Summary
В этой статье описывается nanoprecipitation метод синтеза полимерной основе наночастиц использованием диблок сополимеров. Мы будем обсуждать синтез диблок сополимеров, nanoprecipitation техники и потенциальных применений.
Abstract
Нанотехнология представляет собой относительно новую отрасль науки, которая включает в себя освоение уникальных свойств частиц, которые нанометров в масштабе (наночастиц). Наночастицы могут быть разработаны в точном моды, где их размер, состав и химии поверхности могут быть тщательно контролироваться. Это дает беспрецедентную свободу изменить некоторые из фундаментальных свойств их грузов, таких как растворимость, коэффициент диффузии, биораспределения, отпустите характеристики и иммуногенности. С момента своего создания, наночастицы были использованы во многих областях науки и медицины, в том числе доставки лекарственных средств, работы с изображениями, и клеточной биологии 1-4. Тем не менее, она не была полностью использована за пределами "нанотехнологии лаборатории" из-за воспринимается технический барьер. В этой статье мы опишем простой метод синтеза полимера платформа на базе наночастиц, которая имеет широкий диапазон потенциального применения.
Первым шагом будет синтезировать диблок сополимера, который имеет как гидрофобные и гидрофильные домена домен. Использование PLGA и ПЭГ в качестве модельных полимеров, мы описали сопряжения реакции с помощью EDC / NHS химии 5 (рис. 1). Мы также обсуждаем процесс очистки полимера. Синтезированных диблок сополимера может самостоятельно собираться в наночастиц в nanoprecipitation процесс, посредством гидрофобно-гидрофильных взаимодействий.
Описанные полимер наночастицы, является очень гибким. Гидрофобной основе наночастиц могут быть использованы для выполнения плохо растворимые препараты для доставки лекарств experiments6. Кроме того, наночастицы могут преодолеть проблему токсичных растворителей для малорастворимых молекулярной биологии реагенты, такие как вортманнином, которая требует как растворитель ДМСО. Тем не менее, ДМСО могут быть токсичными для клеток и препятствуют эксперимента. Эти малорастворимых препаратов и реагентов могут быть эффективно доставляются с использованием полимерных наночастиц с минимальной токсичностью. Полимерные наночастицы также могут быть загружены с флуоресцентной краской и использовались для исследования внутриклеточных торговли людьми. Наконец, эти полимер наночастицы могут быть сопряженными с таргетинга лигандов через поверхность ПЭГ. Такие целевые наночастиц могут быть использованы для обозначения конкретных эпитопов на или в клетках 7-10.
Protocol
1. Синтез PLGA-б-ПЭГ полимера
- Поли (D, L-лактид-со-гликолида) (PLGA) с терминала карбоксилатных групп (PLGA-карбоновой кислоты) растворяется в любом растворителе для PLGA (как уже упоминалось в разделе материалы) в концентрации 5 мМ. PLGA может быть расторгнут при этой концентрации при осторожном перемешивании.
- Оба NHS (молекулярный вес 115,09) и EDC (молекулярный вес 191,7) растворяли в решении PLGA в концентрации 25 мМ. (Оба EDC и NHS добавляются в стехиометрическом более 5 раз по сравнению с PLGA). PLGA-карбоновой кислоты превращается в PLGA-NHS, добавив EDC и НГС PLGA-карбоновой кислоты раствор при осторожном перемешивании в течение 1 часа.
- Продукт реакции PLGA-NHS осаждают путем добавления моющего раствора метанола. Примерно в 10 раз объема избыточного метанола добавляют раствор. Решение центрифугируют при 2000 мкг выделяться PLGA-NHS и отбросить супернатант (удаляет следы EDC и NHS. Эта процедура промывки метанолом повторяется по крайней мере три раза.
- PLGA-NHS гранулы сушат в вакууме в течение 30 минут, чтобы удалить все следы моющего раствора.
- PLGA-NHS гранул теперь снова растворяли в том же растворителе при той же концентрации, которая была использована сначала распустить PLGA. Гетеробифункциональных ПЭГ (амин-ПЭГ-карбоновой кислоты), затем добавляют в раствор PLGA в концентрации 5 мМ (стехиометрическом соотношении 1:1). Раствор смеси инкубировали в течение 24 часов при постоянном перемешивании.
- После 24 часов, продукт реакции PLGA-б-ПЭГ блок-сополимер осаждается путем добавления моющего раствора метанола в избытке. Повторите промывку и центрифугирования процесс, как упоминалось выше в три раза. Это позволит удалить все лишние непрореагировавшего ПЭГ.
- PLGA-б-ПЭГ блок-сополимер сушат под вакуумом.
2. PLGA-б-ПЭГ наночастиц подготовки
Наночастицы с PLGA основной покрытые PEG на поверхности может быть подготовлен с этими диблок сополимеров. Различные гидрофобные препараты могут быть заключены в таких наночастиц. Флуоресцентные соединения могут быть заключены в наночастицах или может быть сопряжено с PLGA и, следовательно, эти наночастицы могут быть использованы для флуоресценции.
Nanoprecipitation метод используется для изготовления наночастиц особенно когда желаемое груза быть воплощен очень гидрофобные в природе.
- PLGA-б-ПЭГ блок-сополимера и наркотиков / груза (необходимо инкапсулировать) растворяются в любой растворитель, который растворяет PLGA. PLGA может быть расторгнут многих распространенных растворителей, в том числе ацетонитрил, DCM, тетрагидрофуран, ацетон или этилацетат. Выбор растворителя имеет решающее значение, как это влияет на свойства наночастиц. Таким образом, соответствующий растворитель следует использовать на этом этапе.
- Полимер / лекарство смесь затем добавляют по каплям до 3-5 объемов перемешивание воды дает конечную концентрацию полимера составляет около 3 мг / мл. (Рис. 2)
- Перемешивание продолжают в течение 2 часов при пониженном давлении, чтобы наночастицы формировать путем самосборки и удалить следы органического растворителя.
- Сбор и очистка: наночастицы затем концентрируют центрифугированием при 2700 х г в течение 10 мин с использованием Amicon фильтр (MWCO 20KDa), промывают и воссоздана в PBS. При этом удаляются все не-захваченных наркотиков / груза. Основные биофизические характеристики, такие как размер, поверхностный заряд, и эффективность препарата загрузки могут быть выполнены, чтобы лучше понять свойства наночастиц.
3. Хранение
Freeze-сушка часто используемый метод для хранения наночастиц 11. Freeze-сушки сохранит физические и химические характеристики наночастиц для долгосрочной стабильности 12. Сублимационной сушки процесс может вызвать напряжение на частицы и дестабилизировать разработке, так крио-защитные (защита от замерзания стресс), и Лио-защитные (защита от высыхания стресс) обычно используются. Выбор этих средств защиты определяется желаемой длины временного хранения 13.
- В сублимационной сушки, есть общая затвердевание образца при замораживании ниже Tg.
- В стадии сушки, лед удаляют возгонкой. Температура и давление должны быть оптимизированы для достижения эффективной сублимационной сушки.
4. Представитель результаты:
Характеристика PLGA-б-ПЭГ Ди-блок-сополимер
Различные методы могут быть использованы для подтверждения успешного сопряжения полимеров. Состав PLGA-б-ПЭГ могут быть охарактеризованы с помощью 400 МГц 1H ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Молекулярная масса образовавшегося продукта (PLGA-б-ПЭГ) может быть проверена путем гель-проникающей хроматографии (ГПХ). PLGA-б - PEG молекулярной массой distributioя кривой и времени элюирования должна отличаться от PLGA и ПЭГ в одиночку. В сочетании, эти методы должны характеризовать формируется продукт, и для определения реакции конъюгации была успешной.
Характеристика PLGA-б-ПЭГ наночастиц
Размер частиц и распределение по размерам может быть измерен динамического рассеяния света. Различные параметры в nanoprecipitation процесс влияет на размер частиц. Молекулярный вес полимеров, используемых изначально (как PLGA и ПЭГ) и эффект распределения частиц по размерам. Переход электронной микроскопии (ПЭМ) также могут быть использованы для подтверждения распределения размеров и структуры наночастиц, как показано на рисунке 3. Диапазон размеров частиц, как правило, в нм. Большие размеры частиц с неравномерным распределением по размерам может свидетельствовать либо ошибки в реакции конъюгации или nanoprecipitation метод нуждается в оптимизации. Кроме того, поверхность потенциальной дзета можно измерить с помощью ZetaPALS.
Наркотиков / погрузки эффективность может быть определена количественно со стандартными ВЭЖХ.
Частицы растворенного в органическом растворителе и ВЭЖХ может быть выполнена для измерения поглощения наркотиков / груза (рис. 4). Высвобождения лекарства кинетические исследования можно сделать, если они известны фиксированные количества наночастиц диализу в 30 Слайд-A-Lyzer единиц MINI диализа. В определенные промежутки времени, содержание в диализа собирается и равный объем органического растворителя добавляют распустить наночастиц. ВЭЖХ выполняется на этих образцах количественно наркотиков / груза содержания.
Рисунок 1. EDC / NHS химии
Рисунок 2. Nanoprecipitation способ получения полимерных наночастиц. Органический раствор растворитель (ацетонитрил или DCM), содержащих ПЭГ-PLGA диблок и наркотиков или груза для загрузки в частицы добавляют по каплям к 3-5 мл помешивая H 2 O.
Рисунок 3. Просвечивающей электронной микроскопии nanopartices. ПЭМ-изображение ПЭГ-содержащих наночастицы PLGA wortamin. Фосфорно-вольфрамовой кислоты был использован в качестве контрастного вещества.
Рисунок 4. Контролируемое высвобождение лекарства из наночастиц. Выпуск Паклитаксел из наночастиц после диализа в PBS. В то время отметил, частиц были сняты с диализом кассет и solublized в ацетонитриле. Решение было измерено с помощью ВЭЖХ. Две отдельные партии наночастиц были сопоставлены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanoprecipitation метод с использованием диблок сополимеров представляет простой, быстрый метод для проектирования полимерных наночастиц. В результате наночастицы состоят из гидрофобного ядра, которые могут быть использованы для доставки плохо растворимые соединения. Гидрофильные поверхности слоя позволяет отличную растворимость в воде, обеспечивая при этом фрагменте для возможного дальнейшего сопряжения для ориентации лиганда.
Есть много платформ наночастиц, в том числе липосомы, полимерные наночастицы, дендримеров, металлических частиц и квантовых точек 14. Среди этих платформ, полимерные наночастицы платформы одна из самых легких по разработке и наиболее универсальным с точки зрения приложений. Он требует минимальной настройки оборудования и техники можно научиться за несколько часов. Она также имеет широкий спектр применения и его биосовместимость позволяет как в пробирке и в естественных приложений. Его способность нести груз позволяет изображений и терапевтических возможностей.
EDC / NHS химии представлена здесь для получения диблок сополимера. Тем не менее, блок-сополимеры могут быть синтезированы с использованием различных катализаторов. Другой широко используется катализатор олова октоат. Концевые гидроксильные группы ПЭГ используются в качестве инициативных групп для синтеза блок-сополимеров. Кольцо полимеризации лактида и гликолида инициирован дигидрокси ПЭГ или monomethoxy ПЭГ может привести к ABA или АВ типа блок-сополимеров соответственно 15. Этот метод подготовки дает большую гибкость в разработке, однако EDC / NHS химии проще в использовании и позволяет сэкономить время с помощью коммерчески доступных PLGA полимера.
В дополнение к nanoprecipitation, другие методы для генерации диблок полимерных наночастиц могут быть использованы. Распространенной альтернативой является "масло в воде" эмульсии методом 16. Эмульсии методом снова начинается с органической фазы, содержащей сополимер диблок и водной фазы. Однако, при смешивании двух растворов, наночастицы образуются через вортексе и sonicating. Этот метод очень похож, но nanoprecipitaion метод позволяет больше контроля в стадии смешивания, а также позволяет избежать использования ультразвука.
Есть много потенциальных приложений для этой платформы. Во-первых, она может быть использована для доставки гидрофобных / плохо растворимые препараты в исследованиях доставки лекарств. Например, таксаны плохо растворимы и требуют растворителя для прижизненного исследования. Полимерные наночастицы могут инкапсулировать таксана наркотиков и отменить необходимость растворителей. Наночастицы могут также доставить ячейки реагентов биологии, которые плохо растворимы, например, вортманнином. Полимерные наночастицы также могут быть загружены с флуоресцентной краской и использовались для исследования внутриклеточных торговли людьми. Эти полимерные наночастицы могут быть сопряженными с таргетинга лигандов через поверхность ПЭГ. В сочетании с флуоресцентной маркировки, эти целевые наночастиц могут быть использованы для обозначения конкретных эпитопов на или в клетках. Так как каждый наночастицы могут инкапсулировать большое количество флуоресцентных молекул, наночастицы могут улучшить чувствительность таких биологических исследований. Флуоресцентные помечены наночастиц могут быть использованы также для прижизненного изображения, такие как визуализация кровеносных сосудов и атеросклеротических бляшек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Игроки по борьбе с раком, Каролина Центр нанотехнологий совершенства Pilot грант, университет онкологический научный фонд и Национальный институт здоровья К-12 по развитию карьеры Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
- Drotleffa, S., Lungwitz, U., Breuniga, M., Dennis, A., Blunk, T., Tessmarc, J., Goëpferich, A. Biomimetic polymers in pharmaceutical and biomedical sciences. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 58, 385-407 (2004).
- Bulte, J. W. M. Nanoparticles in Biomedical Imaging. 3, (2008).
- Omid, C., Farokhzad, R. L. Impact of Nanotechnology on Drug Delivery. ACS NANO. 3, 16-20 (2009).
- Li, Y. -P., Pei, Y. -Y., Xian-Ying, Z., Zhou-Hui, G., Zhao-Hui, Z., Wei-Fang, Y., Jian-Jun, Z., Jian-Hua, Z., Xiu-Jian, G. PEGylated PLGA nanoparticles as protein carriers: synthesis, preparation and biodistribution in rats. Journal of Controlled Release. 71, 203-211 (2011).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , 2nd Edition, (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Lee, D. S., Kim, S. W. Biodegradable block copolymers as injectable drug-delivery systems. Nature. 388, 860-862 (1997).
- Yoo, H. S., Park, T. G. Folate receptor targeted biodegradable polymeric doxorubicin micelles. Journal of Controlled Release. 96, 273-283 (2004).
- Cheng, J., Teply, B. A., Sherifi, I., Sung, J., Luther, G., Gu, F. X., Levy-Nissenbaum, E., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles for In Vivo Targeted Drug Delivery. Biomaterials. 28, 869-876 (2007).
- Gu, F., Zhang, L. F., Teply, B. A., Mann, N., Wang, A., Radovic-Moreno, A. F., Langer, R., Farokhzad, O. C. Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. Proceedings of the National Academy of Science. 105, 2586-2591 (2008).
- Sanna, V., Pintus, G., Roggio, A. M., Punzoni, A., Posadino, A. M., Arca, A., Marceddu, S., Bandiera, P., Uzzau, S., Sechi, M. Targeted Biocompatible Nanoparticles for the Delivery of (-)-Epigallocatechin 3-Gallate to Prostate Cancer Cells. J. Med. Chem. 54, 1321-1332 (2011).
- Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58, 1688-1713 (2006).
- Holzer, M., Vogel, V., Mäntele, W., Schwartz, D., Haase, W., Langer, K. Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying and storage. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 428-437 (2009).
- Lee, M. K., Kim, M. Y., Kim, S., Lee, J. Cryoprotectants for Freeze Drying of Drug Nano-Suspensions: Effect of Freezing Rate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98, 4808-4817 (2009).
- Wang, A. Z. Biofunctionalized targeted nanoparticles for therapeutic applications. Expert opinion on biological therapy. 8, 1063-1070 (2008).
- Jeong, B., Bae, Y. H., Kim, S. W. Drug release from biodegradable injectable thermosensitive hydrogel of PEG-PLGA-PEG triblock copolymers. J. Control Release. 63, 155-163 (2000).
- Gref, R.
