Summary
Questo articolo descrive un metodo per sintetizzare nanoprecipitation polimero a base di nanoparticelle utilizzando diblock co-polimeri. Discuteremo la sintesi di copolimeri diblock, la tecnica nanoprecipitation e potenziali applicazioni.
Abstract
La nanotecnologia è una branca relativamente nuova della scienza che coinvolge sfruttando le proprietà uniche di particelle che sono nanometri di scala (nanoparticelle). Le nanoparticelle possono essere progettate in modo preciso in cui la loro chimica dimensione, composizione e superficie può essere attentamente controllato. Ciò permette una libertà senza precedenti di modificare alcune delle proprietà fondamentali del loro carico, come ad esempio la solubilità, diffusività, distribuzione biologica, caratteristiche di rilascio e l'immunogenicità. Fin dalla loro creazione, le nanoparticelle sono stati utilizzati in molti settori della scienza e della medicina, tra cui la somministrazione di farmaci, l'imaging, e la biologia delle cellule 1-4. Tuttavia, non è stato utilizzato completamente al di fuori dei "laboratori di nanotecnologia" a causa della percezione ostacolo tecnico. In questo articolo, si descrive un metodo semplice per sintetizzare una piattaforma basata nanoparticella polimerica che ha una vasta gamma di applicazioni potenziali.
Il primo passo è quello di sintetizzare un diblock co-polimero che ha sia un dominio idrofobico e il dominio idrofilo. Utilizzando PLGA e PEG come polimeri modello, abbiamo descritto una reazione di coniugazione con EDC / NHS chimica 5 (Fig. 1). Discutiamo anche il processo di purificazione del polimero. Il diblock sintetizzato co-polimero può auto-assemblano in nanoparticelle nel processo nanoprecipitation attraverso interazioni idrofobiche-idrofilo.
La nanoparticella polimerica descritto è molto versatile. Il nucleo idrofobico della nanoparticella può essere utilizzato per trasportare farmaci a bassa solubilità per la somministrazione di farmaci experiments6. Inoltre, le nanoparticelle possono superare il problema di solventi tossici per scarsamente solubili reagenti di biologia molecolare, come wortmannina, che richiede un solvente come il DMSO. Tuttavia, DMSO può essere tossico per le cellule e di interferire con l'esperimento. Questi farmaci scarsamente solubili e reagenti possono essere efficacemente forniti utilizzando nanoparticelle polimeriche con tossicità minima. Nanoparticelle polimeriche può essere caricato anche con colorante fluorescente e utilizzati per gli studi di traffico intracellulare. Infine, queste nanoparticelle polimeriche può essere coniugato con targeting ligandi attraverso PEG superficie. Tali nanoparticelle mirata possono essere utilizzati per etichettare epitopi specifici su o in celle 7-10.
Protocol
1. Sintesi di PLGA-b-PEG polimero
- Poli (D, L-lattide-co-glicolico) (PLGA) con terminale gruppi carbossilato (PLGA-carbossilato) è disciolto in un solvente per PLGA (come indicato nella sezione materiali) ad una concentrazione di 5 mm. PLGA può essere sciolto a questa concentrazione con delicata agitazione.
- Entrambi NHS (peso molecolare 115,09) e EDC (peso molecolare 191,7) si sciolgono nella soluzione PLGA ad una concentrazione di 25 mm. (Sia EDC e NHS sono aggiunti in un eccesso stechiometrico di 5 volte rispetto al PLGA). PLGA-carbossilato viene convertito in PLGA-SSN con l'aggiunta di EDC e NHS a PLGA-carbossilato soluzione con delicata agitazione per circa 1 ora.
- Il prodotto di reazione PLGA-SSN è precipitato con l'aggiunta del metanolo soluzione di lavaggio. Circa 10 volte l'eccesso di volume di metanolo viene aggiunto alla soluzione. La soluzione è centrifugata a 2000 xg per precipitare il PLGA-NHS e scartare il surnatante (rimuove le tracce di CED e Servizio Sanitario Nazionale. La procedura di lavaggio con metanolo viene ripetuto almeno tre volte.
- Il PLGA-NHS pellet viene essiccato sotto vuoto per 30 minuti per rimuovere ogni traccia della soluzione di lavaggio.
- Il PLGA-NHS pellet viene nuovamente sciolto nello stesso solvente alla stessa concentrazione che è stato utilizzato inizialmente per sciogliere PLGA. Il PEG heterobifunctional (ammine PEG-carbossilato) viene poi aggiunto alla soluzione PLGA ad una concentrazione di 5 mm (rapporto stechiometrico di 1:1). La soluzione miscela è incubata per 24 ore mescolando costantemente.
- Dopo 24 ore, il prodotto di reazione PLGA-b-PEG copolimero a blocchi è precipitato con l'aggiunta del metanolo soluzione di lavaggio in eccesso. Ripetere il processo di lavaggio e centrifugazione, come già detto tre volte. Questo rimuoverà tutti i PEG in eccesso non reagito.
- Il PLGA-b-PEG copolimero a blocchi è essiccato sotto vuoto.
2. PLGA-b-PEG nanoparticelle preparazione
Nanoparticelle con anima PLGA coperto con PEG in superficie possono essere preparati con questi copolimeri diblock. Una varietà di diversi farmaci idrofobici possono essere incapsulati in nanoparticelle del genere. Composti fluorescenti possono essere incapsulati in nanoparticelle o può essere coniugato con PLGA, e quindi queste nanoparticelle possono essere utilizzate per l'imaging di fluorescenza.
Nanoprecipitation metodo è usato per fare nanoparticelle soprattutto quando il carico voluto essere incapsulato è altamente idrofoba in natura.
- Il PLGA-b-PEG copolimero a blocchi e la droga / carico (per essere incapsulato) sono disciolti in qualsiasi soluzione che si scioglie PLGA. PLGA può essere sciolto da molti solventi comuni, tra cui acetonitrile, DCM, tetraidrofurano, acetone o acetato di etile. La scelta del solvente è fondamentale, in quanto influenza le proprietà delle nanoparticelle. Quindi, opportuno solvente, deve essere usato in questo passaggio.
- La miscela di polimero / farmaco viene quindi aggiunta goccia a goccia a 3-5 volumi di acqua mescolando dando una concentrazione finale polimero di circa 3 mg / ml. (Fig. 2)
- L'agitazione è continuata per 2 ore a pressione ridotta per consentire le nanoparticelle di formare da self-assembly e rimuovere le tracce del solvente organico.
- La raccolta e la depurazione: Le nanoparticelle vengono poi concentrati per centrifugazione a 2.700 x g per 10 minuti utilizzando un filtro Amicon (MWCO 20KDa), lavato, e ricostituito in PBS. Questo elimina tutti i carichi non-farmaco intrappolato /. Di base caratterizzazioni biofisici, come le dimensioni, carica di superficie, l'efficienza e il caricamento della droga possono essere eseguite per comprendere meglio le proprietà delle nanoparticelle.
3. Immagazzinamento
Liofilizzazione è un metodo comunemente utilizzato per memorizzare nanoparticelle 11. Liofilizzazione manterrà le caratteristiche fisiche e chimiche delle nanoparticelle per la stabilità a lungo termine 12. Il processo di liofilizzazione può causare stress sulle particelle e destabilizzare la formulazione, in modo da crio-protettori (protezione dallo stress congelamento) e lyo-protettori (protezione dallo stress asciugatura) sono comunemente usati. La scelta di questi protettori è determinata dalla lunghezza desiderata del tempo di conservazione 13.
- Nella liofilizzazione, c'è solidificazione totale del campione congelamento di sotto del suo Tg.
- Nella fase di essiccazione, il ghiaccio viene rimosso per sublimazione. Temperatura e la pressione deve essere ottimizzata per ottenere un efficiente processo di liofilizzazione.
4. Rappresentante dei risultati:
Caratterizzazione di PLGA-b-PEG Di-copolimero a blocchi
Diverse tecniche possono essere utilizzate per confermare la riuscita coniugazione di polimeri. La composizione del PLGA-b-PEG può essere caratterizzato con un 400 MHz 1H risonanza magnetica nucleare (NMR). Peso molecolare del prodotto formato (PLGA-b-PEG) possono essere verificate da cromatografia a permeazione di gel (GPC). Il PLGA-b - PEG peso molecolare distributiocurva n ed il tempo di eluizione dovrebbe essere diverso da PLGA e PEG solo. La combinazione di queste tecniche dovrebbero caratterizzare il prodotto formato e determinare se la reazione di coniugazione ha avuto successo.
Caratterizzazione di PLGA-b-PEG nanoparticelle
Dimensione delle particelle e la distribuzione delle dimensioni può essere misurata con dispersione della luce dinamica. Parametri diversi nel processo nanoprecipitation influisce sulla dimensione delle particelle. Pesi molecolari dei polimeri utilizzati inizialmente (sia PLGA e PEG) anche l'effetto della distribuzione granulometrica. Microscopia elettronica di transizione (TEM) può anche essere usato per confermare la distribuzione delle dimensioni e della struttura delle nanoparticelle come si vede in figura 3. La gamma di dimensione delle particelle è generalmente nella gamma nm. Dimensioni delle particelle di grandi dimensioni con distribuzione delle dimensioni irregolari potrebbe indicare sia un errore nella reazione di coniugazione o il metodo nanoprecipitation esigenze di ottimizzazione. Inoltre, la superficie potenziale zeta può essere misurata con ZetaPALS.
Il farmaco / carico l'efficienza di carico può essere quantificato con lo standard HPLC.
Le particelle sono sciolti in solvente organico e HPLC può essere effettuata per misurare l'assorbimento del farmaco / carico (Fig. 4). Lo studio rilascio del farmaco cinetica può essere fatto se noti quantità fisse delle nanoparticelle sono dializzati in 30 Slide-A-Lyzer unità di dialisi MINI. Ad intervalli di tempo fisso, il contenuto nell'unità di dialisi sono raccolti e volume uguale di solvente organico viene aggiunto per sciogliere le nanoparticelle. HPLC è fatto su questi campioni di quantificare il farmaco / carico di contenuti.
Figura 1. EDC / NHS chimica
Figura 2. Nanoprecipitation metodo per la preparazione di nanoparticelle polimeriche. La soluzione di un solvente organico (acetonitrile o DCM) che contiene il PEG-PLGA diblock e la droga o merci da caricare nella particella viene aggiunta goccia a goccia a 3-5 ml di mescolare H 2 O.
Figura 3. Microscopia elettronica a trasmissione di nanopartices. Un'immagine TEM di PEG-PLGA contenenti nanoparticelle wortamin. Acido fosfotungstico è stato usato come agente di contrasto.
Figura 4. Rilascio controllato di farmaci da nanoparticelle. Rilascio di nanoparticelle di Paclitaxel dopo la dialisi in PBS. Al tempo notato, le particelle sono state rimosse da cassette dialisi e solublized in acetonitrile. La soluzione è stata misurata mediante HPLC. Due lotti separati di nanoparticelle sono stati confrontati.
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Discussion
Il metodo nanoprecipitation utilizzando diblock copolimeri rappresenta un metodo semplice e veloce per progettare nanoparticelle polimeriche. Le nanoparticelle risultanti sono composte da un nucleo idrofobico che può essere utilizzata per l'erogazione di composti scarsamente solubili. Lo strato superficiale idrofilo consente un'eccellente solubilità in acqua, fornendo un residuo potenziale per coniugazione a seguito di una ligando targeting.
Ci sono piattaforme di nanoparticelle, tra cui liposomi, nanoparticelle polimeriche, dendrimeri, particelle metalliche, e punti quantici 14. Tra queste piattaforme, la piattaforma di nanoparticelle polimeriche è uno dei più facili da formulare e il più versatile in termini di applicazioni. Si richiede una configurazione minima attrezzatura e la tecnica può essere appresa in diverse ore. Ha anche una vasta gamma di applicazioni e la sua biocompatibilità permette sia in vitro che in vivo le applicazioni. La sua capacità di trasportare un carico permette l'imaging e le capacità terapeutiche.
EDC / NHS chimica è presentato qui per generare il copolimero diblock. Tuttavia, copolimeri a blocchi possono essere sintetizzati con diversi catalizzatori. Un altro catalizzatore comunemente utilizzata è ottoato stannoso. I gruppi terminali idrossile di PEG sono usati come avviando gruppi di sintetizzare copolimeri a blocchi. Polimerizzazione anello di lactide e glicolide iniziata da diidrossi PEG o monometossi PEG può portare a ABA o AB copolimeri a blocchi tipo rispettivamente 15. Questo metodo di preparazione offre una maggiore flessibilità nella progettazione, tuttavia l'EDC / NHS chimica è più facile da usare e può risparmiare tempo utilizzando un normale PLGA polimero.
Oltre a nanoprecipitation, altri metodi per generare diblock nanoparticelle polimeriche possono essere utilizzati. Una tipica alternativa è un "olio in acqua" metodo dell'emulsione 16. Il metodo di emulsione riparte con una fase organica contenente il copolimero diblock e una fase acquosa. Tuttavia, dopo la miscelazione dei due soluzioni, le nanoparticelle vengono generati tramite vortex e sonicating. Questo metodo è molto simile, ma il metodo nanoprecipitaion consente un maggiore controllo nella fase di miscelazione, nonché evita l'uso di sonicazione.
Ci sono molte potenziali applicazioni per questa piattaforma. In primo luogo, può essere utilizzato per la fornitura di idrofobiche / farmaci scarsamente solubili in studi di consegna della droga. Per esempio, taxani sono scarsamente solubili e richiedono un solvente per studi in vivo. Nanoparticelle polimeriche può incapsulare farmaci taxano e abolisce la necessità di solventi. Le nanoparticelle possono anche fornire i reagenti di biologia delle cellule che sono scarsamente solubili, come wortmannina. Nanoparticelle polimeriche può essere caricato anche con colorante fluorescente e utilizzati per gli studi di traffico intracellulare. Queste nanoparticelle polimeriche può essere coniugato con targeting ligandi attraverso PEG superficie. In combinazione con l'etichettatura fluorescenti, queste nanoparticelle mirati possono essere usati per etichettare epitopi specifici su o nelle cellule. Dal momento che ogni nanoparticella può incapsulare un gran numero di molecole fluorescenti, le nanoparticelle possono migliorare la sensibilità di tali studi biologici. Nanoparticelle fluorescenti etichettati può essere utilizzato anche per imaging in vivo, come ad esempio la visualizzazione dei vasi sanguigni e placche aterosclerotiche.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Golfers contro il cancro, Carolina del Centro Pilota per concedere Nanotechnology Excellence, University Cancer Research Fund e Istituto Superiore di Sanità K-12 Career Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDC | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | Conjugation Reagent |
| NHS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | Conjugation Reagent |
| amine-PEG-carboxylate | Laysan Bio Inc. | Nh2-PEG-CM-5000 | Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here) |
| PLGA-carbxylate |  Lactel |
B6013-2 | Polymer |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 34856 | Solvent |
| Acetonitrile >99% purity | Sigma-Aldrich | 34851 | Solvent |
| Methanol >99% purity | Sigma-Aldrich | 34860 | Wash |
References
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