Summary
Principais técnicas a serem utilizados na avaliação de
Abstract
Vulvovaginal candidíase (VVC), causada por espécies de Candida, é uma infecção fúngica do trato genital feminino, que afeta aproximadamente 75% das mulheres saudáveis durante seus anos reprodutivos 18,32-34. Os fatores predisponentes incluem uso de antibióticos, diabetes descontrolado e perturbação nos níveis de hormônios reprodutivos devido à gravidez, contraceptivos orais ou terapias de reposição hormonal 33,34. VVC recorrente (RVVC), definida como três ou mais episódios por ano, afeta a 5 separada a 8% das mulheres sem fatores predisponentes 33.
Um modelo experimental de rato VVC foi estabelecida e utilizado para estudar a patogênese e resposta do hospedeiro mucosa a Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37. Este modelo também foi empregado para testar potenciais terapias antifúngicas in vivo 13,24. O modelo exige que os animais sejam mantidos em estado de pseudoestrus para optimal Candida colonização / infecção 6,14,23. Sob tais condições, animais inoculados terá carga fúngica vaginal detectável por semanas a meses. Estudos anteriores mostram um paralelo extremamente elevada entre o modelo animal e infecção humana em relação a propriedades imunológicas e fisiológicas 3,16,21. Diferenças, entretanto, incluem a falta de Candida como flora vaginal normal e um pH neutro vaginal nos ratos.
Aqui, nós demonstramos uma série de métodos-chave no modelo de mouse que vaginite incluem inoculação vaginal, rápida coleta de amostras vaginal, avaliação da carga fúngica vaginal, e as preparações para a extração do tecido celular / isolamento. Isto é seguido por resultados representativos para constituintes do lavado vaginal, carga fúngica, e drenagem linfática produz leucócitos nó. Com o uso de anestésicos, as amostras de lavagem podem ser coletados em momentos diversos na mesma camundongos para avaliação longitudinal dainfecção / colonização. Além disso, este modelo não necessita de agentes imunossupressores para iniciar a infecção, permitindo estudos imunológicos em condições host definido. Finalmente, o modelo e cada técnica introduzida aqui poderia potencialmente dar origem a utilização das metodologias para examinar outras doenças infecciosas do trato genital feminino (bacterianas, parasitárias, virais) e respectivas defesas do hospedeiro local ou sistêmica.
Protocol
1. Inoculação vaginal com Candida albicans
- Três dias antes da inoculação, enquanto prender o animal para expor o abdomen, injetar 100 ml de óleo de gergelim contendo 0,1-0,5 mg de β-estradiol por via subcutânea na parte inferior do abdômen. Antecedência a agulha cerca de 5 a 10 mm lateral à pele para minimizar a perda no local da injeção.
A administração subcutânea de estrogênio no abdômen inferior é ideal neste modelo devido à proximidade com o trato genital. Doses eficazes podem variar de acordo com linhagens de camundongos, idades ou derivados de estrógeno. Em estudos anteriores usando CBA-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 b), Balb / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) ratos em 6-8 semanas de idade, 0,1 mL mg/100 foi encontrado eficaz evidenciado pelo espessamento da parede vaginal, diminuição do muco vaginal eaumento da descamação das células epiteliais. Camundongos tratados com estrógeno acima nesta concentração exibem a colonização vaginal consistentes com Candida. Para inoculação em camundongos, de outras cepas e idades, um estudo piloto é recomendado para garantir a eficácia do estrogênio nas condições modificadas e aumentar a dose de estrogênio, se necessário.
A solução de estrogênio deve ser preparado de cada vez no dia da injeção. Para garantir a solubilidade total de estrogênio no óleo de gergelim, misturar a solução com um vortex e calor de forma intermitente a 37 ° C. Repetir a injecção semanal durante todo o período do estudo. - Para preparar o inóculo, adicione um loopful de C. albicans blastoconidia de uma preparação subcultura recentes Sabouraud-dextrose agar (SDA) em 10 ml de caldo de Phytone-peptona suplementado com glicose 0,1%. Incubar a cultura caldo de fase estacionária por 18 horas a 25 ° C em banho-maria a tremer.
- Após a incubação, recolher ªe cultura caldo em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar a 800 xg por 5 min. Lave o pellet duas vezes com PBS estéril.
- Enumerar blastoconidia viável em um hemocitômetro por exclusão corante azul de tripano. Ajustar a concentração celular de 2,5 x 10 6 ml / (ou a uma concentração de inóculo desejado) em PBS estéril.
- Para estabilizar o mouse, mantenha a base da cauda com dois dedos e levante o quadril para cima de modo que a abertura vaginal faces em sua direção (Figura 1A). O ideal é que o rato é colocado sobre uma superfície plana ralado (por exemplo, topo de gaiola) para que o mouse pode proporcionar resistência contra a restrição da cauda.
- Pipetar 20 mL (ou um volume desejado para não exceder 20 l) da suspensão de inóculo, inserindo a ponta da pipeta cerca de 5 mm de profundidade para dentro do lúmen vaginal (Figura 1B). Concluir esta etapa mais rápida e suavemente possível para minimizar o sofrimento do mouse.
2. Lavagens vaginais
- Eutanásia seguinte (ou anestesia), ho velho rato para baixo pela base da cauda com dois dedos de modo que a abertura vaginal fica exposta.
- A lavagem do lúmen vaginal através da introdução de 100 ul de PBS estéril com aspiração repetida e agitação com uma ponteira. A ponta da pipeta pode ficar entupido com as células. Se isso ocorrer, dispensar as células e continuar obstruindo lavaging com PBS restante na vagina. Recolher o lavado em um tubo de microcentrífuga.
- Em alternativa, lavagem vaginal pode ser realizado em ratos anestesiados com anestesia inalatória de isoflurano. Para isso, expor os ratos para vaporizado isoflurano até que estejam completamente sedados (~ 30 seg.). Segure os ratos para baixo pela base da cauda e gentilmente lavagem do lúmen vaginal utilizando 50 mL de PBS estéril. Certifique-se evitar a agitação dura com uma ponteira para minimizar o trauma da vagina durante este procedimento. Camundongos sedado deve se recuperar da anestesia dentro de 30 segundos de exposição ao ar ambiente.
Isofluranopode ser vaporizado utilizando um vaporizador de isoflurano e O 2 (preferencial) ou um sistema de queda norma fechada câmara de anestésico sem que o sistema vaporizador (requer acompanhamento de perto do animal, enquanto sedado para evitar problemas respiratórios).
Lavagens vaginais em ratos anestesiados deve ser o método de escolha para amostras de lavagem longitudinal sobre os ratos mesmo. Lavaging consecutivas não influencia a avaliação da carga de fungos ao longo do tempo 41.
- Para wet-mount preparações, a transferência de 10 ml do lavado numa lâmina de vidro e observar com ampliação de 1000x 400 por microscopia de luz. Além disso, as frações celulares do lavado pode ser manchado para examinar células e morfologias nuclear. Para as preparações de esfregaço, de transferência de 10 ml do lavado numa lâmina de vidro e gentilmente se espalhar usando a parede exterior de uma ponta da pipeta. Preservar as amostras de esfregaço com fixador CytoPrep e mancha pela técnica de Papanicolaou padrão (exame de Papanicolaou). Observe a 400 × ampliação por microscopia de luz.
3. Quantificação da carga fúngica vaginal
- Em uma placa de 96 poços de fundo redondo, transferir o lavado em um poço da linha superior e 180 mL de PBS estéril nas seguintes 5 poços dessa coluna (para baixo da placa).
- Faça 01:10 diluições em série de lavado vaginal, transferindo a 20 mL do fluido para o bem próxima na coluna. Misturar bem por aspiração repetida antes de cada transferência. Diluições em série de até 12 amostras de lavagem (uma linha horizontal completa) podem ser realizadas simultaneamente, utilizando uma pipeta de 12 canais.
- Começando com a menor diluição, transferir 10 ml da amostra em Sabouraud-dextrose agar (SDA). Chapeamento de até 36 amostras podem ser realizadas em uma placa usando SDA preparada em pratos de petri com grade quadrada e uma pipeta multicanal ajustável espaçamento.
- Enumerar unidades formadoras de colônia (UFC), após incubação a 34 ° C fou 48 h.
4. Extração de tecido vaginal
- Seguindo o procedimento vaginal lavagem, coloque o mouse sacrificados em suas costas e saturar a área da virilha com etanol 70%. Usando um par de fórceps, levante o orifício urinário para cima de modo que a abertura vaginal fica exposta.
- Inserir um par de fórceps curvado para dentro do lúmen vaginal e localizar o colo do útero. Mantendo uma pegada firme com o fórceps, extrair o colo do útero através da cavidade vaginal (Figura 2A-C).
- Vagina da Excise na base da abertura vaginal e, em seguida, remover o colo da vagina com uma tesoura cirúrgica. Tenha em mente que o tecido vaginal é involuído (interior epitélio lado da vagina é exposta para fora). O tecido pode ser invertida lateralmente para manter a orientação original da vagina ou aberto em uma folha, fazendo uma incisão lateral.
Excisadas tecidos vaginais pode ser usado para: 1) colagem após a extração de linfócitosnase digestão (~ 1 × 10 4 mouse /) 40, 2) das células epiteliais isolamento digestão dispase seguinte (~ 5 do mouse × 10 4 /) 28, 3) preparações congeladas ou parafina para análise histológica 25.
5. Excisão do nó de linfa lombar
- Seguindo o procedimento vaginal lavagem, coloque o mouse sacrificados em suas costas e saturar o abdômen com etanol 70%. Faça uma incisão lateral a partir da parte inferior do abdome para o tórax e expor os órgãos internos. Usando um par de fórceps em ambas as mãos, mover os intestinos para cima de modo que os vasos sanguíneos centrais tornam-se visíveis.
- Localizar a veia cava inferior e aorta abdominal. Normalmente, um par de gânglios linfáticos lombares podem ser identificadas adjacentes à aorta abdominal, localizado a meio caminho entre a origem das artérias ilíacas comuns renal e 39. Estes gânglios linfáticos podem ser visualmente diferenciado de tecido adiposo pela textura elásticae são mais leves e mais opaca na cor em relação ao tecido gorduroso (Figura 3). Estes linfonodos são visivelmente maior nos animais infectados em comparação com animais não inoculadas.
- Especiais de consumo os gânglios linfáticos, colocando micropinças sob o nó e, em seguida, puxar para cima com cuidado para separar tecido circundante.
6. Isolamento de células linfóides em uma única célula suspensões
- Transferência dos gânglios linfáticos em uma tela de arame de malha estéril (aproximadamente 3 x 3 cm 2 de tamanho) colocado dentro de um prato de vidro estéril petri contendo ~ 10 ml de solução de Hanks salina balanceada (HBSS) (Figura 4).
- Com a placa de Petri ligeiramente inclinado, pressione os linfonodos contra a tela com uma cabeça de êmbolo da seringa. Certifique-se de quebrar todos os linfonodos para que o conteúdo celular de nós passar pela tela enquanto os componentes não-celulares dos gânglios (ou seja, membranas, estroma, tecido adiposo) permanecem na tela.
- Usando o êmbolo e seringa mesmo, aspirado tele HBSS contendo células. Lavar a tela com HBSS ~ 5 ml e recolher o líquido restante em um tubo de 15 ml.
- Centrifugar a 800 xg por 10 min. Aspirar qualquer depósitos de gordura na parte superior do líquido com uma pipeta antes de descartar o líquido. Lave o pellet celular três vezes com HBSS. Ressuspender o sedimento em 1 ml de HBSS e enumerar células viáveis por exclusão corante azul de tripano.
7. Resultados representativos:
As frações celulares do lavado vaginal de> 4 dias de camundongos inoculados tipicamente consistem de Candida, células epiteliais e infiltração celular (Figura 5). Por wet-mount microscopia, Candida podem ser identificados visualmente pela presença de hifas, bem como levedura (Figura 5A). Preparados esfregaços de lavado vaginal pode ser manchado pela técnica de Papanicolaou para examinar células epiteliais e leucócitos infiltrantes, das quais as principais células são neutrófilos identificado pelo tri-nuclelobos ar (Figura 5B). Neutrófilos muito poucos, se houver, são detectados em ratos não inoculadas (Figura 5C) 41.
Um exemplo de carga fúngica vaginal é mostrado na Figura 6. Lavado vaginal coletadas em momentos específicos são cultivadas por CFU enumeração (Figura 6A). Colonização vaginal / infecção por Candida persiste por semanas em estrogênio tratados com camundongos inoculados (Figura 6B), enquanto Candida não consegue estabelecer a colonização vaginal não-tratadas com estrogênio camundongos inoculados (Figura 6C). Camundongos tratados com estrógeno não inoculadas permanecem negativos para Candida ao longo do tempo (dados não mostrados). Além disso, lavagens vaginais pode ser realizada uma única vez em ratos separados em cada momento ou longitudinalmente em camundongos mesmo sob anestesia.
Os linfonodos lombares são os principais linfonodos de drenagem do trato genital e do site mais relevante para avaliar a resposta imune sistêmica a um desafio vaginal. Note que esses nódulos linfáticos podem tornar-se ampliado em camundongos inoculados, enquanto eles normalmente aparecem muito pequenas não inoculado em camundongos. Leucócitos recuperações celular normalmente variam de 8 × 10 do mouse 5 / não inoculadas a 5 × 10 do mouse 6 / inoculados. Além de gânglios linfáticos lombares, linfonodos inguinais, poplíteos e mesentérica também pode ser usado.
Figura 1. Inoculação vaginal com Candida. A) Um rato restringido para inoculação. O rato é colocado em uma gaiola de arame e inserção realizada pela base da cauda, ligeiramente para cima para levantar as pernas e expor a abertura vaginal. O quadril do mouse pode ser estabilizado com a mesma mão ao tentar resistir à contenção da cauda. B) Introdução do inóculo para o lúmen vaginal. A ponteira é gentilmente inserido cerca de 5 mm de profundidade para dentro do lúmen vaginal. O inóculo de suspensão é então depositado.
Figura 2. Extração de tecido vaginal. AB Extraction) do colo do útero. O colo do útero está localizado com uma pinça curva e exposto para fora através da cavidade vaginal. Uma vez fora da cavidade vaginal, o colo do útero é ainda mais puxado para fora, para expor completamente a vagina. C) Extração da vagina. A vagina é retirado da vulva com uma tesoura. Uma vez desligada, remova o colo da vagina.
Figura 3. Identificação dos linfonodos lombares. A localização dos gânglios linfáticos lombares entre os órgãos circunvizinhos / vasos sanguíneos nas imediações da pelve é indicado. A aorta abdominal. B, bexiga urinária. C, artéria ilíaca comum. I, intestinos. L, o fígado. R, reto. S, baço. U, Útero.
Figura 4. Os linfonodos lombares colocado em uma tela de malha de arame. Os linfonodos são agrupados na tela colocada numa placa de Petri com HBSS. Os linfonodos são pressionados contra a tela com um êmbolo da seringa para obter células linfóides em uma única célula suspensões.
Figura 5. Frações celulares do lavado vaginal de camundongos inoculados. Preparações A) Wet-mount e B) colpocitológico vaginal amostras coletadas lavagem quatro dias após a inoculação e C) de ratos não inoculadas. Imagens são mostradas em 1000 × (A) ou 400 × (B, C) de ampliação. A inserção na B mostra a morfologia nuclear de neutrófilos vaginal em 1000 ×. Candida levedura (Y) e hifas (H), células epiteliais (CE) e neutrohils (N) são indicados.
Figura 6. Detectíon de carga fúngica vaginal. A) colônias Representante C. albicans cultivadas em uma placa de SDA. Amostras puras (N) lavagem de seis diferentes camundongos inoculados (linha superior) foram diluídas em série e cultivadas para a enumeração UFC. B) Quantificação da carga fúngica vaginal de estrogênio-tratados e C) não-estrogênio camundongos tratados. Ufc/100 mL do lavado de camundongos inoculados foi avaliada em pontos de tempo indicado.
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Discussion
Um modelo experimental do rato de Candida vaginite foi estabelecida e usada historicamente para as últimas décadas para estudar a resposta do hospedeiro mucosa a Candida, bem como para testar terapias antifúngicas 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. Os protocolos aqui apresentados incorporam métodos eficientes e menos trabalhoso, e parecem ser um dos sistemas de modelo mais otimizada de Candida vaginite descritas até o momento. Estas técnicas permitem a quantificação rápida da carga fúngica e recolha de amostras vaginais. Além disso, estudos anteriores testando várias cepas haplotypic de camundongos (n = 13) e vários pontos do tempo pós-inoculação mostrou a níveis similares de variabilidade na carga fúngica e resposta do hospedeiro à colonização vaginal por Candida 2,6,41. Assim, este modelo pode ser adaptado aos protocolos existentes, sem restrição de cepas do mouse ou a duração da infecção. No entanto, deve-se reconhecer que avariabilidade na carga fúngica vaginal pode ser alto entre os animais que receberam o inóculo mesmos (Figura 6B). Não há provas de que a variabilidade ocorre devido a diferentes graus de adesão inicial ao epitélio vaginal 41. Portanto, os ratos 10/07 / grupo é sugerido para fins estatísticos.
Variabilidade na carga fúngica vaginal também foi evidenciado entre as diferentes estirpes de C. albicans, sugerindo que nem todas as cepas de C. albicans têm a capacidade de colonizar a vagina da mesma forma mouse. Por exemplo, C. albicans 3153A (cepa de laboratório) utilizados neste protocolo tem sido relatada a mostrar maior colonização vaginal que SC5314 (isolado clínico), onde uma maior inóculo (> log um) seriam necessários para obter níveis equivalentes de carga fúngica vaginal visto com 3153A 27. Na verdade, uma colonização altamente variável vaginal com vários isolados clínicos tem sido documentada 36. Assim, cuidados devem ser taken ao determinar um inóculo ideal para cada C. albicans esforço para assegurar a colonização consistente em camundongos. Normalmente, a média de UFC que variam de 5 x 10 4 a 5 x 10 5 / 100 mL lavado devem ser detectados para a colonização consistente. Para avaliação da carga fúngica vaginal, quantificação de UFC por lavagens é apropriado para este modelo como Candida blastoconidia hifas e normalmente não penetram além da camada superficial do epitélio vaginal. Nossa avaliação anterior histológica de pós-lavagem tecidos vaginal raramente mostraram Candida residual 25,41. No entanto, reconhecemos a possibilidade de que hifas podem ser erradamente calculadas como eles crescem como uma única colônia na placa de agar e podem não refletir a carga fúngica precisas. Como um método alternativo para CFU enumeração, um recém-desenvolvido in vivo técnica de imagem tem sido relatada com sucesso avaliar a carga fúngica vaginal quando se utiliza geneticamente luminescentes C. albicans 9,29. Além disso, o protocolo pode ser modificado para induzir C. glabrata colonização em animais diabéticos 15,20. Até à data, os modelos de mouse para vaginite não-C. Albicans induzida por outra não têm sido relatados.
Administração de estrogênio é crítica para este modelo, iniciando a colonização vaginal Candida robusta, com 6,14,23. Além da injeção subcutânea de injeção de estradiol em suspensão de óleo de gergelim, de solúveis em água, implantação de estradiol no PBS e intradérmica de uma liberação controlada-pellet estradiol são métodos alternativos para a administração de estrogênio e têm sido empregadas em modelos de ratos fêmeas de outras infecções do trato genital 10 , 35. Exigência de estrogênio elevado neste modelo pode ser explicado por dois fatores fisiológicos. Uma delas é que de estrógeno promove a estratificação do epitélio vaginal 5,8,30. Epitélio espessado da proliferação de células epiteliais aumentou podem todosCandida ow para obter melhor aderência da parede vaginal posterior e da colonização. Em segundo lugar, células epiteliais vaginais são conhecidos por ter conteúdo de glicogênio elevados. Um aumento resultados tecido nível de estrogênio na deposição de glicogênio nas paredes vaginal 30. Glicogênio elevados no microambiente vaginal pode, por sua vez permitem Candida a florescer, fornecendo nutrientes adicionais. Análises anteriores mostraram que o estrogênio imunológico exógenas não afetou a expressão de moléculas de adesão celular 40. Uma desvantagem de tratar os animais com estrogênio exógeno é que o estrogênio elevado também tem sido conhecida por promover o crescimento excessivo da flora vaginal comensais 30. Dado que a composição da flora podem variar significativamente entre os animais, isso pode adicionar uma variável onde os organismos comensais podem influenciar o crescimento Candida ou modular as respostas host. Em consideração a esta questão, o modelo requer estrogênio tratados com o controle (não inoculadas) Os animais a serem incluídos notodos os experimentos e analisados em paralelo.
Neste modelo mouse, a eficácia de anti-fúngicos agentes podem ser avaliados com precisão pelos protocolos aqui descritos, que podem fornecer crucial em testes in vivo, levando ao desenvolvimento de terapias potenciais para uso clínico. Na verdade, a natureza robusta do modelo fornece boas indicações da eficácia clínica. Além do uso de estrogênio, pH vaginal neutro em ratos promove o crescimento de hifas, uma forma patogénica de Candida visto em todos os camundongos inoculados. Semelhante a observações clínicas, a migração de neutrófilos robusta vaginal ocorre em um subconjunto de ratos sem afetar a carga fúngica 31,41. A presença de neutrófilos é proeminente em mulheres durante a vaginite sintomática e parece ratos após inoculação paralela 12,41. Uma vez que outros sintomas clínicos (ou seja, coceira, inchaço) não pode ser medido precisamente em camundongos, a avaliação de neutrófilos vaginalserve como uma indicação simples, mas confiável de inflamação (sintomas) neste modelo.
A microscopia do fluido vaginal lavagem mostrado na Figura 5 é realizada rotineiramente em nosso laboratório para avaliar a colonização de Candida e inflamação vaginal. Além disso, marcando hifas pode também ser usado como uma medida de infecção. Posteriormente, as frações celulares e solúveis do lavado pode ser preservada e crio-arquivados para futuras análises. De nota, uma característica vantajosa do protocolo é que lavagens vaginais podem ser realizados longitudinalmente nos ratos mesmo sob anestesia. Nossos estudos anteriores confirmaram que a avaliação longitudinal não influencia a avaliação de carga fúngica vaginal. Esta abordagem é particularmente vantajoso nos casos em que análises longitudinais de infecção são desejados.
Finalmente, nós desenvolvemos um método de excisão menos invasivas para a vagina. Esta técnica eficaz e rápida não requer incisão noo abdômen ou qualquer órgãos internos, deixando o resto do trato genital intacta. Outra característica útil deste modelo é a falta de exigência de agentes imunossupressores para iniciar a colonização de Candida. Isto é particularmente importante porque a manutenção do estado imunológico do hospedeiro natural de é um aspecto crítico dos estudos imunológicos e resposta do hospedeiro a um desafio microbiano. Assim, tecidos e células isoladas por esses métodos poderiam ser aplicados em vários ensaios in vitro imunológico.
Em conclusão, nós fornecemos várias características importantes e resultados representativos do modelo experimental de candidíase vaginal. Além de C. albicans induzida por vaginite, infecções por outros patógenos do trato genital feminino, incluindo Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis e vírus Herpes simplex, foram estudados utilizando modelos de ratos onde os organismos estão intravaginal introduzido em camundongos tratados com hormônio 1,7,10,22,26,35,38. Portanto, as técnicas que são úteis para estudos envolvendo Candida vaginite pode ser aplicado a avançar e, potencialmente, metodologias para estudar patogenia e resposta imune do hospedeiro para outras doenças infecciosas do trato genital feminino.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo R01 AI32556 (NIAID, National Institute of Health). Este trabalho também foi apoiado em parte pela Louisiana Vaccine Center e Louisiana do Sul Instituto de Pesquisas de Doenças Infecciosas patrocinado pelo Conselho de Regentes Louisiana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female CBA/J mice | Charles River Laboratories | 01C38 | 5-6 weeks of age |
| Candida albicans (3153A) | National Collection of Pathogenic Fungi, UK | NCPF3153 | |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547 | D–s not need to be pre-sterilized before use |
| Β-estradiol 17-valerate | Sigma-Aldrich | E1631 | 0.1-0.5mg in sesame oil |
| Phytone peptone | BD Biosciences | 211906 | Supplement with 0.1% glucose |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Sabouraud dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | |
| Collagenase type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | 0.25% |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 1.7 U/ml |
| Wire mesh screens | TWP | 060X060S0065W36T | No. 60 mesh, stainless |
| Hanks’ balanced salt solution | Invitrogen | 24020-117 | |
| CytoPrep fixative | Fisher Scientific | 12-570-10 | Preserves smear slides |
| Papanicolaou stain EA-65 | EMD Millipore | 7054X-85 | |
| Papanicolaou stain OG-6 | EMD Millipore | 7052X-85 | |
| Harris’ Alum hematoxylin | EMD Millipore | 638A-85 | |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | Used with isoflurane vaporizer or in a drop system closed anesthetic chamber |
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