Summary
Den vomeronasal organ (VNO) registrerer intraspecies kjemiske signaler som formidler sosiale og reproduktive informasjon. Vi har utført Ca2 + bildebehandling eksperimenter ved hjelp av transgene mus som uttrykker G-Camp2 i VNO vev. Denne tilnærmingen gjør det mulig for oss å analysere kompliserte reaksjonsmønstrene av vomeronasal nerveceller til et stort antall feromon stimuli.
Abstract
Den vomeronasal organ (VNO) oppdager chemosensory signaler som frakter informasjon om de sosiale, seksuelle og reproduktive status for individer innen samme art 1,2. Disse intraspecies signaler, den feromoner, samt signaler fra enkelte rovdyr 3, aktivere vomeronasal sensoriske nevroner (VSNs) med høy spesifisitet og sensitivitet fire. Minst tre ulike familier av G-protein koblede reseptorer, V1R, V2R og FPR 5-14, uttrykkes i VNO neurons å megle påvisning av chemosensory signaler. For å forstå hvordan feromon informasjon er kodet av VNO, er det avgjørende å analysere responsen profiler av individuelle VSNs til ulike stimuli og identifisere spesifikke reseptorer som formidler disse svarene.
Den neuroepithelia av VNO er vedlagt i et par vomer bein. Den semi-blind rørformet struktur VNO har én åpen ende (den vomeronasal kanalen) tilkobling tilnesehulen. VSNs utvide sine dendritter til lumen delen av VNO, der pheromone pekepinner er i kontakt med reseptorer uttrykt på dendrittiske knottene. Cellen organer VSNs skjemaet pseudo-lagdelt lag med V1R og V2R uttrykt i apikale og basal lag henholdsvis 6-8. Flere teknikker har blitt brukt til å overvåke respons av VSNs til sensoriske stimuli 4,12,15-19. Blant disse teknikkene, tilbyr akutt slice forberedelse flere fordeler. Først sammenlignet med dissosiert VSNs 3,17, slice forberedelser opprettholde bo nevronene i sitt hjemland morfologi og dendritter i cellene relativt intakt. Sekund, cellen organer VSNs er lett tilgjengelige i koronale bit av VNO å tillate elektrofysiologi studier og bildebehandling eksperimenter i forhold til hele epitel og hel-mount forberedelser 12,20. Tredje kan denne metoden kombineres med molekylær kloning teknikker for å tillate reseptor identifisering.
Sensorisk stimulering utløser sterke Ca 2 + tilstrømning i VSNs som indikerer at receptor aktivering 4,21. Dermed har vi utvikle transgene mus som uttrykker G-Camp2 i olfactory sensoriske nevroner, inkludert VSNs 15,22. Følsomheten og den genetiske naturen av sonden i stor grad forenkle Ca 2 + bildebehandling eksperimenter. Denne metoden har eliminert fargestoff lasting prosessen brukt i tidligere studier 4,21. Vi benytter en ligand levering system som muliggjør bruk av ulike stimuli til VNO skiver. Kombinasjonen av de to teknikkene gjør at vi kan overvåke flere nevroner samtidig som svar på et stort antall stimuli. Endelig har vi etablert et semi-automatisert analyse rørledning for å bistå bildebehandling.
Protocol
1. Løsning forberedelse
- Forbered 10X R1, R2 10X og 10X R3 løsninger i henhold til tabellen.
R1Kjemikalier MW (g / mol) mM (1X) 10X lager (g / L) NaCl 58.44 125 73.05 KCl 74.55 2.5 1,86 MgCl 2 1 M lager 1 10 ml CaCl 2 · 2H 2 O 147,02 2 2,94 NaH 2 PO 4 · H 2 O 137,99 1,25 1,72
R2Kjemisk MW (g / mol) mM (1X) 10X lager (g / L) NaHCO 3 84.01 25 21
R3Kjemikalier MW (g / mol) mM (1X) 10X lager (g / L) NaCl 58.44 125 73.05 KCl 74.55 2.5 1,86 MgCl 2 1 M lager 2 20 ml CaCl 2 · 2H 2 O 147,02 2 2,94 HEPES 1 M lager 5 50 ml - Lag 1 liter mus kunstig cerebrospinalvæsken (mACSF) dagen av eksperimentet ved å blande 100 ml 10X R1 og 100 ml 10X R2 i dobbelt destillert vann (DDW) og add 1,8 g dextrose (siste 10 mM). Dette preparatet metoden hindrer kalsiumkarbonat nedbør ved høy pH. Den osmolaritet av mACSF er rundt 310-315 mOsm / L. Juster osmolaritet med druesukker eller vann om nødvendig. Luft løsningen med Carboxygen gass (95% oksygen og 5% karbondioksid) i minst 30 minutter før du justerer pH av løsningen på 7.2 til 7.4.
- Lag 1 liter Ringer-løsning på dagen av eksperimentet ved å blande 100 ml 10X R2 og 100 ml 10X R3 i DDW og tilsett 1,8 g dextrose (10 mm). Den osmolaritet og pH i Ringer løsning bør være lik de av mACSF. Luft løsningen med Carboxygen gass.
- Forbered 4% lavt smeltepunkt agarose (LMA) i enten mACSF eller Ringer-løsning. Delmengde smeltet agarose i Eppendorf rør og oppbevar ved 4 ° C til bruk. LMA, som består av renset polysakkarid, forblir flytende ved 37 ° C og stivner raskt ved temperatur under 25 ° C. Disse egenskapene gjør det ideelt for innebygging VNO og leve vev fysiologi. Andre urene materialer som agar, ikke bør være valget for live tissue eksperiment uncharacterized komponenter kan forstyrre nerveaktivitet.
- Forbered feromon stimuli i Ringer løsning. For mus urin, 1:100 fortynning gi opphav til robuste svar.
2. Utarbeidelse av VNO skive
- Før ofre dyret, satte to tuber LMA på en varme blokk og sette temperaturen til> 60 ° C for å smelte agarose. Når geleen blir flytende, overføre rørene til et 37 ° C varme blokk.
- Halshogge en G-Camp2 mus følgende CO 2 dødshjelp. Skjær kjeven bein med saks for å fjerne underkjeven. Trekk av ridged øvre gane vev for å avsløre nesehulen (figur 1A). Skill jawbones ved å sette inn et kirurgisk kniv mellom de to foran fortennene. Fjern forsiktig jawbones å avsløre VNO. På dette punktet, kan hele VNO bli løftet opp fra nasal hulrom ved å holde på halebeinet (Figur 1B). Overfør VNO for kaldt oksygenrikt mACSF løsning umiddelbart.
- Under disseksjon omfang, skille de to VNOs ved å bruke tuppen av # 5 tang forsiktig gli langs veggen septal bein (figur 1C). Skrell bort vomer bein som omgir VNO vev. Løft forsiktig hele VNO vev fra benet hulrom. Ekstrem forsiktighet bør utvises i dette trinnet ikke skader neuroepithelium. Små bein fragmenter igjen på vevet overflaten må fjernes helt før innebygging. Fragmenter igjen på vevet kan bli fanget av kniven til å trekke vevet ut av agarose blokken.
- Bruk pinsett til å holde den bakre enden av VNO vev og forsiktig senk den i smeltet agarose (figur 1D). Raskt kjøle røret på is for å stivne i agarose. Den embedding og kjøling prosessen bør ta mindre enn 2 minutter.
- VF300 vev slicer (Precisionary Instruments, Greenville, NC) brukes til å lage seksjoner. Kutt agarose blokken inneholder VNO i form og lim den til vevet holderen (Figur 1E og F). Sett vevet holderen i metallet sylinderen og fyll resten av kammeret med ekstra LMA. Når LMA stivner på is, fortsett til seksjonering umiddelbart. Forsyning kaldt oksygenrikt mACSF inn seksjonering kammer og begynne å kutte på 180-200 mikrometer tykkelse per skive. Juster fremrykkende hastighet og vibrasjon frekvens, slik at vevet ikke blir komprimert under seksjonering og VNO ikke faller av fra agarose. Samle og overføre seksjonert skiver til mACSF inkubering kammeret (Figur 2A). Skivene er levedyktige i 6-8 timer i oxygenated mACSF ved romtemperatur. Show Figur 2B og C DIC og 2-foton bilder av en G-Camp2 VNO slice, henholdsvis.
3. Imaging kammer satt opp
- Plasser VNO skive i midten av perfusjonkammer (Siskiyou, Grants Pass, OR) og hold skive ned med en skive anker (Warner Instruments, Hamden, CT) (figur 3A). Gjengene på ankeret bør bare trykk mot LMA del av stykket, men ikke VNO vev. Oksygenerte mACSF blir levert til perfusjon kammeret gjennom innløpet port på ~ 100 mL / sek, og væsken blir drenert gjennom en suge nål via luftutblåsningsåpningen å gi en kontinuerlig strøm av frisk mACSF (figur 3A og B).
- Fyll en 30 ml sprøyte med Ringer-løsning og klemme den til Sprøytepumpe (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY). Sett pumpehastigheten til 300-600 mL / min for å gi en kontinuerlig strøm av Ringer løsning over slice (Figur 3C).
- Koble utløpet av Ringer til en HPLC injeksjon løkke (Chromtech, Apple Valley, MN) (Figur 3D). Ulike sløyfe størrelse kan velges for presis kontroll av volumet blir levert. Vi bruker en 20 mL sløyfe i our eksperimenter. Injeksjonen sløyfe-regulering har to flow ruter (Figur 3E). På "load" posisjon, kan prøvene legges i prøven ring med Hamilton presisjon sprøyte. Overskytende prøve avslutter prøven løkken gjennom avløpet. Ringer løsning injisert ved Sprøytepumpe omgår prøven loop og går direkte til uttaket, som er koblet til perfusjon spissen (figur 3A og E). På "injeksjon" posisjon, flyter pumpen løsning gjennom prøven løkken og skyv stimuli inn i uttaket (Figur 3E). Før bildebehandling eksperimentere, bør luftbobler bli jaget ut for å sikre jevn flyt av perfusjon væske. Andre kommersielle eller skreddersydde innsprøytningssystemer kan også gjennomføres for stimulans levering.
- Juster perfusjon spissen under en 5x eller 10x linse slik at tuppen er ca 1 mm fra VNO skive.
- Når en ny perfusjon system er satt opp, er det tilrådelig å måle prøven forsinkelsestid og durasjon med fluorescerende fargestoff. Load 0,1% rhodamine 6G fargestoff i prøven løkke og bytte ventilen å injisere posisjon på 5 sekunder etter starten av Image Acquisition (Figur 3F). Den fluorescerende signal mellom 10-30 sekunder. Den jevn kurve av fluorescerende signal indikerer også at det er lite turbulens genereres under dyppe linsen og at tilstrekkelig perfusjon av oksygenert mACSF når skive.
Fire. Time Lapse bildebehandling
- Vi bruker Zeiss AxioSkope FS2 mikroskop med en 10X eller 20X vann-dipping objektiv for tidsinnstilte imaging. Standard GFP båndpassfilter (450-490nm) brukes for G-Camp2 signaler. Den epifluorescent bildene blir overtatt av en CCD-kamera (Zeiss HRM) med 1X1 eller 2x2 Binning avhengig uttrykket nivåer av G-Camp2.
- Still oppkjøpet hastigheten til 1 bilde per sekund. Juster intensiteten av lyset for å minimere bleking av G-Camp2 signaler og foto skader på cellene. For hver experiment vi normalt få en 60-ramme bildestakk (~ 60-70 sekunder). Bytt ventilen til injeksjon posisjon på et bestemt tidspunkt (f.eks, 5 andre i Figur 3F) for ett sett med forsøk for å oppnå konsistente tidsforsinkelsen i alle studier.
- Utfør en testkjøring med Ringer-løsning som stimulans. Re-juster perfusjon setup hvis bevegelsen artefakt er introdusert i løpet prøve injeksjon.
- Utfør en positiv kontroll kjøre med mus urinen utvannet 1:100 i Ringer løsning. Den typiske maksimale ΔF / F verdi på G-Camp2 respons på mus urinen er rundt 20-40%. Ved behov kan man bekrefte levedyktigheten til stykket ved å levere 10 mM KCl i Ringer å stimulere skiver på slutten av forsøkene.
- Vask Hamilton sprøyten i Ringer løsning minst tre ganger etter lasting en stimulus. Vask prøven bue med Ringer løsning minst tre ganger mellom ulike stimuli. Disse trinnene forhindrer krysskontaminering blant different prøver.
- Vent for 4-10 min for VSNs å gjenopprette før du påfører neste stimulus.
5. Dataanalyse
- Utfør image registrering av alle bildene anskaffet fra en skive. Vi bruker en custom-skrevet VBA script i AxioVision (Carl Zeiss, Nord-Amerika) å automatisere denne prosessen. All image rammer innenfor det samme eksperimentet er registrert mot en felles valgt referansesystem med elastisk registrering (Figur 4A). Elastisk registrering, også kjent som ikke-lineær registrering, er en kategori av bildet registrering teknikk understreker transformasjon av et målbildet ikke strengt til en referanse bilde. Her har vi brukt gjennomføringen fra AxioVision.
Denne referansen rammen er valgt tilfeldig fra bildet stabler. - Utfør image subtraksjon å identifisere svare cellene. Vi bruker tilpassede skrevet makroer i ImageJ v1.42 ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ , NIH, Bethesda, MD) til å automatisere denne prosessen. En minimal projeksjon bildet er generert for hver stabel. Svare celler oppstår etter minimal projeksjon er trukket fra rå stacks (Figur 4B).
- Identifisere område av interesse (ROI) fra trekkes stabler og få ROI koordinater ved hjelp Multi-Mål plugin fra ImageJ. Behandle alle stabler for ett eksperiment og lagre alle ROI koordinater i en ROI hovedlisten (Figur 4C).
- Bruk ROI hovedlisten å måle celle responser fra rå image stabler med tilpasset skriftlig makro og Multi-Mål plugin fra ImageJ (Figur 4D). Plot respons kurver og heatmap i Matlab (MathWorks Inc., Natick, MA).
Seks. Representant Resultater
Et eksempel på VNO bildebehandling eksperiment ved hjelp av urinprøver innsamlet fra fire individuelle mus er vist i figur 5. Stykket reagerer på urin stimulering med ulike patterns av aktivering. Rundt 80 celler er identifisert viser respons på minst ett av urinen stimuli og respons ΔF / F verdier er plottet i heatmap (Figur 5A). Responsen spor av celler 1, 2 og 3 er plottet i figur 5B viser tiden kurset aktivering av urin stimuli. Cell 1 viser responsen til både kvinnelige urinprøver, men ikke den mannlige prøvene, mens celle 2 viser det motsatte mønstrene for aktivering og reagerer på både mannlige prøver bare. Cell 3 blir aktivert av både individuelle mannlige og kvinnelige prøver. Celler 1 og 2 viser karakteristiske respons på sex spesifikke pekepinner i urinen 15.
Figur 1 Skjematisk illustrasjon av VNO disseksjon prosess. A. anatomisk lokalisering av VNO i musen hodet. Leder av en G-Camp2 musen har blitt dissekert og er lagt opp ned med den myke tproblemet fjernet fra ganen å avdekke VNO. Innløp viser et fluorescerende bilde av det samme bildet. Den neuroepithelia av VNO er lyse grønt. B. En side visning av isolerte VNO som er vedlagt i vomer benet (øverst) og fluorescerende bilde av samme VNO (nederst). C. En koronale visning av VNO og disseksjon prosess. Ett VNO skilles fra septum og vomer bein kan deretter fjernes for å frigjøre den neuroepithelium. D. VNO er innebygd i LMA. E. Den innebygde blokken er limt til vevet holder for snitting. Vevet holderen er avansert på 180-200 mikrometer per skive skyve agarose blokk ut av metall fat for snitting. Kniven er plassert tett til metallet fat. F. Sidevisning av de VF300 vev slicer system. BV, blodkar. NE, neuroepithelium.
Figur 3 Illustrasjon av perfusjon systemoppsettet. A. En typisk perfusjon kammer med innløp og utløp. VNO Slice er plassert i sentrum av kammeret og presset ned med en vev anker. Den midterste trådene er fjernet fra vevet anker slik at VNO vevet ikke er trykket. B. perfusjon kammeret er plassert på mikroskop scenen under dypping målet. Den mACSF innløp, suging utløp og perfusjon tips er indikert. C. Singelen fat sprøytepumpe gir kontinuerlig flyt av Ringer gjennom perfusjon spissen. D. HPLC injection løkke system er vedtatt for praktisk stimulans prøve lasting og injeksjon. E. Skjematisk illustrasjon av flyten retninger ved lasting og injeksjon posisjoner. Ringer, grønn. Stimulus sample, magenta. Pilene viser retningen av flyten. F. Delay og vask av tid måling av perfusjon systemet. Rhodamine 6G fluorescerende fargestoff er lastet til prøven loop og ventilen er byttet til injeksjon posisjon på femte sekund, som er indikert med en pil. Den fluorescerende signal endringen er registrert mellom 10-30 sekunder og minker etterpå.
Figur 4 Bildebehandling rørledningen. A. Alle image rammer for en skive er registrert mot en referanseramme. B. Subtraksjon av minimal projisering av en bunke fra sin rå rammer. Svare celler blir fremtredende etter subtraksjon. C. ROIS er valgt og deres koordinater er kompilert inn i hovedlisten. D. Måling av respons celler ved hjelp av ROI hovedlisten fra rå stabelen.
Figur 5. En representant G-Camp2 VNO bildebehandling eksperiment. A. ΔF / F respons heatmap fra en skive stimuleres med individuelle mannlige og kvinnelige urin. Urinprøver samles fra individuelle mannlige og kvinnelige mus. X-aksen, reagerer celler identifisert fra skive. Y-aksen, urinprøver brukes i forsøket. Color bar indikerer ΔF / F verdi. B. Responstid løpet av tre representative celler merket A. Pilene angir tidspunktet for stimulus søknad. F-FVB, kvinnelige FVB; F-CBA, kvinnelige CBA, M-FVB, mannlige FVB; M-BL6, mannlige C57BL / 6.
Tabell over spesifikke reagenser og utstyr:
| Navn påreagens | Firma | Katalognummer | Kommentarer (valgfritt) |
| perfusjon kammer | Siskiyou | PC-H | horisontale |
| slice hold-ned | Warner Instrumenter | SHD-22CL | |
| perfusjon port holder | ALA vitenskapelig, Inc. | MPIOH-S | |
| sprøytepumpe | New Era Pump Systems, Inc. | NE-300 | |
| lavtrykk injeksjon ventil | Chromtech | V-451 | |
| PEEK tubing | Chromtech | 1531 | 1 / 16 "OD, 0,25 mm ID |
| PEEK sample sløyfe | Chromtech | 1803 | 20 mL |
| Hamilton sprøyte | Chromtech | 80630 | 100 mL |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flertallet av vomeronasal reseptorer (VRS) forblir som foreldreløs reseptorer siden deres oppdagelse av Dulac og Axel 5. Den feromon ligander for disse chemosensory reseptorene og deres roller i formidling av dyreatferd er ikke godt forstått. Til nå har bare ett par av ligand / reseptor, de ESP1 peptid og beslektet reseptor, Vmn2r116 (V2Rp5), blitt identifisert og vist seg å formidle bestemte sosiale informasjon 19,23. En annen reseptor, V1rb2, har vist seg å svare til 2-Heptanone, som antagelig er beriket i urin fra hunnmus 24. Imidlertid fortsatt den spesifikke informasjonen formidles av denne ligand uklar. Den metoden vi har utviklet her gjør karakterisering av VNO neuron svar på et stort antall stimuli og analyse av mønstre av aktivering. Ved å bruke denne metoden, har vi funnet at celler vise konkrete svar på mannlig eller kvinnelig urin og at det kan være dedikert celler fungerer å gjenkjennesex spesifikke feromon pekepinner 15. VR uttrykt på disse cellene er ennå ikke identifisert. Imaging Metoden beskrevet her ikke bare tillater screening av feromon ligander tilstede i urinen, men også lette identifikasjon av spesifikke reseptorer som reagerer på feromon pekepinner.
G-camp familie av kalsium sensorer har vært brukt i en rekke dyre systemer og deres signaler har vist seg å korrelere godt med kalsium transienter 25-28. Bruk av genetisk kodet sensor gir en følsom avlesning av neuronal svarene og tillater spesifikke uttrykk av sensoren i målrettede vev og celle type. Den genetisk kodet sensorer også gjøre det mulig for kronisk bildebehandling i levende dyr. Tradisjonelt har syntetisk kalsium fargestoffer blitt brukt til å overvåke kalsium respons. Fargestoff lasting prosedyrer er uunngåelig invasive og ofte forårsaker skade på vev. Ujevn lasting og begrenset penetrasjon av fargestoff i Tissue også betydelig innvirkning på påvisning av kalsium signaler.
I vårt eksperiment ved hjelp av G-Camp2 mus, finner vi at amplituden av svarene er på linje med eller bedre enn, kalsium-dye lasting metoder i skive forberedelsene. Den VNO skiver kan opprettholdes i en sunn tilstand i flere timer etter seksjonering dermed tillate analysene av store antall stimuli i ett eksperiment. Men genetisk kodet sensorer inneholder ofte protein domener som potensielt kan samhandle med cellulære komponenter for å endre reaksjonsmønstrene eller selv påvirke den normale utviklingen av organismen. Man må være forsiktig når en ny sensor er introdusert inn i et system. Grundig undersøkelse av målrettede vev er nødvendig. I våre tidligere studier har vi undersøkt G-Camp2 mus for sine medfødte atferd, de elektrofysiologiske egenskapene til VNO nevroner og projeksjonen mønstre av olfactory sensoriske nevroner 15. Ingen av disse aspektene er berørt i G-Camp2 mus. Likevel ikke pådra bruker transgene dyr ekstrakostnad for dyr vedlikehold og genotyping. I tillegg er eksperimenter begrenset til de tilgjengelige linjene generert. Dette er faktorer som må tas hensyn til ved utformingen eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Andrea Moran sammen med medlemmer av Lab Animal tjenesten Facility (LASF) ved Stowers institutt for deres utmerkede support på husdyrhold og tekniske tjenester. Dette arbeidet er støttet av midler fra Stowers institutt og NIH (NIDCD 008 003) til å gråte. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn av National Institute on døvhet og Other Communication Disorders eller National Institutes of Health. USA patentsøkt for tetO-G-Camp2 mus for Stowers Institute, gråte og LM.
References
- Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
- Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
- Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
- Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
- Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
- Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
- Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
- Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
- Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
- Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
- Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
- He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
- Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
- Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
- Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
- He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
- Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
- Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
- Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
- Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
- Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
