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Bioengineering

Nanoprecipitation 기법을 통해 디블록 고분자 Nanoparticles의 제형

Published: September 20, 2011 doi: 10.3791/3398
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Laboratory of Nano- and Translational Medicine, Department of Radiation Oncology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 2Carolina Center for Nanotechnology Excellence, University of North Carolina

Summary

이 문서 디블록 공동 폴리머를 사용하여 폴리머 기반 nanoparticles를 합성하는 nanoprecipitation 방법을 설명합니다. 우리는 디블록의 합성 공동 고분자, nanoprecipitation 기술, 그리고 잠재적인 애플 리케이션을 설명합니다.

Abstract

나노기술은 harnessing에게 규모 나노미터 (nanoparticles)입니다 입자의 고유한 속성을 포함 과학의 비교적 새로운 지점입니다. Nanoparticles들은 크기, 조성과 표면 화학은 신중하게 제어할 수있는 정확한 방식으로 설계하실 수 있습니다. 이것은 용해도, 확산 계수, biodistribution, 릴리스 특성 및 immunogenicity로서화물의 기본 속성 중 일부를 수정하는 전례없는 자유를 수 있습니다. 그들의 처음부터, nanoparticles는 약물 전달, 이미징 및 세포 생물학을 포함하여 1-4 과학 및 의학의 많은 분야에서 널리 사용되었습니다. 그러나, 그것은 완전히 인식 기술 장벽으로 인해 "나노기술 연구소"의 외부 활용되지 않았습니다. 이 문서에서는, 우리는 잠재적인 어플 리케이션의 광범있는 폴리머 기반의 nanoparticle 플랫폼을 종합하는 간단한 방법을 설명합니다.

첫 번째 단계는 소수성 친수성 ​​도메인과 도메인을 모두 가진 디블록 공동 고분자를 합성하는 것입니다. 모델 고분자와 같은 PLGA와 PEG를 사용하여, 우리는 EDC / NHS 화학 5 (그림 1)을 사용하여 결합 반응을 설명했다. 우리는 또한 폴리머 정화 과정을 논의합니다. 합성 디블록 공동 고분자는 소수성 - 친수성 ​​상호 작용을 통해 nanoprecipitation 과정에서 nanoparticles로 자기 조립하실 수 있습니다.

설명 폴리머 nanoparticle은 매우 다양한 있습니다. nanoparticle의 소수성 핵심은 약물 전달 experiments6에 대해 제대로 용해 약물을 휴대 이용하실 수 있습니다. 또한, nanoparticles는 DMSO와 같은 용매가 필요 wortmannin로 저조한 수용성 분자 생물 시약에 대한 독성 용매의 문제를 극복할 수 있습니다. 그러나, DMSO는 세포 독성하고 실험을 방해할 수 있습니다. 이러한 저조한​​ 수용성 약물과 시약이 효과적으로 최소한의 독성과 고분자 nanoparticles를 사용하여 전달할 수 있습니다. 폴리머 nanoparticles 또한 형광 염료와 함께로드되고 세포 연구에 대한 인신 매매 이용하실 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 폴리머 nanoparticles는 표면 PEG 통해 리간드를 타겟팅 복합 수 있습니다. 이러한 타겟 nanoparticles는 70-10이나 세포에서 특정 epitopes 레이블을 이용하실 수 있습니다.

Protocol

1. PLGA - B - PEG 중합체의 합성

  1. 터미널 카르복 그룹과 폴리 (D, L - lactide - 공동 glycolide) (PLGA)는 (PLGA - 카르복) 5mM의 농도에서 PLGA (같은 재료 섹션에서 언급된)에 대한 모든 용매에 녹아있다. PLGA는 부드러운 감동이 농도에서 해산 수 있습니다.
  2. 보건국 (분자량 115.09) 및 EDC (분자량 191.7) 모두 25mM의 농도에서 PLGA 용액에 녹아 있습니다. (EDC와 NHS 모두 PLGA에 비해 5 배의 stoichiometric 초과에 추가됩니다.) PLGA - 카르복은 약 1 시간 동안 부드러운 감동과 PLGA - 카르복 솔루션 EDC와 NHS을 추가하여 PLGA - 보건국로 변환됩니다.
  3. 반응 생성물 PLGA - 보건국은 세척 용액에 메탄올을 추가하여 밖으로 시켰던 것입니다. 메탄올의 약 10 배 볼륨 초과가 솔루션에 추가됩니다. 솔루션은 침전물 밖 PLGA - NHS를하고 (EDC와 NHS의 흔적을 제거합니다. 메탄올로 세척의이 절차는 적어도 세 번 반복 뜨는을 폐기 XG 2000에서 centrifuged입니다.
  4. PLGA - 보건국 펠렛은 세척 솔루션의 모든 흔적을 제거하는 30 분 진공하에 건조.
  5. PLGA - 보건국 펠렛 지금 PLGA를 해산하기 위해 처음 사용되었던 동일한 농도에서 같은 용매에 다시 녹아있다. heterobifunctional PEG (아민 - PEG - 카르복)는 다음 5mM의 농도에서 PLGA 솔루션에 추가됩니다 (1:1의 비율 stoichiometric). 혼합 솔루션은 지속적인 교반과 함께 24 시간 동안 incubated입니다.
  6. 24 시간 후에, 반응 생성물 PLGA - B - PEG 블록 공중 합체는 초과 세척 용액에 메탄올을 추가하여 밖으로 시켰던 것입니다. 로 세 번 상기 세정 및 원심 분리 과정을 반복합니다. 이것은 모든 초과 unreacted PEG 제거됩니다.
  7. PLGA - B - PEG 블록 공중 합체는 진공 하에서 건조됩니다.

2. PLGA - B - PEG의 nanoparticle 준비

표면에 PEG으로 덮여 PLGA 코어와 Nanoparticles 이러한 디블록 공중 합체와 함께 준비하실 수 있습니다. 다른 소수성 약물의 다양한 등 nanoparticles에서 캡슐 수 있습니다. 형광 화합물은 nanoparticles에 캡슐 될 수도 있고 아니면 PLGA에 복합 있으므로 이러한 nanoparticles가 형광 이미징에 사용될 수 있습니다.

Nanoprecipitation 방법은 캡슐로 원하는화물 자연에서 높은 소수성 특히 때 nanoparticles를 만들기 위해 사용됩니다.

  1. PLGA - B - PEG 블록 공중 합체와 약물 /화물은 (캡슐 예정) PLGA를 녹이고있는 어떤 용매에 녹아 있습니다. PLGA는 acetonitrile, DCM, tetrahydrofuran, 아세톤 또는 에틸 아세테이트를 포함하여 여러 가지 일반적인 용매에 의해 용해 수 있습니다. 그것이 nanoparticle의 속성에 영향을 미친다 같은 용매의 선택은 중요합니다. 따라서, 용매 적절한는이 단계에서 사용해야합니다.
  2. 고분자 / 약물 혼합물은 다음 주위 3 MG / ML의 최종 폴리머 농도를주는 감동의 물을 3-5 볼륨 dropwise 추가됩니다. (그림 2)
  3. 교반은 nanoparticles 자기 조립에 의해 양식 수 있고 유기 용매의 흔적을 제거하는 감소 압력을 받고 2 시간 동안 계속됩니다.
  4. 수확 및 정화 : nanoparticles 그 다음 씻은 Amicon 필터 (MWCO 20KDa)를 사용하여 10 분 2,700 X g에서 원심 분리에 의해 집중하고, PBS로 재구성됩니다. 이것은 모두 해제 속은 약물 /화물을 제거합니다. 기본 biophysical 같은 크기로 characterizations, 표면 요금 및 약물 로딩 효율 좋은 nanoparticles의 속성을 이해하기 위해 수행할 수 있습니다.

3. 저장

냉동 건조는 nanoparticles 11 저장하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다. 냉동 건조는 장기 안정성 12 nanoparticles의 물리적, 화학적 특성을 유지합니다. 동결 건조 프로세스가 입자에 스트레스 원인과 제제를 불안정하게 할 수 cryo - protectants (냉동 스트레스로부터 보호)와 lyo - protectants가 (건조 스트레스로부터 보호) 일반적으로 사용되고 있으므로. 이 protectants의 선택은 저장 시간이 13 원하는 길이에 의해 결정됩니다.

  1. 냉동 건조에서 그 TG 영하로 샘플의 총 응고가 있습니다.
  2. 건조 단계에서 얼음이 승화에 의해 제거됩니다. 온도 및 압력이 효율적인 냉동 건조 과정을 달성하기 위해 최적화되어야합니다.

4. 대표 결과 :

PLGA - B - PEG 디 - 블록 공중 합체의 특성

다른 기술은 폴리머의 성공적인 활용을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. PLGA - B - PEG의 구성은 400 MHz의 상반기 핵 자기 공명 (NMR)를 사용하여 특징하실 수 있습니다. 형성된 제품의 분자량 (PLGA - B - PEG)는 겔 침투 크로마 토그래피 (GPC)에서 확인할 수 있습니다. PLGA - B - PEG 분자량 distributioN 곡선과 용출 시간은 PLGA와 PEG 혼자 다른되어야합니다. 조합에서는 이러한 기술은 형성된 제품 특징 및 활용 반응이 성공 여부를 결정한다.

PLGA - B - PEG의 특성화는 nanoparticles

입자 크기 및 크​​기 분포는 동적 광 산란에 의해 측정할 수 있습니다. nanoprecipitation 과정에서 다른 매개 변수는 입자의 크기에 영향을줍니다. 처음 사용하는 고분자 (PLGA와 PEG 모두)의 분자 중량은 또한 입자 크기 분포에 영향을. 전환 전자 현미경 (TEM)은 또한 그림 3에서 볼 nanoparticles의 크기 분포와 구조를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 입자 크기 범위는 NM 범위에서 일반적이다. 고르지 크기 분포와 큰 입자 크기는 중 결합 반응 또는 nanoprecipitation 방법의 요구에 최적화 오류를 나타낼 수 있습니다. 또한, 표면 제타 전위는 ZetaPALS에 의해 측정할 수 있습니다.
약물 /화물 적재 효율 표준 HPLC과 계량 수 있습니다.

입자가 유기 용매와 HPLC에 녹아있는 아르 것은 약물 /화물 (그림 4)의 흡광도를 측정을 수행할 수 있습니다. nanoparticles의 고정 수량 30 슬라이드 - A - Lyzer 미니 투석 단위로 dialyzed 아르 알려진 어디 약물 릴리스 운동 연구는 할 수 있습니다. 고정 시간 간격으로, 투석 장치에있는 내용은 수집과 유기 용매의 동일한 볼륨 nanoparticles를 해산에 추가됩니다. HPLC는 약물 /화물 내용을 계량이 샘플에 이루어집니다.

그림 1
그림 1. EDC / NHS 화학

그림 2
그림 2. 고분자 nanoparticles를 준비 Nanoprecipitation 방법은. PEG - PLGA 디블록와 입자에로드 될 수있는 약물이나화물을 포함 (acetonitrile 또는 DCM) 용매의 유기 솔루션은 H 2 O. 감동의 3-5 ML에 dropwise 추가됩니다

그림 3
그림 3. nanopartices의 전송 전자 현미경은. PEG - PLGA의 TEM 이미지는 wortamin를 포함한 nanoparticles. Phosphotungstic 산은 대비 에이전트로 사용되었다.

그림 4
그림 4. PBS에서 투석 후 nanoparticles에서 Paclitaxel의 nanoparticle에서 약물의 관리 릴리스. 릴리스. 언급 당시 입자는 투석 카세트에서 제거되었고 acetonitrile에 solublized. 솔루션은 HPLC로 측정되었다. nanoparticles의 두 개의 서로 다른 많은가 비교되었다.

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Discussion

디블록 공동 폴리머를 사용하여 nanoprecipitation 방법은 고분자 nanoparticles를 엔지니어링하는 간단하고 빠른 방법을 나타냅니다. 그 결과 nanoparticles는 저조한 수용성 화합물의 전달 활용할 수있는 소수성 핵심으로 구성되어 있습니다. 타겟팅 리간드로 가능성이 더 활용을위한 잔기를 제공하면서 표면 친수성 ​​계층은 우수한 수성 용해도 수 있습니다.

liposomes 등 많은 nanoparticle 플랫폼, 고분자 nanoparticles, dendrimers, 금속 입자 및 양자 도트 14있다. 이러한 플랫폼 중, 고분자 nanoparticle 플랫폼은 애플 리케이션의 측면에서 공식화 쉽고 가장 다양한 중 하나입니다. 그것은 최소한의 장치 설치가 필요하며이 기술은 몇 시간에 배울 수 있습니다. 또한 어플 리케이션의 광범을 가지고 있으며 그 biocompatibility는 체외에서 생체내 애플 리케이션에 모두 있습니다. 화물을 운반하는 기능은 이미징 및 치료 기능을 수 있습니다.

EDC / NHS 화학은 디블록 공중 합체를 생성하기 위해 여기에 제공됩니다. 그러나, 블록 공중 합체는 여러 촉매를 사용하여 합성 수 있습니다. 또 다른 일반적으로 사용되는 촉매는 stannous octoate입니다. PEG의 터미널 수산기 그룹은 블록 공중 합체를 합성하기 위해 그룹을 시작으로 사용됩니다. dihydroxy PEG 또는 monomethoxy PEG에 의해 시작 lactide와 glycolide의 고리 중합은 ABA 또는 AB 형 블록 공중 합체 각각 15 초래할 수 있습니다. 준비의이 방법은 설계에 더 많은 유연성을 제공하지만 EDC / NHS 화학은 사용하기 쉬운이며 시판 PLGA 중합체를 사용하여 시간을 절약할 수 있습니다.

nanoprecipitation 이외에 다른 방법 디블록 폴리머 nanoparticles를 사용할 수 있습니다 생성합니다. 일반적인 대안은 유제 방법 16 "물에 기름"입니다. 유제 방법은 다시 디블록 공중 합체 및 수성 단계를 포함하는 유기 단계로 시작합니다. 그러나, 두 솔루션을 혼합시, nanoparticles는 vortexing하고 sonicating를 통해 생성됩니다. 이 방법은 매우 비슷하지만 nanoprecipitaion 방법은 혼합 단계뿐만 아니라 더 많은 제어가 sonication의 사용을 피할 수 있습니다.

이 플랫폼에 대한 많은 잠재적인 응용 프로그램이 있습니다. 첫째, 그것은 약물 전달 연구에 소수성 / 저조한 용해 약물의 전달을 위해 활용하실 수 있습니다. 예를 들어, taxanes는 제대로 용해하고 생체내 연구에 대한 용제가 필요합니다. 고분자 nanoparticles가 taxane 마약을 캡슐 및 용제에 대한 필요성을 폐기하실 수 있습니다. Nanoparticles 또한 wortmannin으로 저조한 용해 아르 셀 생물학 시약을 제공할 수 있습니다. 폴리머 nanoparticles 또한 형광 염료와 함께로드되고 세포 연구에 대한 인신 매매 이용하실 수 있습니다. 이러한 폴리머 nanoparticles는 표면 PEG 통해 리간드를 타겟팅 복합 수 있습니다. 형광 라벨과 결합이 타겟 nanoparticles는 세포 또는 특정 epitopes 레이블을하는 데 사용할 수 있습니다. 각 nanoparticle은 형광 분자의 큰 숫자를 캡슐 수 있기 때문에, nanoparticles는 생물 학적 연구의 감도를 향상시킬 수 있습니다. 형광 라벨 nanoparticles는 또한 혈관과 atherosclerotic plaques의 시각화로 생체내 이미징에 대한 이용하실 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 암, 나노기술 우수 파일럿 부여, 대학 암 연구 기금과 국민 건강 연구소의 K - 12 경력 개발 수상 캐롤라이나 센터에 대한 골퍼에 의해 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDC Thermo Fisher Scientific, Inc. 22980 Conjugation Reagent
NHS Thermo Fisher Scientific, Inc. 24500 Conjugation Reagent
amine-PEG-carboxylate Laysan Bio Inc. Nh2-PEG-CM-5000 Polymer (Can use any PEG MW, 5000 is listed here)
PLGA-carbxylate Lactel B6013-2 Polymer
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 34856 Solvent
Acetonitrile >99% purity Sigma-Aldrich 34851 Solvent
Methanol >99% purity Sigma-Aldrich 34860 Wash

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References

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