Summary
Вомероназального орган (ВНО) обнаруживает внутривидовой химические сигналы, которые передают социального и репродуктивного информации. Мы провели Ca2 + изображений экспериментов с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих G-CaMP2 в ткани ВНО. Такой подход позволяет нам анализировать сложные узоры реакция вомероназального нейроны большим количеством феромона раздражители.
Abstract
Орган вомероназального (ВНО) обнаруживает хемосенсорных сигналы, которые несут информацию о социальной, сексуальной и репродуктивного статуса лиц в пределах одного вида 1,2. Эти внутривидовых сигналов, феромоны, а также сигналы от некоторых хищников 3, активировать вомероназального сенсорных нейронов (VSNs) с высоким уровнем специфичности и чувствительности 4. По меньшей мере три различных семейства G-белком рецепторы, V1R, V2R и FPR 5-14, выражаются в нейронах ВНО посредничать обнаружения хемосенсорных сигналы. Чтобы понять, как феромон информация кодируется ВНО, очень важно проанализировать ответ профилей отдельных VSNs на различные раздражители и идентифицировать специфические рецепторы, которые опосредуют эти ответы.
Neuroepithelia о ВНО в нем заключаются в пару костей уотег. Полу-слепой трубчатые структуры ВНО имеет один открытый конец (вомероназального протока) подключение кполости носа. VSNs расширить свои дендриты в просвете части ВНО, где феромона сигналы находятся в контакте с рецепторами, высказанные на дендритных ручки. Клеточных тел VSNs форме псевдо-стратифицированных слоев с V1R и V2R выражается в апикальных и базальных слоев соответственно 6-8. Несколько методов были использованы для контроля ответов VSNs на сенсорные стимулы 4,12,15-19. Среди этих методов, острый срез подготовка имеет ряд преимуществ. Во-первых, по сравнению с диссоциированных VSNs 3,17, ломтик подготовку поддерживать нейроны в их родном морфологии и дендриты клетки остаются относительно нетронутыми. Во-вторых, клеточных тел VSNs были легко доступны в корональной кусочек ВНО, чтобы электрофизиологии исследований и экспериментов изображения по сравнению с целого эпителия и весь монтаж подготовки 12,20. В-третьих, этот метод может быть объединена с молекулярных методов клонирования, чтобы рецептор идентификации.
Сенсорная стимуляция вызывает сильную Са 2 + приток в VSNs, что свидетельствует об активации рецептора 4,21. Таким образом, разработка трансгенных мышей, которые выражают G-CaMP2 в обонятельной сенсорных нейронов, в том числе VSNs 15,22. Чувствительность и генетической природы зонда значительно облегчит Са 2 + изображений экспериментов. Этот метод устранил красителя процесса загрузки, используемых в предыдущих исследованиях 4,21. Мы также используют системы лиганд доставки, которая дает возможность применения различных стимулов к ВНО ломтиками. Сочетание двух методов позволяет следить за несколькими одновременно нейронов в ответ на большое количество раздражителей. Наконец, мы установили полуавтоматические анализа трубопровода, чтобы помочь обработки изображений.
Protocol
1. Решение подготовки
- Подготовка 10X R1, R2 и 10X 10X R3 решения в соответствии с таблицей.
R1Химические вещества МВт (г / моль) мМ (1X) 10X акций (г / л) NaCl 58,44 125 73,05 KCl 74,55 2,5 1,86 MgCl 2 1 М акции 1 10 мл CaCl 2 · 2H 2 O 147,02 2 2,94 NaH 2 PO 4 · H 2 O 137,99 1,25 1,72
R2Химический МВт (г / моль) мМ (1X) 10X акций (г / л) NaHCO 3 84,01 25 21
R3Химические вещества МВт (г / моль) мМ (1X) 10X акций (г / л) NaCl 58,44 125 73,05 KCl 74,55 2,5 1,86 MgCl 2 1 М акции 2 20 мл CaCl 2 · 2H 2 O 147,02 2 2,94 HEPES 1 М акции 5 50 мл - Сделать 1 литр мыши искусственной спинномозговой жидкости (mACSF) на день эксперимента путем смешивания 100 мл 10X R1 и 100 мл 10X R2 в бидистиллированной воды (DDW) и объявленияг 1,8 г декстрозы (конечная 10 мм). Этот препарат предотвращает методом осаждения карбоната кальция при высоких рН. Осмолярность mACSF составляет около 310-315 мОсм / л Отрегулируйте осмолярности декстрозы или с водой, если это необходимо. Проветрить решение с Carboxygen газа (95% кислорода и 5% углекислого газа), по крайней мере 30 минут перед регулировкой рН раствора до 7,2-7,4.
- Сделать 1 л раствора Рингера в день эксперимента путем смешивания 100 мл 10X R2 и 100 мл 10X R3 в DDW и добавить 1,8 г декстрозы (10 мм). Осмолярность и рН раствора Рингера должны быть аналогичны mACSF. Проветрить решение с газом Carboxygen.
- Подготовка 4% низкой температурой плавления агарозы (LMA) в любом mACSF или раствора Рингера. Алиготе расплавленной агарозы в Эппендорф труб и хранить при температуре 4 ° С до использования. LMA, которая состоит из очищенного полисахарида, остается жидкостью при температуре 37 ° С и затвердевает быстро при температуре ниже 25 ° C. Эти свойства делают его идеальным для встраивания В.Н.O и жить физиологии ткани. Другие материалы нечистым, такие как агар, не должно быть выбором для живой ткани, как эксперимент неохарактеризованных компоненты могут вмешиваться в нейронной ответ.
- Подготовка феромона стимулы в растворе Рингера. Для мыши мочи, 1:100 разбавления приводит к надежной ответы.
2. Подготовка ломтик ВНО
- Прежде чем пожертвовать животным, положил два тюбика LMA на тепло блока и установить температуру до> 60 ° C, чтобы расплавить агарозы. Как только гель разжижается, передачу трубы для 37 ° C тепла блока.
- Обезглавьте G-CaMP2 мыши следующие CO 2 эвтаназии. Вырезать кости нижней челюсти с помощью ножниц для удаления нижней челюсти. Снимите верхнюю ребристых ткани неба, чтобы разоблачить носовой полости (рис. 1А). Отдельные челюсти, вставив хирургические лезвия между двумя передними резцами. Осторожно снимите челюсти подвергать ВНО. На данный момент, все ВНО может вознесен буду от пАСАЛ полости, держа на копчик (рис. 1б). Передача ВНО к холоду кислородом решение mACSF немедленно.
- Под вскрытие масштабов, разделения двух ВНО с помощью кончика # 5 пинцетом аккуратно сдвиньте вдоль стены перегородки кости (рис. 1в). Очистите от костей, сошника encases ткани ВНО. Аккуратно поднимите весь ткани ВНО из костной полости. Экстремальные следует позаботиться на этом этапе, чтобы не повредить нейроэпителия. Малые фрагменты костей остается на поверхности ткани должны быть удалены полностью перед вложением. Фрагменты слева на ткани может быть пойман лезвия тянуть ткань из блока агарозы.
- Используйте пинцет, чтобы удерживать заднем конце ткани ВНО и мягко погрузите его в расплавленный агарозы (рис. 1D). Быстро охладить пробирку на льду укрепить агарозы. Вложения и охлаждения процесс должен занимать не более 2 минут.
- VF300 ткани слайсер (Precisionary Instruments, Гринвилл, Северная Каролина) используется для создания разделов. Вырезать блок агарозном содержащие ВНО по форме и приклеить ее к ткани держателя (рис. 1E и F). Вставьте держатель ткани в металлический цилиндр и заполнить оставшиеся камеры с дополнительными LMA. После LMA застывает на льду, переходите к секционирования немедленно. Поставка холодной кислородом mACSF в секционирования камеру и начать сокращать на 180-200 мкм толщины на срез. Отрегулируйте продвижения скорость и частоту колебаний так, чтобы ткань не сжимается во время секционирования и ВНО не отваливается от агарозы. Сбор и передача секционного ломтиками, чтобы mACSF инкубации камеры (рис. 2A). Ломтики жизнеспособность в течение 6-8 часов в mACSF кислородом при комнатной температуре. Рис. 2Б и С показывают, DIC и 2-фотонного изображения G-CaMP2 ломтик ВНО, соответственно.
3. Изображениями камера создана
- Место среза ВНО в середине перфузиикамеры (Siskiyou, Грантс-Пасс, Орегон) и удерживать часть вниз с кусочком якорь (Warner Instruments, Hamden, CT) (рис. 3А). Нити якорь достаточно нажать на части LMA среза, а не ткани ВНО. Кислород mACSF доставляется перфузии камеру через входное отверстие при ~ 100 мкл / сек, и жидкость сливают через всасывающие иглу через выходное отверстие, чтобы обеспечить непрерывный поток свежего mACSF (рис. 3А, Б).
- Заполните шприц 30 мл с раствором Рингера и зажмите его в шприц насосом (Нью Системс насоса эры, Farmingdale, Нью-Йорк). Установить скорость насоса на 300-600 мкл / мин обеспечить непрерывный поток раствора Рингера над сектором (рис. 3С).
- Подключите выход Рингера для инъекций ВЭЖХ петли (Chromtech, Apple Valley, MN) (рис. 3D). Различные размер петли могут быть выбраны для точного контроля объема доставляется. Мы используем 20 мкл цикл в оУра экспериментов. Контроль инъекции цикл имеет два потока маршрутов (рис. 3Е). В "нагрузку" положение, образцы могут быть загружены в пример цикла с помощью шприца точностью Гамильтон. Избыточный выход образец образец цикле отходов розетки. Раствор Рингера вводят путем шприцевой насос обходит образец петлю и идет непосредственно в розетку, которая связана с перфузии наконечник (рис. 3А и Е). В "инъекции" положении, насос решение проходит через образец петли и нажмите стимулы в розетку (рис. 3Е). До визуализации эксперимента, пузырьки воздуха должны быть изгнаны, чтобы обеспечить плавное течение перфузионной жидкости. Другие коммерческие или на заказ системы впрыска топлива также может быть реализован для стимулом доставки.
- Отрегулируйте перфузии наконечник под 5х или 10х объектив так, чтобы кончик составляет около 1 мм от среза ВНО.
- При новой системе перфузии установки, рекомендуется для измерения времени задержки и образец мажорation с флуоресцентным красителем. Нагрузка 0,1% красителя родамина 6G в образец петли и переключатель клапан для введения позиции на 5 секунд после начала захвата изображения (рис. 3F). Флуоресцентный сигнал обнаружен в пределах 10-30 секунд. Гладкая кривая флуоресцентного сигнала также указывает, что существует мало турбулентности, генерируемой при погружение линзы и что адекватной перфузии кислородом mACSF достигает среза.
4. Временной интервал изображения
- Мы используем Zeiss AxioSkope FS2 микроскоп с 10X или 20X воды нагишом линзы на время визуализации недействительной. Стандартный GFP полосовой фильтр (450-490nm) используется для G-CaMP2 сигналов. Epifluorescent изображения приобретена ПЗС-камера (Zeiss HRM) с 1x1 или 2x2 биннинга в зависимости от уровня экспрессии G-CaMP2.
- Установить приобретения скорости 1 кадр в секунду. Отрегулируйте интенсивность света, чтобы свести к минимуму отбеливания G-CaMP2 сигналов и фото повреждения клеток. Для каждого бывшегоЭксперимент, мы обычно приобретают 60-кадр стека (~ 60-70 секунд). Переключатель клапана инъекции позиции в конкретный момент времени (например, 5 секунд на рис 3F) за один комплект эксперимент, чтобы получить последовательное время задержки во всех испытаниях.
- Выполните тест выполняется с использованием раствора Рингера, как стимул. Подрегулировать перфузии установка, если движение артефакт вводится в образец инъекций.
- Выполните позитивный контроль запуска с помощью мыши моче растворенный в 1:100 в растворе Рингера. Типичные максимальной f / F значение G-CaMP2 ответ на мышь моче составляет около 20-40%. При необходимости, можно подтвердить жизнеспособность срез, обеспечивая 10 мМ KCl в Рингера, чтобы стимулировать ломтики в конце эксперимента.
- Промыть шприц Гамильтон в растворе Рингера не менее трех раз после загрузки одного раздражителя. Промыть образец петля с раствором Рингера крайней мере три раза между различными стимулами. Эти меры предотвращения перекрестного загрязнения между differeнт образцов.
- Подождите 4-10 мин для VSNs для восстановления перед нанесением следующего стимула.
5. Анализ данных
- Выполнить изображение регистрацию всех изображений, полученных от одного среза. Мы используем специально написанный сценарий VBA в AxioVision (Carl Zeiss, Северная Америка), чтобы автоматизировать этот процесс. Все кадры изображения в пределах одного эксперимента являются зарегистрированными против общего выбранной системы отсчета с упругими регистрации (рис. 4А). Упругие регистрации, также известный как нелинейные регистрации, категория регистрации изображений технику подчеркнув, преобразование изображения цели, не жестко эталонного образа. Здесь мы использовали реализацию из AxioVision.
Это отсчета выбирается произвольно из образа стеков. - Выполните вычитания изображений для идентификации ответа клеток. Мы используем пользовательские макросы в письменной ImageJ v1.42 ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ , NIH, Bethesda, MD), чтобы автоматизировать этот процесс. Минимальный проецирования изображения создается для каждого стека. Отвечая клетки появляются после минимальный проектор вычитается из сырых стеков (рис. 4В).
- Определить области интереса (ROI) от вычитается стеки и получить возврат инвестиций координат с использованием Multi-Мера плагин от ImageJ. Обработать все стеки для одного эксперимента и сохранить все ROI координаты в список ROI мастера (рис. 4С).
- Используйте список ROI мастер для измерения клеточного ответа из сырого стеков изображения со специально написанный макрос и Multi-Мера плагин от ImageJ (рис. 4D). Участок ответ кривые и Тепловая карта в Matlab (Mathworks Inc, Натик, Массачусетс).
6. Представитель Результаты
Пример эксперимента ВНО визуализации с использованием мочи образцов, взятых из четырех отдельных мышей показано на рисунке 5. Ломтик реагирует на стимуляцию мочи с различными рatterns активации. Около 80 клетки выявляются показывает ответ на хотя бы одного из мочи раздражителей и их реакция f / F значения приведены на Тепловая карта (рис. 5А). Ответ следы клетки 1, 2 и 3 приведены на рис 5B показывает время активации курса мочи раздражители. Ячейка 1 отображает ответ на как женщины, так образцы мочи, но не мужчин образцов, в то время как ячейка 2 показывает обратное модели активации и реагирует на мужчин только образцы. Ячейка 3 активируется как индивидуальные, так мужские и женские образцы. Клетки 1 и 2 показаны характерные ответ на секс конкретные сигналы в моче 15.
Рисунок 1 Схематическое изображение процесса вскрытия ВНО. А. анатомического расположения в ВНО мыши голову. Глава G-CaMP2 мышь была расчленена и укладывают вниз головой с мягкой тВопрос удален из неба, чтобы разоблачить ВНО. Вход показывает флуоресцентное изображение одного и того же изображения. Neuroepithelia о ВНО имеют ярко-зеленый. Б. вид сбоку изолированных ВНО, который заключен в сошника кости (сверху) и флуоресцентное изображение одного и того же ВНО (внизу). C. корональных зрения ВНО и диссекции процесса. Один ВНО отделен от перегородки и сошника кости могут быть удалены, чтобы выбраться нейроэпителия. Д. ВНО будет встроена в LMA. Е. встроенный блок приклеивается к ткани держатель для секционирования. Ткани держатель передовые при температуре 180-200 мкм на ломтик нажатием блок агарозы из металлическую бочку для секционирования. Лезвие располагается близко к металлической бочке. Ф. Вид сбоку VF300 система резки ткани. BV, кровеносных сосудов. СВ, нейроэпителия.
Рисунок 3 Иллюстрация перфузии настройки системы. А. типичные камеры перфузии с входным и выходным. ВНО часть расположена в центре камеры и нажал вниз с ткани якорь. Средний темы удаляются из тканей якорь так, чтобы ткань ВНО не нажата. Б. перфузии камеру помещают на столик микроскопа под погружения цели. Вход mACSF, выход всасывания и перфузии наконечник указаны. C. один насос шприца обеспечивает непрерывный поток Рингера через перфузии чаевые. Д. ВЭЖХ ИнджеСистема ction цикл принята для удобной загрузки образца стимула и инъекции. Е. Схематическое изображение направлениях потока при загрузке и инъекции позиции. Рингера, зеленый. Стимул образца, пурпурный. Стрелки указывают направление потока. Ф. Задержка и смыть время измерения перфузии системы. Родамина 6G флуоресцентного красителя загружается в образце петли и клапан переключается на инъекции позиции на пятую секунду, что обозначается стрелкой. Флуоресцентные изменения обнаружении сигнала в пределах 10-30 секунд и уменьшается после этого.
Рисунок 4 Обработка изображений трубопровода. A. Все кадры изображения для одного среза являются зарегистрированными против отсчета. Б. Вычитание минимальный проектор из стека из сырья кадры. Отвечая клетки становятся видными после вычитания. C. RОИ выбираются и их координаты, компилируются в основной список. Д. Измерение ответа клетки, используя ROI основной список из необработанного стека.
Рисунок 5 представителей G-CaMP2 ВНО изображений эксперимента. A. f / F ответ Тепловая карта с ломтиком стимулировали отдельные мужские и женские мочи. Образцы мочи собирают из отдельных мужских и женских мышей. По оси Х, отвечая клетки идентифицированы срез. Y-ось, мочи, используемых в эксперименте. Цвет полоса указывает на f / F значение. B. Время отклика течение 3-х представителей в ячейки, помеченные стрелками А. указать время стимулом применения. F-FVB, женский FVB, F-CBA, женский ЦБ; М-FVB, мужчина FVB; М-BL6, мужчина C57BL / 6.
Таблица специфических реагентов и оборудования:
| Названиереагент | Компания | Номер по каталогу | Комментарии (необязательно) |
| перфузии камеры | Siskiyou | PC-H | горизонтальный |
| часть прижимной | Warner инструменты | SHD-22CL | |
| Держатель перфузии порт | ALA научных, Inc | MPIOH-S | |
| шприцевой насос | Новые системы насоса эры, Inc | NE-300 | |
| низкий клапан давления впрыска | Chromtech | V-451 | |
| PEEK трубки | Chromtech | 1531 | 1 / 16 "OD, 0.25мм ID |
| PEEK образец петля | Chromtech | 1803 | 20 мкл |
| Гамильтон шприц | Chromtech | 80630 | 100 мкл |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большинство вомероназального рецепторов (VRS) остаются сиротами рецепторов с момента их открытия Дюлаком и Аксель 5. Феромона лигандами для этих хемосенсорных рецепторы и их роль в посредничестве животного поведения, не до конца понятны. До сих пор только одна пара лиганд / рецептор, ESP1 пептида и его родственные рецепторы, Vmn2r116 (V2Rp5), был определен и показан для передачи специфических социальных информацию 19,23. Другой рецептор, V1rb2, как было показано в ответ на 2-heptanone, которые, предположительно, обогащается в моче самок мышей 24. Однако конкретная информация передается этот лиганд остается неясным. Метод, который мы разработали здесь дает характеристику ВНО ответ нейрона на большое количество раздражителей и анализа характера активации. Используя этот метод, мы обнаружили, что клетки, показать конкретные ответы на мужской или женской мочой и, что могут быть посвящены функционированию клетки признатьсекс конкретные сигналы феромонов 15. VR, выраженные на этих клеток еще не были идентифицированы. Визуализации метод, описанный здесь позволяет не только скрининг феромона лиганды присутствуют в моче, но и будет способствовать идентификации специфических рецепторов, реагирующих на феромоны киев.
G-семейный лагерь кальция датчиков были использованы в различных животных систем и их сигналы как было показано, хорошо коррелируют с кальцием переходных 25-28. Использование генетически закодированный датчик обеспечивает чувствительной считывание нейронных реакций и позволяет конкретное выражение датчика в целевых тканях и клеточных типов. Генетически закодированы датчики позволяют также при хронических изображений в живых животных. Традиционно, синтетических красителей кальция были использованы для контроля кальция ответ. Красителя процедуры загрузки неизбежно инвазивных и часто вызывают повреждение тканей. Неравномерная нагрузка и ограниченные проникновения красителя в Tissу.е. Также существенно повлиять на выявление кальция сигналов.
В нашем эксперименте с использованием G-CaMP2 мышей, мы находим, что амплитуда ответов находится на уровне или лучше, чем, кальциево-красителя загрузки методы в ломтик препаратов. ВНО ломтиками можно поддерживать в здоровом состоянии в течение нескольких часов после перерезки тем самым дать анализ большого количества раздражителей в одном эксперименте. Тем не менее, генетически закодированы датчики часто содержат белок доменов, которые могут потенциально взаимодействовать с клеточными компонентами для изменения ответа узорами или даже влиять на нормальное развитие организма. Надо быть осторожным, когда новый датчик вводится в систему. Тщательное изучение целевой ткани не требуется. В наших предыдущих исследований, мы рассмотрели G-CaMP2 мышей для их врожденного поведения, электрофизиологических свойств нейронов ВНО и проекции модели обонятельной сенсорных нейронов 15. Ни один из этих аспектов пострадавших в G-CaMP2 мышей. Тем не менее, с использованием трансгенных животных, которое несет дополнительные расходы на содержание животных и генотипирования. Кроме того, эксперименты проводились в доступные линии генерируется. Эти факторы, которые должны быть приняты во внимание при разработке экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Андреа Моран вместе с членами Лаборатории животных службе фонда (LASF) на Stowers института за отличную поддержку животноводства и технических услуг. Эта работа проводится при поддержке финансирования из Stowers институт и Национальный институт здоровья (NIDCD 008003), чтобы плакать. Содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института глухоты и других расстройств связи или Национального института здоровья. США патент на tetO-G-CaMP2 мышей для Stowers института, плакать и LM.
References
- Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
- Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
- Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
- Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
- Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
- Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
- Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
- Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
- Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
- Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
- Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
- He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
- Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
- Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
- Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
- He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
- Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
- Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
- Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
- Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
- Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
