हैगिरफ्तारी lobes (चित्रा 5B). बहुत कुछ है, यदि कोई हो, neutrophils uninoculated (चित्रा 5C) 41 ​​चूहों में पता चला रहे हैं.

योनि कवक बोझ का एक उदाहरण चित्रा 6 में दिखाया गया है. योनि lavage विशिष्ट समय बिंदुओं पर एकत्र तरल पदार्थ CFU गणन (6A चित्रा) के लिए सभ्य हैं. योनि संक्रमण Candida के साथ उपनिवेशण / एस्ट्रोजन इलाज inoculated चूहों (चित्रा 6B) में सप्ताह के लिए बनी रहती है, जबकि Candida गैर एस्ट्रोजन का इलाज inoculated चूहों (6C चित्रा) में योनि उपनिवेशण स्थापित करने में विफल रहता है. एस्ट्रोजन इलाज चूहों uninoculated Candida के लिए समय (नहीं दिखाया डेटा है) भर में नकारात्मक रहते हैं. इसके अलावा, योनि lavages या तो प्रदर्शन किया जा सकता है प्रत्येक समय बिंदु पर या longitudinally संज्ञाहरण के तहत एक ही चूहों में अलग - अलग चूहों पर एक बार.

काठ लिम्फ नोड्स प्राथमिक draining जननांग पथ और एक योनि चुनौती देने के लिए प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए मूल्यांकन करने के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक साइट के लिम्फ नोड्स रहे हैं. एनote कि इन लिम्फ नोड्स inoculated चूहों में विस्तृत हो, जबकि वे सामान्य चूहों uninoculated में काफी छोटा प्रकट हो सकता है. ल्युकोसैट सेलुलर वसूली आम तौर पर 8 से लेकर × 10 5 / uninoculated माउस करने के लिए 5 × 10 6 / inoculated माउस. काठ लिम्फ नोड्स के लिए अलावा, वंक्षण, जानुपृष्ठीय और mesenteric लिम्फ नोड्स भी इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 Candida के साथ योनि टीका. ए) एक माउस टीका के लिए रोका. माउस एक तार पिंजरे डालने पर रखा गया है और पूंछ के आधार द्वारा आयोजित, थोड़ा ऊपर की ओर पैर लिफ्ट और योनि खोलने बेनकाब. माउस के कूल्हे एक ही हाथ से स्थिर किया जा सकता है के रूप में यह पूंछ संयम का विरोध करने का प्रयास करता है. बी) योनि लुमेन में inoculum का परिचय. एक विंदुक टिप धीरे के बारे में 5 मिमी गहरी योनि लुमेन में डाला जाता है. निलंबन inoculum तो जमा है.


चित्रा 2 योनि ऊतक निष्कर्षण. एबी गर्भाशय ग्रीवा के निष्कर्षण). गर्भाशय ग्रीवा घुमावदार संदंश के साथ स्थित है और योनि गुहा के माध्यम से उजागर जावक. योनि गुहा के बाहर एक बार, गर्भाशय ग्रीवा आगे पूरी तरह से योनि को बेनकाब करने के लिए जावक खींच लिया है. सी) योनि के निष्कर्षण. योनि कैंची के साथ योनी से excised है. एक बार अलग, योनि से गर्भाशय ग्रीवा को हटा दें.

चित्रा 3
चित्रा 3 काठ लिम्फ नोड्स की पहचान. / अंगों श्रोणि के आसपास के क्षेत्र में रक्त वाहिकाओं आसपास के बीच काठ लिम्फ नोड्स के स्थान का संकेत है. एक, पेट महाधमनी. बी, मूत्राशय. सी, आम श्रोणिफलक धमनी. मैं, आंतों. एल, जिगर. आर, मलाशय. एस तिल्ली. यू, ग्रीवा.

चित्रा 4
4 चित्रा काठ लिम्फ नोड्स एक तार जाल स्क्रीन पर रखा है. . लिम्फ नोड्स HBSS के साथ एक पेट्री डिश में रखा स्क्रीन पर जमा कर रहे हैं. लिम्फ नोड्स एक सिरिंज सवार के साथ एकल कक्ष निलंबन में lymphoid कोशिकाओं प्राप्त की स्क्रीन के खिलाफ दबाया जाता है.

चित्रा 5
चित्रा 5 inoculated चूहों से योनि lavage द्रव की सेलुलर भिन्न. योनि lavage नमूने के ए) गीले माउंट और बी) पैप स्मीयर की तैयारी 4 दिनों के बाद टीका और सी uninoculated चूहों से) एकत्र. छवियाँ × 1000 (ए) या 400 पर दिखाए जाते हैं × (बी, सी) बढ़ाई. बी में डालने के 1000 × पर योनि neutrophils के परमाणु आकारिकी से पता चलता है कि Candida खमीर (वाई) और hyphae (एच), उपकला कोशिकाओं (ईसी) और neutrohils (एन ) है संकेत कर रहे हैं.

चित्रा 6
6 चित्रा का पता लगाएँ.योनि कवक बोझ के आयन. ए) प्रतिनिधि सी. albicans कालोनियों SDA थाली पर हो. साफ (एन) के छह अलग inoculated चूहों (शीर्ष पंक्ति) से पानी से धोना नमूने serially और पतला थे CFU गणन के लिए सुसंस्कृत. बी) योनि कवक बोझ की मात्रा में एस्ट्रोजन का इलाज और सी) गैर एस्ट्रोजन का इलाज चूहों. Inoculated चूहों से CFU/100 μl lavage द्रव के संकेत समय अंक पर मूल्यांकन किया गया था.

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Discussion

Candida vaginitis का एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल की स्थापना की गई है और ऐतिहासिक रूप से पिछले कुछ दशकों के लिए इस्तेमाल किया ऐंटिफंगल उपचारों 3,4,11,13,16,17,19,21,24 परीक्षण के लिए mucosal मेजबान Candida के जवाब के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन, 25,37. प्रोटोकॉल प्रस्तुत यहाँ कुशल और कम श्रम गहन तरीकों शामिल है, और सबसे अनुकूलित Candida vaginitis के मॉडल प्रणाली में से एक तिथि करने के लिए वर्णित किया जा दिखाई. इन तकनीकों में सक्षम कवक और योनि के नमूनों का बोझ संग्रह के तेजी से मात्रा का ठहराव. इसके अलावा, पिछले अध्ययनों चूहों के कई haplotypic उपभेदों (n = 13) परीक्षण और विभिन्न समय के बाद टीका अंक 2,6,41 Candida के साथ योनि उपनिवेशण कवक बोझ और मेजबान प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता के समान स्तर से पता चला है. इसलिए, इस मॉडल माउस उपभेदों पर प्रतिबंध या संक्रमण की अवधि के बिना मौजूदा प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि, एक पहचान करनी चाहिए कियोनि कवक बोझ में परिवर्तनशीलता ही inoculum (चित्रा 6B) दिया पशुओं के बीच उच्च किया जा सकता है. वहाँ का समर्थन है कि परिवर्तनशीलता योनि उपकला 41 के लिए जल्दी पालन की डिग्री भिन्न करने के लिए कारण होता है सबूत है . इसलिए, 7-10 चूहों / समूह सांख्यिकीय प्रयोजनों के लिए सुझाव दिया है.

सी. के विभिन्न प्रकारों के बीच योनि कवक बोझ में परिवर्तनशीलता भी सबूत गया albicans, सुझाव है कि सी. के सभी उपभेदों albicans के लिए इसी तरह माउस योनि उपनिवेश की क्षमता है . उदाहरण के लिए, सी. albicans (प्रयोगशाला तनाव) 3153A इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता SC5314 (अलग नैदानिक), जहां एक उच्च inoculum (> एक लॉग) योनि कवक बोझ के बराबर स्तर 27 3153A साथ देखा प्राप्त करने के लिए आवश्यक होगा की तुलना में उच्च योनि उपनिवेशण दिखाने के लिए सूचित किया गया है. वास्तव में, कई चिकित्सीय आइसोलेट्स के साथ एक उच्च चर योनि उपनिवेशण 36 प्रलेखित किया गया है. इसलिए, देखभाल तक होना चाहिएजब प्रत्येक सी. के लिए एक इष्टतम inoculum निर्धारण एन albicans के लिए चूहों में लगातार उपनिवेशण सुनिश्चित तनाव. आमतौर पर, 5 10 x 4 से 5 से लेकर CFUs x 5 / 100 μl lavage द्रव 10 लगातार उपनिवेशण के लिए पता होना चाहिए मतलब है. योनि कवक बोझ के आकलन के लिए, lavages द्वारा CFUs की मात्रा का ठहराव इस मॉडल के लिए उपयुक्त है के रूप में Candida blastoconidia और hyphae सामान्य रूप से योनि उपकला के सतही परत से परे नहीं घुसना. हमारे बाद पानी से धोना योनि ऊतकों के पिछले histological मूल्यांकन शायद ही कभी अवशिष्ट 25,41 Candida दिखाया. हालांकि, हम संभावना है कि hyphae miscounted के रूप में वे अगर प्लेट पर एक एकल कॉलोनी के रूप में विकसित और सटीक कवक बोझ को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है हो सकता है पहचान. CFU गणन, एक नव vivo इमेजिंग तकनीक में विकसित करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में करने के लिए सफलतापूर्वक योनि कवक बोझ का आकलन जब अनुवांशिक इंजीनियर luminescent सी. उपयोग कर सूचित किया गया है श्वेत 9,29>. इसके अलावा, प्रोटोकॉल सी. प्रेरित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है मधुमेह 15,20 पशुओं में glabrata उपनिवेशण. तिथि करने के लिए, अन्य गैर - सी albicans प्रेरित vaginitis के लिए माउस मॉडल की रिपोर्ट नहीं किया गया है.

एस्ट्रोजेन प्रशासन इस मॉडल के लिए महत्वपूर्ण है, 6,14,23 Candida के साथ मजबूत योनि उपनिवेशण की शुरुआत . उपचर्म इंजेक्शन के लिए पानी में घुलनशील एक रिलीज नियंत्रित estradiol गोली एस्ट्रोजन प्रशासन के लिए वैकल्पिक तरीकों रहे हैं और मादा जननांग पथ के संक्रमण के 10 अन्य माउस मॉडल में नियोजित किया गया है पीबीएस में estradiol और अंतर्त्वचीय आरोपण के estradiol, तिल का तेल निलंबन में इंजेक्शन के अलावा 35,. इस मॉडल में उच्च एस्ट्रोजन की आवश्यकता दो शारीरिक कारकों से समझाया जा सकता है. एक है कि बुलंद एस्ट्रोजन योनि उपकला 5,8,30 के स्तरीकरण को बढ़ावा देता है. बढ़ उपकला कोशिका प्रसार से thickened उपकला सभी सकता हैओउ करने के लिए बेहतर योनि दीवार और बाद उपनिवेशन पालन हासिल Candida. दूसरे, योनि उपकला कोशिकाओं के लिए उच्च ग्लाइकोजन सामग्री है करने के लिए जाना जाता है. एक योनि 30 दीवारों में ग्लाइकोजन के बयान में ऊतक एस्ट्रोजेन के स्तर के परिणाम में वृद्धि हुई. योनि microenvironment में ऊंचा ग्लाइकोजन में Candida के अतिरिक्त पोषक तत्वों प्रदान करके पनपने की अनुमति बदल सकते हैं . पिछला प्रतिरक्षा विश्लेषण से पता चला है कि exogenous एस्ट्रोजेन कोशिका आसंजन अणु अभिव्यक्ति 40 को प्रभावित नहीं किया . Exogenous एस्ट्रोजेन के साथ पशुओं के उपचार का एक दोष यह है कि बुलंद एस्ट्रोजन भी योनि खानेवाला वनस्पति 30 के अतिवृद्धि को बढ़ावा देने के ज्ञात किया गया है है. वनस्पति की संरचना के बाद से काफी जानवरों के बीच भिन्न हो सकते हैं, यह एक चर जहां खानेवाला जीवों Candida के विकास को प्रभावित या मेजबान प्रतिक्रियाओं मिलाना सकता है जोड़ सकते हैं. इस मुद्दे के विचार में, मॉडल है एस्ट्रोजन के इलाज नियंत्रण जानवरों (uninoculated) में शामिल किया जाना की आवश्यकता हैसभी प्रयोगों और समानांतर में विश्लेषण.

इस माउस मॉडल में, विरोधी कवक एजेंट की प्रभावकारिता सही ल प्रोटोकॉल, जो vivo में परीक्षण में नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए संभावित उपचारों के विकास के लिए अग्रणी महत्वपूर्ण प्रदान कर सकता है द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है . वास्तव में, मॉडल के मजबूत प्रकृति चिकित्सीय प्रभावकारिता का अच्छा संकेत प्रदान करता है. एस्ट्रोजन का उपयोग करने के लिए इसके अलावा, चूहों में तटस्थ योनि पीएच hyphae, Candida के एक रोगजनक फार्म सभी inoculated चूहों में देखा के विकास को बढ़ावा देता है. नैदानिक ​​टिप्पणियों के लिए इसी प्रकार, एक मजबूत योनि न्युट्रोफिल प्रवास कवक 31,41 बोझ को प्रभावित किए बिना चूहों के एक सबसेट में होता है. neutrophils की उपस्थिति रोगसूचक vaginitis के दौरान महिलाओं में प्रमुख है और समानांतर चूहों निम्नलिखित 12,41 टीका करने के लिए प्रकट होता है . चूंकि अन्य नैदानिक ​​लक्षण (यानी, खुजली, सूजन) ठीक चूहों में औसत दर्जे का नहीं होना, योनि neutrophils का आकलन कर सकते हैंसूजन के इस मॉडल में एक सरल अभी तक विश्वसनीय संकेत (लक्षण) के रूप में कार्य करता है.

चित्रा 5 में दिखाया गया योनि lavage द्रव की माइक्रोस्कोपी नियमित हमारी प्रयोगशाला में Candida उपनिवेशण और योनि सूजन का आकलन किया जाता है. इसके अलावा, hyphal स्कोरिंग भी संक्रमण के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके बाद, lavage द्रव के सेलुलर और घुलनशील भिन्न और संरक्षित किया जा सकता है भविष्य के विश्लेषण के लिए क्रायो - संग्रहीत. ध्यान से, प्रोटोकॉल की एक लाभप्रद विशेषता यह है कि योनि lavages संज्ञाहरण के तहत एक ही चूहों में longitudinally प्रदर्शन कर सकते हैं. हमारे पिछले अध्ययनों की पुष्टि की है कि अनुदैर्ध्य मूल्यांकन योनि कवक बोझ के मूल्यांकन को प्रभावित नहीं करता है. इस दृष्टिकोण के मामलों में जहां संक्रमण के अनुदैर्ध्य विश्लेषण वांछित हैं में विशेष रूप से लाभप्रद है.

अंत में, हम एक कम इनवेसिव योनि के लिए छांटना विधि विकसित किया है. यह प्रभावी और त्वरित तकनीक में कोई चीरा की आवश्यकता हैपेट या किसी भी आंतरिक अंगों, जननांग पथ के बाकी बरकरार जा. इस मॉडल का एक अन्य उपयोगी सुविधा Candida उपनिवेशण आरंभ immunosuppressive एजेंटों के लिए आवश्यकता की कमी है . यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि मेजबान की प्राकृतिक प्रतिरक्षा स्थिति को बनाए रखने प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययन एक माइक्रोबियल चुनौती और मेजबान प्रतिक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण पहलू है. इसलिए, इन तरीकों से अलग ऊतकों और कोशिकाओं इन विट्रो प्रतिरक्षा assays में विभिन्न में लागू किया जा सकता है.

अंत में, हम कई महत्वपूर्ण सुविधाओं और योनि कैंडिडिआसिस के प्रयोगात्मक मॉडल के प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं. सी. योनिशोथ albicans प्रेरित करने के अलावा, महिला कम जननांग पथ के नेइसेरिया gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis और हरपीज सिंप्लेक्स वायरस सहित अन्य रोगज़नक़ों द्वारा संक्रमण जहां जीवों intravaginally हार्मोन इलाज 1 चूहों में पेश कर रहे हैं माउस मॉडल का उपयोग कर अध्ययन किया गया है,7,10,22,26,35,38. इसलिए, तकनीक है कि Candida योनिशोथ शामिल अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं के लिए लागू किया जा सकता है और संभावित तरीके अग्रिम रोगजनन अध्ययन और महिला कम जननांग पथ के अन्य संक्रामक रोगों के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मेजबानी.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम AI32556 R01 (NIAID, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान) द्वारा समर्थित किया गया. यह काम भी लुइसियाना वैक्सीन संक्रामक रोग रीजेण्ट के लुइसियाना बोर्ड द्वारा प्रायोजित अनुसंधान के लिए केंद्र और दक्षिण लुइसियाना संस्थान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female CBA/J mice Charles River Laboratories 01C38 5-6 weeks of age
Candida albicans (3153A) National Collection of Pathogenic Fungi, UK NCPF3153
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547 D–s not need to be pre-sterilized before use
Β-estradiol 17-valerate Sigma-Aldrich E1631 0.1-0.5mg in sesame oil
Phytone peptone BD Biosciences 211906 Supplement with 0.1% glucose
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
Sabouraud dextrose agar BD Biosciences 211584
Collagenase type IV Sigma-Aldrich C5138 0.25%
Dispase Invitrogen 17105-041 1.7 U/ml
Wire mesh screens TWP 060X060S0065W36T No. 60 mesh, stainless
Hanks’ balanced salt solution Invitrogen 24020-117
CytoPrep fixative Fisher Scientific 12-570-10 Preserves smear slides
Papanicolaou stain EA-65 EMD Millipore 7054X-85
Papanicolaou stain OG-6 EMD Millipore 7052X-85
Harris’ Alum hematoxylin EMD Millipore 638A-85
Isoflurane Baxter Internationl Inc. NDC 10019-773-60 Used with isoflurane vaporizer or in a drop system closed anesthetic chamber

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References

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Yano, J., Fidel, Jr., P. L.… More

Yano, J., Fidel, Jr., P. L. Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis. J. Vis. Exp. (58), e3382, doi:10.3791/3382 (2011).

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