Summary
L'organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chimici intraspecie che veicolano informazioni sociali e riproduttivi. Abbiamo effettuato Ca2 + esperimenti di imaging con topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nel tessuto VNO. Questo approccio ci consente di analizzare i modelli di risposta dei neuroni complicato vomeronasale a un gran numero di stimoli feromone.
Abstract
L'organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chemosensoriali che portano informazioni sullo stato sociale, sessuale e riproduttiva degli individui all'interno della stessa specie, 1,2. Questi segnali intraspecie, i feromoni, così come i segnali di alcuni predatori 3, attivare i neuroni sensoriali vomeronasale (VSNs) con alti livelli di specificità e sensibilità 4. Almeno tre distinte famiglie di proteine G recettori accoppiati, V1R, V2R e FPR 5-14, vengono espressi nei neuroni VNO di mediare la rilevazione della spunti chemosensoriali. Per capire come le informazioni feromone è codificata dal VNO, è fondamentale per analizzare i profili di risposta di VSNs individuale a stimoli diversi e identificare i recettori specifici che mediano la risposta.
Il neuroepithelia di VNO sono racchiusi in un paio di ossa vomere. Il semi-cieco struttura tubolare del VNO ha una estremità aperta (il dotto vomeronasale) che collega ala cavità nasale. VSNs estendere i loro dendriti alla parte lume del VNO, dove gli spunti feromoni sono in contatto con i recettori espressi al manopole dendritiche. I corpi cellulari dei VSNs forma pseudo-stratificato con strati V1R e V2R espressa negli strati basali e apicali rispettivamente 6-8. Diverse tecniche sono state utilizzate per monitorare le risposte di VSNs agli stimoli sensoriali 4,12,15-19. Tra queste tecniche, la preparazione fetta acuta offre diversi vantaggi. In primo luogo, rispetto ai 3,17 VSNs dissociato, preparati fetta mantenere i neuroni nella loro morfologia e origine i dendriti delle cellule soggiorno relativamente intatte. In secondo luogo, i corpi cellulari dei VSNs sono facilmente accessibili in fetta coronale del VNO per consentire studi di elettrofisiologia ed esperimenti di imaging rispetto a epitelio tutto e tutto di montaggio preparati 12,20. In terzo luogo, questo metodo può essere combinata con tecniche di clonazione molecolare per consentire l'identificazione del recettore.
Stimolazione sensoriale suscita forte afflusso Ca 2 + in VSNs che è indicativo di attivazione dei recettori 4,21. Abbiamo così sviluppare topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nei neuroni sensoriali olfattivi, compreso il VSNs 15,22. La sensibilità e la natura genetica della sonda facilitare notevolmente Ca 2 + esperimenti di imaging. Questo metodo ha eliminato il processo di tintura di carico utilizzati in studi precedenti 4,21. Inoltre utilizzano un sistema di consegna ligando che consente l'applicazione di stimoli diversi per le fette VNO. La combinazione delle due tecniche ci permette di monitorare contemporaneamente i neuroni in risposta a un gran numero di stimoli. Infine, abbiamo stabilito un semi-automatico pipeline di analisi per aiutare l'elaborazione delle immagini.
Protocol
1. Soluzione preparazione
- Preparare R1 10X, 10X e 10X R2 R3 soluzioni in base alla tabella.
R1Prodotti chimici MW (g / mol) mM (1X) Magazzino 10X (g / L) NaCl 58,44 125 73,05 KCl 74,55 2,5 1,86 MgCl 2 1 M magazzino 1 10 ml CaCl 2 · 2H 2 O 147,02 2 2,94 NaH 2 PO 4 · H 2 O 137,99 1,25 1,72
R2Chimico MW (g / mol) mM (1X) Magazzino 10X (g / L) NaHCO 3 84,01 25 21
R3Prodotti chimici MW (g / mol) mM (1X) Magazzino 10X (g / L) NaCl 58,44 125 73,05 KCl 74,55 2,5 1,86 MgCl 2 1 M magazzino 2 20 ml CaCl 2 · 2H 2 O 147,02 2 2,94 HEPES 1 M magazzino 5 50 ml - Fare 1 litro di topo artificiale liquido cerebro-spinale (mACSF) il giorno dell'esperimento mescolando 100 ml di R1 10X e 100 ml di R2 10X in acqua bidistillata (DDW) e add 1,8 g di destrosio (finale 10 mM). Questo metodo di preparazione impedisce la precipitazione di carbonato di calcio a pH elevati. L'osmolarità di mACSF è di circa 310-315 mOsm / L. Regolare l'osmolarità con destrosio o acqua se necessario. Aerare la soluzione con Carboxygen gas (95% di ossigeno e anidride carbonica del 5%) per almeno 30 minuti prima di regolare il pH della soluzione a 7,2-7,4.
- Fare 1 litro di soluzione di Ringer, il giorno dell'esperimento mescolando 100 ml di R2 10X e 100 ml di R3 10X in DDW e aggiungere 1,8 g di destrosio (10 mM). L'osmolarità e pH della soluzione di Ringer dovrebbero essere simili a quelle del mACSF. Aerare la soluzione con gas Carboxygen.
- Preparare 4% a bassa fusione agarosio (LMA), in entrambe le mACSF o soluzione di Ringer. Aliquota l'agarosio fuso in tubi eppendorf e conservare a 4 ° C fino all'uso. LMA, che si compone di polisaccaride purificato, rimane fluido a 37 ° C e solidifica rapidamente a temperature inferiori a 25 ° C. Queste proprietà lo rendono ideale per l'incorporamento VNO e la fisiologia dei tessuti vivi. Altri materiali impuri, come agar, non dovrebbe essere la scelta per l'esperimento tessuto vivo come componenti non caratterizzate può interferire con la risposta neuronale.
- Preparare stimoli feromone in soluzione di Ringer. Per l'urina del mouse, diluizione 1:100 dar luogo a risposte robuste.
2. Preparazione di fetta VNO
- Prima di sacrificare l'animale, messo due tubi di LMA su un blocco di calore e impostare la temperatura a> 60 ° C per sciogliere l'agarosio. Una volta che il gel si liquefa, trasferire i tubi ad un blocco di 37 ° C di calore.
- Decapitare un G-CaMP2 topo seguenti CO 2 l'eutanasia. Tagliare le ossa della mandibola con le forbici per rimuovere la mascella inferiore. Staccare il tessuto increspato palato superiore per esporre la cavità nasale (Figura 1A). Separare le mandibole con l'inserimento di una lama chirurgica tra i due incisivi davanti. Rimuovere con attenzione la mascella per esporre VNO. A questo punto, il VNO intero può essere elevato da ncavità Asal tenendo sul coccige (Figura 1B). Trasferire il VNO al freddo soluzione ossigenata mACSF immediatamente.
- In ambito dissezione, separare i due VNOs utilizzando la punta del # 5 pinze dolcemente scivolare lungo la parete di osso settale (Figura 1C). Sbucciare via l'osso vomere che avvolge il tessuto VNO. Sollevare delicatamente tutto il tessuto VNO dalla cavità ossea. Estrema cura deve essere presa in questa fase non danneggiare il neuroepitelio. Piccoli frammenti ossei lasciati sulla superficie del tessuto deve essere rimosso completamente prima di incorporamento. Frammenti lasciati sul tessuto può essere catturato dalla lama di taglio per tirare il tessuto fuori del blocco di agarosio.
- Utilizzare le pinze per tenere la fine posteriore del tessuto VNO e delicatamente immergere nel fuso agarosio (Figura 1D). Rapidamente raffreddare la provetta in ghiaccio per solidificare l'agarosio. Il processo di inclusione e di raffreddamento dovrebbe prendere meno di 2 minuti.
- VF300 affettatrice tessuto (Precisionary Instrcumenti, Greenville, Carolina del Nord) è usato per fare sezioni. Tagliare il blocco di agarosio contenente il VNO in forma e incollarlo al titolare del tessuto (Figura 1E e F). Inserire il supporto del tessuto nel cilindro di metallo e riempire la camera restante con l'aggiunta di LMA. Una volta che la LMA solidifica in ghiaccio, procedere al sezionamento immediatamente. Fornitura freddo mACSF ossigenata in camera di sezionamento e di iniziare a tagliare a 180-200 micron di spessore per fetta. Regolare la velocità di avanzamento e la frequenza di vibrazione in modo che il tessuto non viene compressa durante il sezionamento e VNO non si stacchi dal agarosio. Raccogliere e trasferire le fette sezionato per mACSF camera di incubazione (Figura 2A). Le fette sono vitali per 6-8 ore in mACSF ossigenata a temperatura ambiente. Figura 2B e C mostrano le immagini DIC e 2-fotone di un G-CaMP2 fetta VNO, rispettivamente.
3. Imaging camera di impostare
- Collocare la fetta VNO nel mezzo della perfusionecamera (Siskiyou, Grants Pass, OR) e tenere la fetta giù con una fetta di ancoraggio (Warner Instruments, Hamden, CT) (Figura 3A). I fili del tassello deve solo premere contro la parte LMA della fetta ma non il tessuto VNO. Ossigenato mACSF viene consegnato alla camera di perfusione attraverso la porta di ingresso a ~ 100 l / sec e il liquido viene drenato attraverso un ago di aspirazione tramite la porta di uscita per fornire un flusso continuo di nuove mACSF (Figura 3A e B).
- Riempire una siringa da 30 ml con la soluzione di Ringer e bloccarlo alla pompa siringa (Nuovi sistemi di pompe di Era, Farmingdale, NY). Impostare la velocità della pompa di 300-600 microlitri / min per fornire un flusso continuo di soluzione di Ringer sulla fetta (Figura 3C).
- Collegare l'uscita della suoneria è l'iniezione HPLC ad un loop (Chromtech, Apple Valley, MN) (Figura 3D). Dimensioni ciclo differenti possono essere selezionati per un controllo preciso del volume essere consegnati. Usiamo un loop 20 microlitri in oesperimenti di ur. Il controllo del ciclo di iniezione ha due percorsi di flusso (Figura 3E). Nella posizione "carico", i campioni possono essere caricati nel ciclo del campione con una siringa di precisione Hamilton. Esce campione in eccesso il ciclo campione attraverso uscita dei rifiuti. Ringer iniettata dalla pompa siringa bypassa il ciclo del campione e va direttamente al punto vendita, che è collegata alla punta perfusione (Figura 3A ed E). Alla posizione di "iniezione", la soluzione della pompa passa attraverso il ciclo di campionamento e spingere gli stimoli nella presa (Figura 3E). Prima l'esperimento di imaging, le bolle d'aria devono essere cacciati per garantire la fluidità del liquido di perfusione. Altri sistemi commerciali o custom iniezione fatto può anche essere implementato per la consegna stimolo.
- Regolare la punta perfusione sotto una lente 5x o 10x in modo che la punta è di circa 1 mm di distanza dalla fetta VNO.
- Quando un sistema di perfusione è nuova configurazione, si consiglia di misurare il tempo di ritardo del campione e durantezione con il colorante fluorescente. Carico colorante rodamina 6G 0,1% nel ciclo di campionamento e passare la valvola per iniettare posizione a 5 secondi dopo l'inizio di acquisizione dell'immagine (Figura 3F). Il segnale fluorescente viene rilevato tra i 10-30 secondi. La curva del segnale fluorescente indica anche che c'è poca turbolenza generata sotto la lente immersione e perfusione adeguata ossigenazione mACSF raggiunge la fetta.
4. Passa il tempo di imaging
- Usiamo il microscopio Zeiss AxioSkope FS2 con un 10X o 20X acqua immersione lente per l'imaging lasso di tempo. Standard GFP filtro passa-banda (450-490nm) viene utilizzato per G-CaMP2 segnali. Epifluorescente Le immagini vengono acquisite da una telecamera CCD (Zeiss HRM) con binning 1x1 o 2x2 a seconda del livelli di espressione di G-CaMP2.
- Impostare la velocità di acquisizione di 1 fotogramma al secondo. Regolare l'intensità della luce per minimizzare lo sbiancamento del G-CaMP2 segnali e danni alle cellule foto. Per ogni experiment, che normalmente acquistare un 60-stack frame di immagine (~ 60-70 secondi). Passa la valvola in posizione di iniezione in un dato momento (per esempio, 5 secondi nella figura 3F) per una serie di esperimenti per ottenere ritardo temporale coerente in tutti gli studi.
- Eseguire una prova utilizzando la soluzione di Ringer come stimolo. Regolare nuovamente il setup perfusione se artefatto movimento è introdotto durante l'iniezione del campione.
- Eseguire un controllo positivo correre con l'urina del mouse diluito 1:100 in una soluzione di Ringer. Il tipico massima ΔF / F valore di G-CaMP2 risposta alle urine del mouse è di circa 20-40%. Se necessario, si può confermare la vitalità della fetta offrendo 10 mM KCl in Ringer per stimolare le fette alla fine degli esperimenti.
- Lavare la siringa Hamilton in soluzione di Ringer almeno tre volte dopo il caricamento di uno stimolo. Lavare il ciclo campione con una soluzione di Ringer almeno tre volte tra stimoli diversi. Questi passaggi prevenire la contaminazione crociata tra different campioni.
- Attendere 4-10 min per il VSNs di recuperare prima di applicare lo stimolo successivo.
5. Analisi dei dati
- Eseguire la registrazione di immagini di tutte le immagini acquisite da una fetta. Usiamo un custom-written script VBA in AxioVision (Carl Zeiss, Nord America) per automatizzare questo processo. Tutti i telai immagine all'interno lo stesso esperimento sono registrati nei confronti di un quadro comune di riferimento scelto con elastico di registrazione (Figura 4A). Elastico registrazione, noto anche come registrazione non lineare, è una categoria di tecnica dell'immagine registrazione sottolineando la trasformazione di una immagine di destinazione non rigidamente ad un'immagine di riferimento. Qui abbiamo usato l'attuazione da AxioVision.
Questa cornice di riferimento viene scelto arbitrariamente dalle pile immagine. - Eseguire la sottrazione delle immagini per identificare le cellule rispondono. Noi usiamo personalizzati macro scritte in ImageJ v1.42 ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ , NIH, Bethesda, MD) per automatizzare questo processo. Un'immagine proiezione minima è generato per ogni stack. Le cellule rispondono emergono dopo la proiezione minima è sottratto dal stack prima (Figura 4B).
- Identificare regione di interesse (ROI) dalle pile sottratto il ROI e ottenere coordinate con multimisura plugin da ImageJ. Processo tutti gli stack per un esperimento e salvare tutte le ROI coordinate in un elenco principale ROI (Figura 4C).
- Utilizzare l'elenco principale ROI per misurare le risposte delle cellule dai camini immagine grezza con scritte personalizzate macro e multimisura plugin da ImageJ (fig. 4D). Trama curve di risposta e heatmap in Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA).
6. Rappresentante Risultati
Un esempio di esperimento di imaging VNO utilizzando campioni di urina raccolti da quattro singoli topi è mostrato in Figura 5. La fetta risponde alla stimolazione delle urine con p diverseatterns di attivazione. Circa 80 le cellule sono identificate mostrando risposta ad almeno uno degli stimoli urine e la loro risposta ΔF / F sono riportati i valori nel heatmap (Figura 5A). Le tracce di risposta delle celle 1, 2 e 3 sono riportati in Figura 5B che mostra il tempo di attivazione del corso da stimoli urine. Cella 1 mostra la risposta ad entrambe le urine femminili, ma non i campioni maschi, mentre le cellule 2 mostra i modelli opposti di attivazione e risponde a entrambi i campioni di sesso maschile. Cella 3 è attivato da entrambi i campioni individuali maschili e femminili. Celle 1 e 2 mostrano la risposta caratteristica al sesso indicazioni specifiche nelle urine 15.
Figura 1 Rappresentazione schematica del processo di dissezione VNO. A. La posizione anatomica del VNO nella testa del mouse. La testa di un G-CaMP2 mouse è stato sezionato ed è prevista a testa in giù con la t morbidoquestione rimossa dal palato per esporre il VNO. Ingresso mostra un'immagine fluorescente della stessa immagine. Il neuroepithelia del VNO sono di colore verde brillante. B. Una vista laterale della VNO isolato che è racchiuso nelle ossa vomere (in alto) e l'immagine fluorescente dello stesso VNO (in basso). C. Una vista coronale del VNO e dissezione processo. Un VNO è separato dal setto e l'osso vomere può essere rimosso per districare il neuroepitelio. D. VNO è incorporato in LMA. E. Il blocco incorporato è incollato al titolare del tessuto per il sezionamento. Il titolare tessuto è avanzato a 180-200 micron per fetta spingendo il blocco agarosio dalla canna di metallo per il sezionamento. La lama di taglio è posizionato vicino al barile di metallo. Vista laterale F. del sistema VF300 tessuto affettatrice. BV, dei vasi sanguigni. NE, neuroepitelio.
Figura 3 Illustrazione di perfusione di configurazione di sistema. A. Una camera di perfusione tipica con ingresso e uscita. Fetta VNO è posizionato nel centro della camera e premuto con un ancoraggio dei tessuti. I fili vengono rimossi dal mezzo l'ancora del tessuto in modo che il tessuto VNO non è premuto. B. La camera di perfusione è posto sul palco microscopio nell'ambito dell'obiettivo immersione. Il mACSF entrata, uscita di aspirazione e punta perfusione sono indicati. C. Il singolo pompa siringa fornisce un flusso continuo di Ringer attraverso la punta di perfusione. D. Il inje HPLCsistema a ciclo ction è adottato per il carico utile del campione di stimolo e di iniezione. E. schematica illustrazione delle direzioni del flusso di carico e le posizioni di iniezione. Ringer, verde. Stimolo campione, magenta. Le frecce indicano la direzione del flusso. F. Delay e lavare misura del tempo del sistema di perfusione. Rodamina 6G colorante fluorescente viene caricato il ciclo del campione e la valvola è commutata in posizione di iniezione in seconda 5, che è indicato con una freccia. La variazione del segnale fluorescente viene rilevato tra 10-30 secondi e diminuisce in seguito.
Figura 4 pipeline di elaborazione delle immagini. R. Tutti i frame di immagine per una fetta sono registrati nei confronti di un sistema di riferimento. B. Sottrazione di proiezione minima di una pila dai suoi telai prime. Le cellule rispondono diventata di primaria importanza dopo la sottrazione. C. RIO sono selezionati e le loro coordinate sono compilati nella lista principale. D. Misurazione delle cellule rispondono con elenco principale ROI dallo stack prime.
Figura 5 A G-CaMP2 VNO rappresentante esperimento di imaging. R. La ΔF / F heatmap risposta da una fetta stimolato con i singoli urina maschili e femminili. I campioni di urina sono raccolti direttamente presso i singoli topi maschi e femmine. Asse X, rispondendo cellule identificate dalla fetta. Asse Y, campioni di urina utilizzati per l'esperimento. Barra dei colori indica la ΔF / F valore. Corso B. tempo di risposta di 3 celle rappresentante segnato in A. Le frecce indicano il tempo di applicazione dello stimolo. F-FVB, femminile FVB, F-CBA, femminile CBA; M-FVB, maschio FVB; M-BL6, maschio C57BL / 6.
Tabella di reagenti e attrezzature specifiche:
| Nome delreagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| camera di perfusione | Siskiyou | PC-H | orizzontale |
| fetta hold-down | Warner Instruments | SHD-22CL | |
| perfusione porta titolare | ALA scientifica, Inc. | MPIOH-S | |
| pompa siringa | Nuovi sistemi di pompe di Era, Inc. | NE-300 | |
| valvola di iniezione a bassa pressione | Chromtech | V-451 | |
| PEEK tubi | Chromtech | 1531 | 1 / 16 "OD, 0,25 millimetri ID |
| PEEK campione ciclo | Chromtech | 1803 | 20 l |
| Hamilton siringa | Chromtech | 80630 | 100 ul |
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Discussion
La maggior parte dei recettori vomeronasale (VR) rimangono come recettori orfano fin dalla loro scoperta da parte Dulac e Axel 5. I ligandi feromone per questi recettori chemosensoriali e il loro ruolo nel mediare i comportamenti animali non sono ben compresi. Fino ad ora, solo un paio di ligando / recettore, il ESP1 peptide e il suo recettore, Vmn2r116 (V2Rp5), è stato identificato e indicato per trasmettere informazioni specifiche sociale 19,23. Un altro recettore, V1rb2, ha dimostrato di rispondere a 2-eptanone, che presumibilmente si arricchisce nelle urine di topi di sesso femminile 24. Tuttavia, le informazioni specifiche trasmessa da questo ligando rimane poco chiaro. Il metodo che abbiamo sviluppato qui consente la caratterizzazione delle risposte VNO neurone a un gran numero di stimoli e l'analisi dei pattern di attivazione. Utilizzando questo metodo, abbiamo trovato che le cellule mostrano risposte specifiche alle urine maschio o femmina e che ci possono essere dedicata celle funzionanti a riconosceresesso spunti feromone specifico 15. Il VR espresso su queste cellule devono ancora essere identificati. Il metodo di imaging qui descritte non solo permette la proiezione di ligandi feromone presente nelle urine, ma anche facilitare l'identificazione dei recettori specifici che rispondono ai segnali feromoni.
G-CAMP famiglia di sensori di calcio sono stati utilizzati in una varietà di sistemi animali e loro segnali hanno dimostrato di ben correlata con transienti di calcio 25-28. L'uso di organismi geneticamente codificato sensore fornisce una lettura sensibile delle risposte neuronali e permette l'espressione specifica del sensore in tessuto mirate e tipo di cellula. Il geneticamente codificato sensori permettono anche per l'imaging cronica di animali vivi. Tradizionalmente, coloranti calcio sintetici sono stati utilizzati per monitorare la risposta di calcio. Le procedure di carico colorante sono inevitabilmente invasiva e spesso causa di danni ai tessuti. Carico non uniforme e limitata penetrazione del colorante nel TISSue influenzare significativamente la rilevazione dei segnali di calcio.
Nel nostro esperimento usando G-CaMP2 topi, troviamo che l'ampiezza delle risposte è alla pari con, o meglio, il calcio-colorante metodi di carico nelle preparazioni fetta. Le fette VNO possono essere mantenuti in buone condizioni di salute per ore dopo sezionamento permettere così l'analisi di un gran numero di stimoli in un unico esperimento. Tuttavia, i sensori geneticamente codificato spesso contengono domini di proteine che possono potenzialmente interagire con i componenti cellulari di modificare modelli di risposta o addirittura influenzare il normale sviluppo dell'organismo. Bisogna essere cauti quando un nuovo sensore viene introdotto in un sistema. Un attento esame del tessuto bersaglio è richiesto. Nei nostri studi precedenti, abbiamo esaminato il G-CaMP2 topi per i loro comportamenti innati, le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni VNO e gli schemi di proiezione dei neuroni sensoriali olfattivi 15. Nessuno di questi aspetti sono colpiti in G-CaMP2 topi. Tuttavia, l'uso di animali transgenici è soggetto costo aggiuntivo per la manutenzione degli animali e genotipizzazione. Inoltre, gli esperimenti sono limitati alle linee disponibili generato. Questi sono i fattori che devono essere presi in considerazione durante la progettazione di esperimenti.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Andrea Moran insieme con i membri del Centro di Assistenza Animal Lab (LASF) a Stowers Institute per il loro supporto eccellente per la zootecnia e dei servizi tecnici. Questo lavoro è supportato da un finanziamento Stowers Institute e il NIH (dell'NIDCD 008.003) a piangere. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione o il National Institutes of Health. Usa in attesa di brevetto per il Teto-G-CaMP2 topi per Stowers Institute, CRY e LM.
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