To typer af assays til påvisning af Frog Sperm Chemoattraction

Summary

Æg og det ekstracellulære belægninger omkring æg ofte release peptider, proteiner og små molekyler, der kommunikerer med sædceller til at guide dem til ægget derved at fremme befrugtningen. Brug af frøen sædceller vi beskrive og sammenligne to klasser af assays anvendes til at påvise sædceller chemoattraction - sperm ophobning analyser og sperm sporing assays.

Abstract

Sperm chemoattraction i invertebrater kan være tilstrækkeligt robust, at man kan placere en pipette, som indeholder den attraktive peptid ind i en sædcelle suspension og mikroskopisk visualisere sæd ophobning omkring pipette ^1. Sperm chemoattraction hos hvirveldyr såsom frøer, gnavere og mennesker er sværere at opdage og kræver kvantitative assays. Sådanne analyser er af to hovedtyper - analyser, at kvantificere sæd bevægelse til en kilde til chemoattractant, såkaldte sædceller akkumulation assays, og assays, der rent faktisk spore svømme baner af individuelle sædceller.

Sperm ophobning analyser er relativt hurtige tillader snesevis eller hundredvis af assays, der skal gøres på en enkelt dag, således at dosis-respons kurver og tid kurser, der skal gennemføres relativt hurtigt. Disse typer af analyser er blevet brugt i udstrakt grad til at karakterisere mange veletablerede chemoattraction systemer - for eksempel, neutrofile chemotaxis til Bacteriale peptider og sæd chemotaxis til follikulært væske. Sædceller sporing analyser kan være mere arbejdskrævende, men giver yderligere oplysninger om, hvordan chemoattractancts faktisk ændrer svømning stier, som sæd tage. Denne type analyse er nødvendig for at demonstrere orientering af sæd bevægelse i forhold til chemoattrractant gradient aksen og at visualisere karakteristiske sving eller ændringer i retning at bringe sæd tættere på ægget.

Her beskriver vi metoder, der anvendes for hver af disse to typer af analyser. Sæden ophobning udnyttet analysen kaldes en "to-kammer" analyse. Padde sæd er placeret i en vævskultur plade indsats med polycarbonat filter etage har 12 μm diameter porer. Indstik med sæd er placeret i vævskultur plade brønde indeholder buffer og en chemoatttractant forsigtigt pipetteret i bunden godt, hvor gulvet møder væggen (se fig. 1). Efter inkubation, er den øverste indsætte indeholder sædceller reservoiret omhyggeligt removed, og sæd i bunden kammeret, der har passeret gennem membranen fjernes, pelleteret og derefter tælles med hemocytometer eller flowcytometer.

Sæden sporing analysen anvender en Zigmond kammer oprindeligt udviklet til at observere neutrofil chemotaxis og modificeret til observation af sædceller ved Giojalas og kolleger ^2,3. Kammeret består af en tyk glasplade, hvori to lodrette trug er blevet bearbejdet. Disse er adskilt af en 1 mm bred observation platform. Efter påføring af et dække glas, sæd er indlæst i et trug, de chemoattractant agent i den anden og flytning af de enkelte sædceller visualiseret ved hjælp af video mikroskopi. Video-optagelser er derefter analyseret ved hjælp af software til at identificere to-dimensionelle celle bevægelser i xy planet som en funktion af tiden (xyt datasæt), der udgør bane hver sædceller.

Protocol

1. Materialer og anvendte buffere

1. Ægcelle Ringer Buffer (1,5 x OR2) indeholder 124 mM NaCl, 3,75 mM KCl, 1,5 mM CaCl _2, 1,5 mM MgCl _2, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM HEPES, pH 7.8. Befrugtning Buffer (F-1) indeholder 41,25 mM NaCl, 1,25 mM KCl, 0,25 mM CaCl _2, 0,06 mm MgCl _2, 0,5 mM Na ₂ HPO _4, 2,5 mM HEPES, pH 7,8.
2. Xenopus laevis æg vand er udarbejdet efter Sugiyama et al. ^4. Beskrives kort, er frisk udklækkede gelé Frøen æg hvirvlede i en lille mængde af F-1 buffer i 30 minutter, og den betingede mellemstore fjernes ved mikropipette. Dette medium, kaldet "æg vand", kan også bruges til at forberede renset allurin, den primære chemoattractant i denne gelé ekstrakt. Sperm er fremstillet af kommercielt opdrættet Xenopus laevis eller Xenopus tropicalis.
3. Se tabel af materialer til bestemte elementer behov for than analysen.

2. En to-kammer-analysen for frøen sæd chemotaxis

1. Bedøver frøen ved nedsænkning i vand indeholdende 0,07% benzocain, halshugge hjælp af et par carborumdumkorn kantet saks, og dobbelt marv at sikre eutanasi. Skæres væk bughuden at eksponere muskel. Gør midterlinjen og lateral nedskæringer i mavemuskel og tilbage. Forsigtigt trække tarmene og fedt til at afsløre hvid, bønne-formet testikler. Trim væk bindevæv med en fin saks være omhyggelig med at undgå blodkar. Fjerne en testikel, vaske væk enhver blod ved hjælp af 1,5 x OR2 buffer, rul derefter testiklerne på filtrerpapir for at fjerne overskydende buffer og små klæbende blodkar, og derefter placere testis i en plastik Pitre parabol i 0,2 ml 1,5 x OR2 buffer. Fyld en 5 ml sprøjte med 2 ml 1,5 x OR2 buffer, forsigtigt stikke 10-20 huller i testiklerne over det meste af overfladen i den ene ende, indfør kanylen i den modsatte ende og forsigtigt injicere buffer til at skylle ud sæd. Alternativt, enkan injicere buffer, mens stikke exit huller til at skylle ud sæd. Overfør sæd suspensionen op i en mikropipette med en cut-off spids (undgå klipning af sæd) til et mikrocentrifugerør og anbring på is.
2. Anslå antallet af frø sædceller opnås ved at fortynde sæden 1:100 i 1,5 x OR-2 og tager en 20 μl prøve af blandet sæd suspension og tælle antallet af celler ved hjælp af en hemocytometer og de ​​store 1 mm ^2-område. Brug af hemocytometer tælle og prøvetagning forholdet beregne sæd tæthed og det samlede antal høstede sædceller. Dette tal er normalt 2 - 6 x 10 ⁷ sædceller i et volumen på omkring 2 ml, når begge testikler er anvendt. Fortynd bestanden sædceller affjedring med 1,5 x OR2 buffer for at opnå en sædcelle tæthed på 2 x 10 ⁷ / ml. Brug sæd til analysen inden for 2 til 3 timer efter tilberedningen. Vurdere spermiemotilitet ved at fortynde 5 mikroliter af sædceller 1:10 med F-1 buffer og visualisering af bevægelse ved hjælp af fasekontrast optik. Mindst 40% til 50% af sædcellerneskal være bevægelige. Selv passende forberedelser vil indeholde et stort antal af døde sædceller hvoraf de fleste er umodne.
3. Forbered en ny 24-såvel plastik vævskultur pladen ved micropipetting 700 μl af F1-buffer i hver brønd. Hver brønd bør være omkring 15 mm i diameter i bunden.
4. Start en række analyser ved at fortynde 100 μl af sædceller suspension med 900 μl af F1-buffer ved stuetemperatur (ca. 21 til 23 ° C) i et mikrocentrifugerør at aktivere spermiemotilitet af osmotisk chok. Hver gang frisk sæd er aktiveret på denne måde, skal sæden bruges inden for 1-2 minutter.
5. Placer en 12 μm porøsitet indsætte (12 mm OD) i en buffer-fyldte godt, sørg for, indsætte placeringen er off-center forlader en plads til den ene side. Straks overføre 400 μl af motilitet aktiveret sperm ned i brønden ved en mikropipette med en cut-off spids. Påfør sæd suspension til væggen af ​​filterindsats og lad den løbe ned på filteret i bunden af ​​the indsætte; sæden suspension bør ikke pipetteret direkte på filteret.
6. Omhyggeligt mikropipette 50 μl af chemoattractant agent i brønden i rummet mellem godt og off-center filterindsats. Man skal være omhyggelig med at deponere drop, hvor siderne og bunden af ​​brønden mødes og trække pipetten uden forstyrrelser i systemet. Konkret bør stemplet på mikropipette blive skubbet kun til det første stop, så helt skubbe prøven, men ingen luftbobler.
7. Gentag trin 2.5 og 2.6 ovenfor for at starte så mange analyser efter behov, så inkubér pladen, indtil den første begyndte at analysen er inkuberet 50 minutter. Typisk kan man starte en test hver 45 til 60 sekunder. Bemærk, at analysen kan strømlines af en erfaren person eller af to personer, der arbejder sammen. I dette tilfælde kan en eller to rækker af assays indledes med et større lager af motile sædceller og hurtigere pipettering forudsat at sæd altid bruges inden for 1 til 2 minutter afaktivering.
8. Stop hver analyse i sekvensen startede. Først forsigtigt stabil filterindsatsen med den ene hånd og med den anden forsigtigt fjerne de fleste eller alle de sædceller suspension i det øverste kammer ved mikropipette eller ved sugning med en Pasteur-pipette. Straks ved hjælp af en fin pincet, trækkes ud filterindsatsen og kasseres. Pleje skal bruges på dette trin, mindst de resterende sædceller blive fejet gennem filteret artifactually hæve værdierne for sædcellerne passage.
9. Fra hver plade godt, overføre hele sæd suspension til en mikrocentrifugerør. Det er vigtigt at blande sæd suspensionen i god tid før tilbagetrækningen, da sædceller har tendens til at afregne til bunden. Tilsæt 15 μl 25% formaldehyd til en endelig koncentration på 0,5% v / v og opbevares i køleskab, hvis sædtal ikke er færdig samme dag.
10. Pelleter sædceller i hvert rør ved hjælp af en 10 anden trykknap spin på en personlig mikrocentrifuge med en maksimal hastighed på 2000 x g. Fjern alle men 100 μl af supernatant fra hvert rør, så resuspender pellet i volumen. Der udtages 20 μl af sæd suspension, fortyndes 1:10 med destilleret vand, og regner sæd på en hemocytometer ved hjælp af et 40x objektiv på en opretstående mikroskop. Brug tæller og fortyndingsfaktorer til at beregne det samlede antal af sædceller, der passerede gennem filteret i hver analyse.

3. Frog sæd sporing assay ved hjælp af en Zigmond kammer

1. Forbered inverteret mikroskop arbejdsstation til videooptagelser. Vi bruger et Nikon Elipse TE300 inverteret mikroskop udstyret med enten en Sony DXC-390 3-chip farve analoge videokamera eller en Hamamatsu ORCA-03G monokrome digitalt kamera. Den Zigmond kammer slide skal hvile på scenen up-side-down med en tilstrækkelig åbning i den fase, pladen til at rumme en 22x40 mm dækglas. Dette arrangement er nødvendiggjort af, at frøen sæd ikke er i stand til at svømme mod tyngdekraften. Fokus enten en 4x eller 10x objektiv på observationslisten platformen kører mellem de totrug.
2. Test for at sikre, at kameraet er fokuseret og centreret på observation platform. Hvis Sony kameraet er brugt, er output sendes til en video, skærm og til en A / D-konverter (frame grabber) i stand til at digitalisere 7 billeder per sekund fra videosignalet. Den digitale stream er behandlet ved hjælp af en computer, der kører på 3 GHz eller større helst med 4 GB RAM eller mere. Selvom vi bruger Scion Image software (en speciel Windows-versionen af ​​NIH Image) styre en Scion CG-7 Framegrabber, disse produkter er ikke længere tilgængelige. En nuværende løsning er at bruge Billede J software med VirtualDub Plug-in til analoge videokamera capture. Hvis Hamamatsu kameraet er brugt, er dens digitale output behandles af Olympus cellSens software og vises på computerskærmen. I begge tilfælde er data gemt på enten en intern eller ekstern harddisk som en 8-bit TIFF-stack. Brug af Scion Image software kræver konvertering af TIFF-billede sekvensen til en stak med billede J.
3. Forbered chemoattractant på et passende koncentration i F1 buffer. Forbered Xenopus laevis sædceller, som beskrevet tidligere, og butik i 1,5 x OR2 buffer på is indtil brug.
4. Saml Zigmond kammeret. Start med en tør ren kammer. Med en mikropipette sted en linje af silikone olie (4 μl) omkring 5 mm fra og parallelt med den yderste kant af trug. Placer en 22x40 mm dækglas på kammeret tillader silikone olien jævnt fordelt til den yderste kant af trug. Hvis de foreløbige eksperimenter viser, at sæd stikning er et problem, kan man nødt til at coate dække glasset med nitrocellulose som foreslået af Fabro et al. ^3. Alternatively, kan optagelsen af ​​protein i buffere anvendes (fx 1% BSA) også reducere sædcellerne stikning.
5. Vend kammeret og sted over det runde udskæring i mikroskopet scenen og være omhyggelig med at dække glasset ikke komme i kontakt med scenen. Denne omvendte konfiguration er nødvendig for at bringe Xenopus sæd fra lavpunktet på platformen. I modsætning til pattedyr sædceller, er Xenopus sædcellerne ikke er stærke nok til at svømme mod tyngdekraften for at nå platformen.
6. Aktiver 20 μl af Xenopus sædceller i 1,5 x OR2 buffer ved at blande 1:10 med F1 buffer ved stuetemperatur. Med en mikropipette med et snit spids, straks overføre 70 μl af motilitet-aktiverede sperm i truget. Dette opnås ved at holde mikropipette i en lav vinkel og placere spidsen ved siden åbningen af ​​truget. Cellen skubbet ud suspension fylder truget og bro ved kapillarvirkning. Dernæst fylder det modsatte lavpunktet på samme måde ved hjælp af en chemoatttractant løsning.
7. Begynd videooptagelser inden for 3 minutter (Xenopus sædceller har en begrænset motilitet levetid) og fortsætter i 5 minutter. I slutningen af ​​videooptagelser, disassemblering af kammeret og vask trug og observation platform med et trykreguleret strøm af vand og derefter ethanol fra en sprøjteflaske. Fjern silikone olie fra den øverste overflader med papirservietter være omhyggelig med ikke at forurene observation platform og trug.
8. Hvis det er nødvendigt, konvertere video data fanget til et TIFF-billede sekvens eller stak hjælp Billede J software. Åbn derefter filen i Billed J og i de første 21 frames (3 sekunder) vælge op til 50 sæd, der skal spores. For at undgå bias, valgte sæd fra alle regioner af observationen feltet og uden kendskab til deres bane data. Capture to-dimensionelle celle baner i xy planet som en funktion af tiden (xyt datasæt) for hvert sædceller ved at pege og klikke med musen ved hjælp af MtrackJ plug-in modul for Image J. Visualiser baner og beregne baneafstande, akse komponenter og hastigheder inden MtrackJ. Alternativt kan udføre disse operationer og yderligere numerisk analyse (f.eks direktionalitet, chemotaxis parametre og parameter histogrammer) ved at importere xyt datasæt i Microsoft Excel.
9. Plot baner for de enkelte sædceller i Excel til at detektere overordnede bevægelsesmønstre herunder lineære, krum, og cirkulære mønstre, samt funktioner såsom sving. Udnyt xyt datasæt til at beregne gennemsnittet krum hastighed, netto rejse langs X (gradient) - og Y-aksen, og orientering parametre såsom den gennemsnitlige vinkel på rejse i forhold til gradient akse.

4. Repræsentative resultater:

Vigtige tekniske parametre i de to kammeret analysen er størrelse og form af kammeret, porøsitet af membranen, og længden af ​​inkubation. Størrelsen af ​​det øverste kammer holder sæd må ikke være så store i diameter, som til at kræve en stor mængde af sædceller (præferably 0,5 ml eller mindre) eller skal den øvre kammer være så dybt som til at skabe en høj søjle af celle suspension (<1 cm). Mængden af ​​nederste kammer buffer omkring den øverste kammer indsætte skal præcist matche det niveau af cellesuspensionen i indsatsen for ikke at skabe et transmembrant hydrostatiske tryk, der ville artifactually tvinge sædcellerne gennem membranen. Placering af den tomme indsætte i bunden vel først, efterfulgt af sæd loading resulterer i en indledende opadgående hydrostatiske tryk, som forhindrer sædcellerne i at gå igennem membranen under lastning. Valg af membran pore størrelse bestemmes af størrelsen af ​​den sæd, og den kommercielle tilgængelighed af porøse membran indstik. Vi finder, at analyser med frø sædceller kan bruge enten 8 eller 12 μm diameter porerne selv 12 μm pore sørge for passage af højere antal sædceller tillader mere nøjagtig optælling. Pore ​​størrelser større end 12 μm synes ikke at være kommercielt tilgængelige. Et alternativ til at bruge tissue kultur indsætter er brugen af ​​Neuroprobe membraner designet til chemotaxis assays i 96-brønds plader. Disse tilbyder en potentielt større kapacitet og en bredere vifte af pore diametre. Selvom større pattedyr sæd synes at kræve en større porediameter, har vi med succes analyseret musen sædceller chemotaxis hjælp indsatse med 12 μm porer (Burnett, ikke offentliggjort observationer). I modsætning hertil kan mindre pore størrelser være tilstrækkelig til mindre sæd (fx søpindsvin), selv om vi endnu ikke har afprøvet denne mulighed.

En ulempe ved de to-kammer, der er beskrevet analysen er, at sæd er placeret i det øverste kammer, hvilket uundgåeligt resulterer i nogle sædceller passage ved hjælp af tyngdekraften, hvorved signalet til baggrunden ratio. Dette er nødvendiggjort af, at Xenopus sædcellerne ikke er kraftig nok i deres motilitet til at svømme mod tyngdekraften, som er pattedyr sædceller. En anden vanskelighed i analysering Xenopus sædceller er det faktum, at deres motilitet lIFE tiden er kort - 5 til 15 minutter efter aktivering. Denne begrænsning er grundlaget for at skulle aktivere et nyt parti af sæd hver 2 til 3 minutter, når de gennemfører flere analyser. Som følge heraf har tidsforløbet undersøgelser vist, at de fleste sæd passage sker inden for de første 20 minutter af analysens ^5. Selvom vi bruger en 50 minutters inkubationstid, kan denne periode sandsynligvis være kortsluttet til 20 eller 30 minutter. I modsætning til mus sæd, som forbliver motile i flere timer har vi brugt op til en 2 timers periode under analysen med gode resultater (Burnett, ikke offentliggjort observationer).

I de to-kammer-analysen ved hjælp af frøen sæd, er det samlede antal af sædceller gennem den porøse membran typisk 10 til 20 tusinde eller omkring 1 til 2% af sædcellerne er placeret i det øverste kammer indsætte. Tilstedeværelsen af ​​en chemoattractant gradient i den nedre kammer kan øge sperm passage lige så meget som 4 til 10 gange. Figur 2 illustrerer en typisk dosis-respons kurve udført med denne analyse. En Udvindinghandling af Xenopus æg gelé ("æg vand"), som indeholder de kendte chemoattractant protein allurin (røde cirkler), blev placeret i den nederste kammeret på en række fortyndinger. Den samlede æg vand protein, der er indeholdt i hver analyse er angivet i mikrogram / assay - det beløb, der leveres i den originale 50 μl volumen. Siden de leverede protein vil danne en diffusion gradient, er den faktiske koncentration vifte af protein, der sædceller reagerer på ikke kendt, men kan skønnes at være 5 til 10 gange lavere end protein koncentrationen af ​​de leverede dråbe. Af denne grund, betegner vi mængden af ​​protein indført, ikke koncentrationen. Normalt udfører vi dobbelt eller tredobbelt assays for hver dosis og den gennemsnitlige resultat, vi så kopiere hele forsøget 3 eller 4 gange ved hjælp af sæd fra forskellige hanner i hvert forsøg. Den gennemsnitlige og standard error af middelværdien er beregnet for hver dosis med standard error for gennemsnittet typisk er 5 til 10% af middelværdien. Bemærk, at proteiner uden knoWN chemoattractant aktivitet såsom bovint serum albumin (åbne cirkler, Fig. 2) kan producere et lavt niveau, ikke-specifikke stigning i sædceller passage gennem membranen. En interessant iagttagelse er, at dosis-respons kurven for æg vand er multifasisk - en stigende fase og en aftagende fase. Denne type multifasisk forhold er fælles for sæd chemoattractants; respons menneskelige sædceller til follikulært væske viser en lignende bifasisk forhold ^6, der menes være nyttige i, at høje koncentrationer af chemoattractant fundet i nærheden af et æg kan tjene til at mindske yderligere søgning svar på den del af sædceller.

Undertiden finder vi, at kontrollen værdier for denne analyse er højere end normalt, hvilket reducerer dobling produceret af en chemoattractant. Normalt kan det spores tilbage til mekanisk afbrydelse af filterindsats i løbet af analysen. Derfor er det vigtigt, at indstik ikke bliver forstyrret under indlæsning af sæd eller Chemoattractant under analysen inkubation, eller når det indsatte materiale er fjernet. Særligt afgørende er, at sæd reservoiret i Bilaget fjernes ved mikropipette eller suge før du løfter indsætte op af brønden. Dette sikrer, at sædcellerne ikke er fejet gennem de porøse membran i bunden kammeret som insertet er fjernet.

Vigtige tekniske parametre i Zigmond kammeret analysen omfatter afstanden mellem dækglas og observation platform, forstørrelse af videoen observation, den anvendte type optik, og frame rate. Afstand mellem observation platform er typisk 10 til 15 μm, selv om denne afstand kan varieres ved at mængden af ​​silikoneolie bruges til at interface mellem dækglas og kammeret slide - jo mere olie, jo større afstand. En tynd flade af væske øger mængden af ​​tid til en gradient til at danne såvel som levetiden for de gradient engang dannet. En tykkere fly af væske giver en hurtigere gradient dannelsen men gradient har en kortere levetid og mindre stabilitet. Dynamikken i gradient dannelse kan visualiseres ved hjælp af et fluorescerende farvestof eller en fluorescerende dextran i chemoattractant godt og ved hjælp af fluorescens mikroskopi for at se den dynamik. Testen reagens skal matches i molekylær vægt på chemoattractant der anvendes, og den dynamik bestemmes bruges til at bedømme, hvor mange minutter der bør være mulighed for gradient dannelse og registrering af sæd bevægelser.

De anvendte forstørrelse skal være generelt lav (4x eller 10x mål), hvis hele observation platform skal visualiseres som i analysen betingelser, vi har beskrevet. På den anden side kan større forstørrelse (40x eller 63x målsætning) være nyttigt, hvis man ønsker at overvåge relativt korte bane segmenter eller ønsker at løse flagellar bevægelser. Sporing kan udføres enten via semi-manuelle metoder som beskrevet i dette papir eller ved automatiseret sporing som praktiseres i mere SOPhisticated softwarepakker såsom MetaMorph eller Imaris Track. I begge tilfælde er let at spore meget afhængig af billedets kontrast uanset om det er ved at operatøren eller software-assisteret objekt anerkendelse. Selvom lyse felt optik kan anvendes i nogle tilfælde, brug af fasekontrast optik eller Darkfield optik er almindeligt påkrævet. Endelig frame rate afhænger af den tidsopløsning ønskede i tracking. Hvis semi-manuelle metoder som i vores procedure, er en formentlig begrænset til relativt lave frame rate - 4 til 8 billeder i sekundet - på grund af den arbejdsintensive karakter af registrering af data. På den anden side kan video sats observationer være nødvendige for hurtige reaktioner såsom flagellar bølge former. Ofte er eksperimentelle mål bedst tjent med at gøre langsommere frame rate eksperimenter og hurtigere frame rate eksperimenter separat, da man også ønsker at ændre andre parametre som forstørrelse, optik, eller digital billedbehandling.

Typiske resultater for Zigmond kammer sporing assay består af en række baner som dem, der ses i halvtreds frøen sædceller i videoklippet for Movie 1. Mod et billede af observation platform, er de flyveveje af individuelle sædceller spores i rødt for en kontrol eksperiment (ingen chemoattractant gradient til stede). De to-dimensionelle celle baner i xy planet som en funktion af tiden for hver sædceller kan plottes og registreres ved MtrackJ og importeret til Microsoft Excel. For bane analyse, udpeger vi chemoattractant gradient-aksen som X-aksen og Y-aksen som den ortogonale akse, i overensstemmelse med konventionen oprindeligt udviklet af Fabro et al. ^3. Som vist i diagrammet i figur 3, er den faktiske taget bane bestående af trin, hvor summen af ​​længde er lig den krum distance i den bane (blå / guld pile). Netto afstand og orientering af rejse med hver sædcelle er en vektor der forbinder den første og sidste punkt på banen (rød diagonal pil). Dennetto rejser kan adskilles i sin X-aksen komponent-og Y-aksen komponent (røde stiplede pile, også kaldet nettodelta X og nettodelta Y, henholdsvis).

Fordi chemotaxis i hvirveldyr sædceller kan involvere relativt subtile skift i kørselsretningen, et stort antal sædceller (100 til 300), tilfældigt udvalgte, er normalt analyseres for hver tilstand ofte kræver poolede data fra 4 til 6 uafhængige forsøg. Med henblik på illustration, dog vil vi bruge data fra kun halvtreds frøen sædceller. Tabel 1 illustrerer fælles parametre anvendes til at påvise ændringer i sædceller rejse. Den gennemsnitlige netto rejse langs X-aksen vil stige betydeligt, hvis, i overværelse af en chemoattractant, sædcellerne befolkningen som helhed følger baner, der ligger tættere op ad med gradienten. I vores eksempel, steg den gennemsnitlige netto X-aksens vandring er over tre gange ved tilstedeværelse af æg vand. Man kan også plotte et histogram af netto X-aksens vandring for sædcellerne befolkning, som har den fordel Tage, at mindre delpopulationer af de responderende sædceller kan opdages. To parametre er udviklet af Fabro et al. ³ kan også hjælpe med at opdage disse befolkninger. Både den procentdel af sperm viser positiv netto-X-aksens vandring (% ΔX> 0) og den procentdel af sperm viser netto lineære ikke større end 45 grader fra gradient akse (% ΔX / | ΔY |> 1) kan stige dramatisk, hvis hele sædceller befolkning er følsom over for de chemoattractant eller mindre, men stadig betydelige beløb, hvis delpopulationer af sædceller er følsomme. Vores eksempel i tabel 1 viser stigninger i begge parametre for halvtreds frøen sæd udsat for et æg vand gradient. Bemærk, at tilfældige ikke-orienterede bevægelse vil give ikke-nul værdier for begge disse parametre på 50% og 25%; kontrol værdier højere end denne (som dem i tabel 1) repræsenterer en baggrund på grund af enten en lav prøve nummer eller til en bias i sædceller orientering især det eksperimentelle design.

indhold "> Directionality af sæd rejse som reaktion på chemoattractant agenter direkte kan vurderes ved theta, vinklen mellem vektoren af ​​netto-rejser for de enkelte sædceller og gradient (X)-aksen. Vores eksempel i tabel 1 viser, at den gennemsnitlige theta faldt for sædcellerne at svømme i et æg vand gradient indikerer, at sæd baner som en population var bedre afstemt med gradienten. Svarende til netto X-aksens vandring (se ovenfor), kan thetas for sædcellerne befolkningen udtrykkes som udlodning, en tilgang også følsomme til delpopulationer af de responderende sæd og en, der for nylig blev undersøgt af Gakamsky et al ^7.

Endelig kan krum og øjeblikkelige hastigheder for de enkelte sædceller også være udvundet fra de data, der beskriver to-dimensionelle celle baner i xy planet som en funktion af tiden. Man opdager måske, at der er en stigning i hastighed samt et skift i retning af rejse, hvilket tyder på en kemokinetiske indsats samten kemotaktiske svar.

Disse data repræsenterer et udgangspunkt for analyse af sperm baner. Yderligere analyse kunne omfatte målinger af bane linearitet og krumning på et øjeblik for øjeblik grundlag, som udføres af Bohmer et al. ⁸ og Shiba et al. ^9, automatiseret påvisning af vendinger som udføres af Burnett et al. ^10, og ikke-linearitet som måles ved fraktal analyse ^11,12. Forudsat at sædcellerne svømme disse baner bliver overvåget ved højere forstørrelse, man kunne også billedet flagellar bevægelser og real tid calcium signaler, som udføres af en række laboratorier ^{8,9,13,14,15,16.} Sådanne undersøgelser har vist, at både hvirvelløse dyr og pattedyr sædceller reagere på chemoattractants af skarpe drejninger af sperm op gradient mod chemoattractant kilde. Disse vendinger er ledsaget af flagellar bøjninger, der ændrer sædceller orientering meget som et ror ville bøjer, der synes at initieret af definerede, bølge-liKE calcium signaler formerings gennem flagellum. Således er det ultimative mål af sædceller sporing er at korrelere signalsystem dynamik med ændringer i flagellar fremdrift, der tjener som grundlag for sæd orientering også på en kemotaktiske gradient. Disse mål er endnu ikke nået i Xenopus sædceller, der rejser i en spiralformet bevægelse ^17, udviser lav krumning i deres baner ^10, og hvis calcium signaler er endnu ikke overvåges.

Selv om vi har fokuseret her på detaljering analysen metoder, vi bruger til Xenopus laevis sæd, både de to kamre sæd ophobning assay og Zigmond kammer sporing test kan bruges til pattedyr sædceller, hvis visse modifikationer. Begge analyser kan udføres ved 37 ° C, hvis det ønskes, ved brug af et dias varmere og i Zigmond kammeret analysen, et mikroskop scene varmere. Typisk vil pattedyr sædceller blive isoleret, kapacitetsbegrænsninger og inkuberes ved hjælp af passende pattedyr buffere end chemoattractants, men dataanalyse vil svare til, hvad der er beskrevet her for paddearter. En yderligere forskel er, at Zigmond kammeret normalt er placeret oprejst på scenen af en opretstående mikroskop siden pattedyr sperm, i modsætning Xenopus sædceller kan svømme op på observation platform. Som endnu uafprøvede, kan disse to analyser se ansøgning til sæd af en række arter i det fremtidige arbejde.

Figur 1. Skematisk diagram af to-kammer-analysen. Sperm er placeret i et indstik i bunden af, som er en polycarbonat filter med 12 μm porer. En chemoattractant løsning er omhyggeligt pipette ned i brønden at indlede dannelsen af ​​en koncentrationsgradient.

Figur 2. Repræsentant data for frøen sædceller ved hjælp af to-kammer sæd chemotaxis analyse. Egg vand tilberedt af X. laevis æg udviser en multifase dosis-aktivitet kurve, der er karakteristisk for sæd chemoattractants. Bovin serum albumin øger sperm passage kun lidt - en uspecifik effekt af protein. Figur modificeret fra Al-Anzi & Chandler ^5.

Movie 1. Et videoklip viser frøen sædceller baner plottet i rødt på observation platform for en Zigmond kammer. Bredden af platformen er 1 mm. Klik her for at se videoklippet.

Figur 3. Axis konventioner, en sædcelle krum bane og en vektor for netto lineære rejser er indtegnet på Zigmond kammeret observation platform. Indhentede oplysninger er tre typer. For det første kan sperm baner selv (blå / guld pile) afslører særlige mønstre sulm som cirkler og vender (stjerner). Krum afstand og krum hastigheder kan måles for at bane vej. For det andet, netto lineære distance over hele bane, netto X (gradient) akse del af rejse, kan nettet Y-aksen del af rejse-og vinklen theta mellem X-aksen og vektoren af ​​netto-rejse beregnes for hver bane og sammenlignede som en fordeling over alle spores sperm. For det tredje, øjeblikkelige ændringer i hastighed og kørselsretning til segmenter inden for de enkelte baner kan studeres enten individuelt eller som en population. Ovenfor er fra siden af ​​kammeret præsenteres i et diagram.

Tabel 1. Parametre, der ofte anvendes ved analyse af data fra Zigmond kammeret.

Discussion

Chemotaxis af celler bevæger sig ved enten amoeboid bevægelse eller flageller-drevne svømning findes i mange biologiske sammenhænge og undersøgelse af dette fænomen kræver, at tilgængeligheden af ​​praktiske og pålidelige assays. Nogle eksempler på fænomenet, såsom tiltrækning af sæd til et søpindsvin æg eller indsamling af slim mug celler til at danne en frugtsætning krop, har umiddelbar visuel effekt. Kvantificering af dette fænomen er blevet foretaget i en række forskellige måder, som beskrevet af Eisenbach ^18. Disse analyser omfatter brug af chemoattractant fyldt kapillærer at tiltrække sæd, brug af kapillærer sammenføjning reservoirer til at skabe en gradient og brug af en Makler kammer, der brønde til sædceller og chemoattractant. Dette papir beskriver to "anden generation" analyser, der nu bruges oftere. Selv om disse analyser stadig kunne stole på behovet for at skabe en gradient de indeholder flere nye funktioner. Først de to kammer analyse har den fordel, at mange membran porer SAMPle sædceller passage på tværs af forløbet snarere end en kapillar åbning tillader mere sæd til at teste gradient i en enkelt analyse.

Mønstre for dirigerede celle bevægelse er et nøgleelement i chemotaxis og det er naturligt, at nye formater til sporing af celler er blevet udviklet. Et nyt format, er den tre-dimensionelle scanning af sædceller baner, når de nærmer et æg. Ved hjælp af en bevægelse plan infrarødt lys til at opdage sædceller positioner, har Zimmer og kolleger forudsat sæd bane data i et kammer med ægget centreret - en enhed, der bruger den naturlige chemoattractant kilden og har relativt langt vægge, der ellers kunne forstyrre naturlige sædceller bevægelse ^19. Alternativt Corkidi et al. udviklet et system, der kombinerer hurtige bevægelser af en lang arbejdsdag afstand mål med høje frame rates til at indfange tre-dimensionelle baner ^20. Analyse af sædceller bevægelser i sådanne enheder er for nylig blevet lettere ved brug af polære koordiTES ²¹ og Guerrero et al. har for nylig understreget behovet for tre-dimensionelle observationer af sædceller chemotaxis i fremtidige undersøgelser ^13.

I modsætning hertil er brugen af kartesiske koordinater lettes ved Zigmond kammer, en enhed, der blev udviklet af Sally Zigmond for undersøgelse af neutrofil orientering og chemotaxis og første vist sig at være nyttig i studiet af sæd chemotaxis ved Giojalas og kolleger ^2,3. Brug af en lineær lavpunkt på chemoattractant snarere end et punkt kilde til chemoattractant giver en kemisk gradient der skal oprettes i et XY koordinatsystem snarere end en radial koordinatsystem. Giojalas har anvendt denne analyse til studiet af chemotaxis i sæd fra mennesker, mus, kaniner og stude og bekræftede, konstateringen af, at væske fra ovariefollikler indeholder en chemoattractant ^2,3,22. På det seneste har Giojalas og Eisenbach vist, at progesteron, givet ud fra cumulus celler der omgiver ægget ogsåfungerer som en sædcelle chemoattractant ^23-26. Faktisk har progesteron for nylig vist sig at udløse åbningen af Catsper kanaler i sædcellerne at indlede calcium signaler menes at ændre sæd flagellar bøje og dermed retningen af sædceller svømme ^27,28.

Den Zigmond kammer har både fordele og ulemper. En fordel er optisk enkelhed i, at sædceller bevares i et sæt fokusplan og ingen scanning af Z-dimension er nødvendig. En anden fordel er brugen af ​​kartesiske koordinater, der er mere kendt af de fleste efterforskere og tilskynde til afprøvning af nye parametre udtænkt med relativt almindelige matematik. På den anden side skaber Zigmond kammeret en situation, i modsætning til det, der findes i naturen. Sæden er lavet til at svømme mellem to vægge på tæt hold, som sandsynligvis påvirker deres repertoire af flagellar bølge former samt resultatet af resulterende kræfter. Ligeledes, den anvendte chemoattractant er normalt kemiskeog spredt anderledes end ville opstå fra et æg. Endelig sæd holde sig til vægge er et potentielt problem, der ikke ville være til stede i en tre-dimensionel kammer.

Mens nogle forskere peger på, at sæd tracking er den eneste pålidelige måde at studere sæd chemotaxis, kan disse assays være arbejdsintensive på både eksperimentelle og dataanalyse faser, hvis semi-manuelle snarere end automatiserede metoder. Af denne grund, beskrev assays ligesom de to-kammer-analysen her er blevet brugt til at give kvantitative og reproducerbare data, der kan fremlægge bevis for chemotaxis. Denne type af test opstod med Boyden kammer, hvor et neutrofiltal suspension blev placeret i kontakt med overfladen af et porøst filter barriere ^29. En chemoattractant løsning blev placeret i kontakt med den modsatte side af filteret tillader en kemisk gradient til at danne i selve filtret. Celler ind i filteret matrix kunne være enten farves og tælles microscopically eller, hvis mærket radioaktivt, tælles på en scintillation tæller. Denne strategi blev yderligere udviklet ved brug af store pore polycarbonat filtre, hvorigennem chemotaxing celler kan faktisk passere som i de to kamre analysen beskrevet her ^5.

Tidligere har vi valideret to-kammer-analysen som et mål for frø sædceller chemotaxis. Først ved hjælp af æg vand som lokkemidler, har vi vist, at stimulation af sædceller passage gennem filteret kræver, at en koncentrationsgradient blive skabt ved aflejring af en enkelt dråbe chemoattractant i den nederste kammer. Hvis chemoattractant er spredt ud over hele bunden kammeret buffer ved blanding, er sæd bevægelsen ikke stimuleres ^5. For det andet oprettelsen af ​​en "omvendt gradient" ved tilsætning af chemoattractant til toppen kammeret ikke stimulerer passagen af ​​sædceller. Endelig finder vi, at i sædceller spore eksperimenter i Zigmond kammer, sperm motilitet og hastighed erikke formindsket eller ændret, uanset hvilken retning af sæd rejse i forhold til gradient (Burnett, ikke offentliggjort observationer). Denne sidste observation er vigtigt, fordi det er blevet påpeget, at hæmmere af spermiemotilitet rent faktisk kan bremse eller stoppe sæden nær den kemiske kilden således fremlægge en kunstig ophobning af sædceller, der kunne forveksles som chemotaxis ^18.

Trods disse forbehold har sædceller ophobning assays såsom den to-kammer-analysen viste sig at være særdeles nyttige arbejdsbesparende redskaber, der har været medvirkende til at karakterisere neutrofile chemotaxis til bakteriel peptider ^29,30, i den indledende opdagelsen af pattedyr sædceller chemoattraction til follikulært væske og progesteron ^6,31,32, og i oprensning og karakterisering af frøen sædceller chemoattractant allurin ^4,5,33.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	BD Biosciences	35/1147
12 mm outer diameter inserts with 12 μm pore membrane	EMD Millipore	PIXP01250	We previously used Costar-Corning transwell plate #3403 -now discontinued
Zigmond chamber	Neuroprobe	Z02
Silicone oil	GE Healthcare	SF1154	Equivalent to Dow Corning 550 Fluid
Image J software	Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health	Free download at http://rsbweb.nih.gov/ij	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
MtrackJ software	Biomedical Imaging Group	Free download at http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/	Java program that runs on Windows, Linux and Mac
Virtual Dub software	GNU General Public Licensed	Free download via http://www.virtualdub.org/index.html	Setup instructions at the Image J website under plugins; for Windows only
cellSens software	Olympus Corporation	See website: http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070	Controls and acquires images from a variety of cameras. Also has image processing capability